ייצור של הלשון מטריצה חוץ-תאית, שיחזור של הלשון קרצינומה של תאים קשקשיים במבחנה

Summary

שיטה מוצגים כאן עבור הכנת הלשון מטריצה חוץ-תאית (TEM) עם decellularization יעיל. TEM יכול לשמש פיגומים פונקציונלי של הבנייה מחדש של מודל קרצינומה של תאים קשקשיים (TSCC) לשון בתנאים סטטי או מנוער תרבות.

Abstract

על מנת לבנות מודל אפקטיבית ומציאותית עבור הלשון קשקש קרצינומה (TSCC) במבחנה, השיטות נוצרו כדי לייצר decellularized הלשון מטריצה חוץ-תאית (TEM) אשר מספק פונקציונליות פיגומים בנייה TSCC. TEM מספק נישה במבחנה צמיחת תאים, בידול של נדידת תאים. מזערים של מטריצה חוץ-תאית מקורי (ECM) ויצירות ביוכימי בתוך המטריקס decellularized מספקים רקמות ספציפיות נישות עיגון תאים. הזיוף של TEM ניתן למימוש על ידי עיכול deoxyribonuclease (DNase) בליווי של רעלני אורגני או לא. פרוטוקול זה קלה לתפעול ומבטיחה יעילות גבוהה עבור decellularization. TEM הראה cytocompatibility חיובית עבור תאים TSCC בתנאים תרבות סטטי או מנוער, המאפשרת בניית המודל TSCC. ביוריאקטור מתוצרת עצמית שימש גם עבור התנאי מנוער מתמשך עבור תרבית תאים. TSCC שוחזר באמצעות TEM הראה את התכונות והמאפיינים הדומה histopathology TSCC קליני, מציעה את הפוטנציאל במחקר TSCC.

Introduction

הלשון יש תפקידים חשובים שונים, כגון deglutition, חיתוך, טעימות. לפיכך, ירידת ערך של פונקציה הלשון יש השפעה רבה על איכות החיים של המטופלים¹. הגידול השכיח ביותר בחלל הפה הוא לשון קרצינומה של תאים קשקשיים (TSCC), אשר מתרחשת בדרך כלל אצל אנשים לשתות אלכוהול או לעשן טבק².

בשנים האחרונות, הושגה התקדמות במחקר בסיסי על TSCC. היעדר מחקר יעיל במבחנה מודלים נשאר להיות אחת הבעיות הגדולות ביותר. לפיכך, מטריצות (ECM) הופך להיות פתרון אפשרי. מאז ה-ECM הוא מסגרת רשת מורכבת המורכב מטריקס מאורגן מאוד רכיבים, לגרדום חומרים שיש, מבנה דמוי ECM ו קומפוזיציה יהיה כשיר לחקר הסרטן. Decellularized ECM יכולה לספק באופן מושלם את הנישה התאים של אותו מקור במבחנה, אשר הופך להיות היתרון המשמעותי ביותר של ה-ECM.

ECM יכול להישמר עם מרכיבי התא הוסר מן הרקמות דרך decellularization באמצעות חומרי ניקוי ואנזימים. ECM רכיבים שונים, לרבות קולגן, fibronectin laminin במטריצת decellularized מספקים microenvironment דמויי רקמה מקורי של תאים בתרבית, לקדם את הישרדות, התפשטות, התמיינות של תאים³. יתר על כן, אפשר לצמצם את immunogenicity עבור השתלת ברמה מינימלית עם חסרונו של מרכיבי התא ב- ECM.

עד כה, נוסו שיטות ייצור עבור decellularized ECM ברקמות שונות ובאיברים, כגון הלב^4,5,6,7, כבד^{8,9,10 ,11}, ריאות^{12,13,14,15,16,17}ו-^18,כליות^{19 , 20}. עם זאת, אין מחקרים רלוונטיים להיות מצאו בעבודה דומה בלשון לפי מיטב הידע שלנו.

במחקר זה, לשון decellularized מטריצה חוץ-תאית (TEM) היה מפוברק בצורה יעילה וגם בזול על ידי סדרה של פיזי, כימי, טיפול אנזימטי. ואז TEM שימשה מסכם את הדברים TSCC במבחנה, מציג סימולציה המתאים TSCC התנהגות והתפתחות. TEM יש הביו טוב, כמו גם היכולת להנחות את התאים הגומחה רקמות ספציפיות, אשר מציין כי TEM יכול להיות פוטנציאל גדול TSCC מחקר³. בפרוטוקול שמוצג כאן מספקת מבחר של החוקרים ללמוד על פתוגנזה או טיפולים קליניים של TSCC.

Protocol

כל העבודה חיה המבוצעת על פי חוק רווחת בעלי חיים, המוסדיים הנחיות ואושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה, אוניברסיטת סון יאט סן.

1. הכנת TEM

1. מבצע עכברים באמצעות נקע בצוואר הרחם ולהסיר את הלשונות באמצעות פינצטה ומספריים כירורגי סטרילי.
2. לטבול את הלשונות 75% אתנול למשך 3 דקות, ולאחר מכן להכניס את הלשון כל mL 1.5 ראנבן (EP) שפופרת עם 1 מ"ל של 10 מ מ פוספט סטרילי buffered פתרון (PBS).
   הערה: הריכוז של PBS בכל השלבים הבאים הוא בדיוק כמו הריכוז בשלב זה.
3. תא פירוק על ידי הקפאה הפשרה: להקפיא את הלשונות צינורות EP ב-80 מעלות צלזיוס עבור 1 h ולאחר מכן להפשיר את הלשונות בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות 3 מחזורים.
4. לטעון את כל הלשון על חתיכת תפירה באמצעות מחט כירורגית, לעטוף את סוף התפר עם חתיכה קטנה של אלומיניום סטרילי. ביצוע הפעולה לצלחת תרבות 3.5 ס"מ או 6 ס מ המכיל 75% אתנול בתנאים סטריליים.
   הערה: אורך כל פיסת תפירה המתאים הוא כ-20 ס מ, הגודל המתאים של כל חתיכה של נייר כסף על 0.3 ס מ² (1 ס"מ × 0.3 ס מ). הלשון ייטען ליד זכרי.
5. יש לשטוף את הלשון כל 3 מ"ל של PBS סטרילי בקערה תרבות 3.5 ס"מ או 6 ס מ עבור 30 ס' בצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
6. לשטוף את הלשונות במים הנדסה גנטית: להוסיף ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של מים הנדסה גנטית סטרילי ריכוז סופי של 90 µg/mL. מכניסים את הלשונות הבקבוק המכילה בר מערבבים. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
   הערה: עד 5 הלשונות ניתן להכניס את הבקבוק אותו תמורת מטפסים משתרגים של התפר. נייר הכסף הוא בסוף התפר הבקבוק כדי למנוע החלקה את הלשון. הלשונות יוצבו 2 ס מ מתחתית הבקבוק על-ידי התאמת אורך התפר שנותרו בתוך הבקבוק. הערה זו היא גם שלבים 1.8, 1.10, 1.12, ו- 1.16.
7. לשים את הבקבוק פגים במשך 12 שעות.
8. לשטוף את הלשונות עם NaCl: להוסיף ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של 1 סטרילי M NaCl כדי ריכוז סופי של 90 µg/mL. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
9. לשים את הבקבוק פגים במשך 24 שעות ביממה.
10. תא פירוק על ידי טריטון X-100: להוסיף ampicilin ריכוז הסופי של 90 µg/mL לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של % 2 סטרילי טריטון X-100 ב- PBS. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
11. לשים את הבקבוק פגים במשך 48 שעות.
12. לשטוף את לשונות ב- /MgCl₂CaCl₂: הוספת ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של סטרילי 5 מ מ CaCl₂/MgCl₂ ריכוז סופי של 90 µg/mL. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
13. לשים את הבקבוק פגים במשך 24 שעות ביממה.
14. עיכול על ידי DNase: הוספת 1 מיליליטר של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) על כל שפופרת EP. להוסיף DNase לתוך HBSS בהתאמה לריכוז סופי של 300 מיקרומטר. להעביר את כל הלשון לתוך כל שפופרת EP, חלק התפר בחוץ. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
    הערה: ודא לחלק תפר אשר נשאר בתוך הבקבוקים השלבים הקודמים גם נשאר בתוך הצינור EP בשלב זה, וודא כי לחלק תפר אשר נשאר בחוץ הבקבוקים השלבים הקודמים גם נשאר בחוץ EP בשלב זה.
15. דגירה הלשונות צינורות EP ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
16. לשטוף את הלשונות עם PBS: להוסיף ampicilin לתוך בקבוק רחב-הפה עם 250 מ של PBS סטרילי ריכוז סופי של 90 µg/mL. להזיז את הלשונות ובר מערבבים לתוך הבקבוק. להדק את הפקק עם חלק התפר שנותרו מחוץ לבקבוק. לבצע פעולה זו בתנאים סטריליים.
17. לשים את הבקבוק פגים במשך 24 שעות ביממה.
18. אחסן את TEM מוכן סטרילי PBS ב 4 ° C עד השימוש.

2. תלת מימדי (3D) למפת TSCC

1. בניית מודל TSCC סטטי
   1. זרע 1.0 x 10⁶ TSCC תאים בודדים (Cal27) לתוך תבשיל תרבות 3.5 ס"מ. להוסיף 3 מיליליטר של Dulbecco ששינה בינוני/F12 (DF12) המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS) של נשר, ampicilin 90 µg/mL ו 90 kanamycin µg/mL.
   2. התרבות התאים Cal27 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. ודא כי התאים לכסות לפחות 60% שטח של תחתית צלחת.
   3. להעמיס TEM על טפט Cal27 בצלחת תרבות.
   4. מכניסים את המנה חממה₂ CO ב 37 מעלות צלזיוס במשך 28 ימים.
   5. רענן המדיום תרבות כל יום במהלך תהליך התרבות תאים. ריכוז₂ CO בחממה הוא 5%.
2. בניית מודל TSCC מנוער
   1. הכנת minibioreactor מנוער מתוצרת עצמית
      1. . תוציא את הבוכנה של מזרק 10 מ
      2. . תחפור בור (בקוטר של 1 ס מ) ליד הטרמינל התחתון של המוט וטען בר מערבבים לתוך החור.
      3. . תחפור בור (בקוטר של 0.5 ס מ) במרכז הפקק של בקבוק פלסטיק רחב-הפה, לשים את מוט בוכנה דרך הכובע.
      4. לחתוך חצי שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, הכול על הצד החיצוני של הפקק.
      5. לצרף עוד קרסים המוט על ידי ליפוף המוט עם חוטי דייג אשר קשורות של עוד קרסים.
         הערה: עד 4 עוד קרסים שניתן לחבר לו מוט-ברזל.
      6. אוטוקלב המתחם מתוצרת עצמית לפני השימוש.
         הערה: לעשות לא אוטוקלבים. הפה רחב בקבוק הפלסטיק. שימוש חדש סטרילי רחב-הפה בקבוק פלסטיק בעת culturing תאים.
3. תרבית תאים דינמי
   1. זרע 1.0 x 10⁶ Cal27 תאים בודדים ב- minibioreactor מתוצרת עצמית. להוסיף 150 מ ל בינונית DF12 אשר מכיל 10% FBS, ampicilin µg/mL 90 ו kanamycin 90 µg/mL.
   2. להעמיס TEM על minibioreactor באמצעות את עוד קרסים מחובר המוט.
   3. להדק את הפקק ולשים את minibioreactor על פגים. הפעל את minibioreactor ב 200 סל ד ב חממה₂ CO ב 37 מעלות צלזיוס למשך 7-14 ימים.
      הערה: ריכוז CO₂ בחממה₂ CO הוא 5%.

תוצאות

פרוטוקול זה עבור הכנת TEM מתברר להיות יעילים והולמים. TEM הראה decellularization מושלם לעומת רקמות בשפת. היעילות של decellularization אושר ע י hematoxylin-אאוזין (הוא) צביעת (איור 1א-ב). הוא מכתים את התוצאות חשף להיעלמותן של צביעת גרעינית ב- TEM (איור 1B

Discussion

פרוטוקול ומבוססת על ייצור ECM decellularized צריך לשמור את ההרכב ECM מקורית בעת הסרת רכיבים תאית ברקמות כמעט לחלוטין²¹. למרות decellularization כעת מדווחת פרוטוקולים אשר דורשים זלוף דרך להערכת להסיר חומרים הסלולר בתחבורה הולכת חום, עצבנות מכני אומצה, המכונה השיטה המסורתית פשוט וזול²²

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57-BL/6J mice	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-2.5L
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218
Potassium chloride	Sangon Biotech	A100395
Dibasic Sodium Phosphate	Guangzhou Chemical Reagent Factory	BE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic	Sangon Biotech	A501211
1.5 mL EP tube	Axygen	MCT-150-A
Ultra-low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	153066
6 cm cell culture dish	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	746495
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	449164
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Magnesium sulphate	Sangon Biotech	A601988
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
Surgical suture	Shanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottle	SHUNIU	1407
Magnetic stirrer	AS ONE	1-4602-32
CO2 incubator	SHEL LAB	SCO5A
10 mL syringe	Hunan Pingan
50 mL centrifuge tube	Greiner	227270
Cal27 cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Tongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Human osteosarcoma cell line
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Hepes free acid	BBI	A600264
FBS	Hyclone	SH30084.03
4 °C fridge	Haier
Water purifier	ELGA
Hemocytometer	BLAU	717805