חולדה מודל מרכזי עייפות בעזרת ששונה שיטת פלטפורמה מרובים

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להציג מודל עכברוש של מרכזי עייפות בעזרת שונה פלטפורמה מרובים שיטה (MMPM).

Abstract

במאמר זה הצגנו מודל עכברוש של מרכזי עייפות בעזרת שונה פלטפורמה מרובים שיטה (MMPM). תיבת מרובים פלטפורמה תוכנן כמו מיכל מים עם פלטפורמות צר על החלק התחתון. העכברושים דגם היו לשים לתוך הטנק, עמד על הבמות במשך 14 h (18:00-8:00) ליום 21 ימים רצופים, עם קבוצת בקרה הריק להגדיר עבור חדות. בסוף מידול, חולדות בקבוצה מודל הראתה ברור מראה עייף. כדי להעריך את הדגם, ביצענו מספר בדיקות התנהגותית, כולל במגרש הפתוח (למוד), לבחון את גבוהות פלוס מבוך (EPM) בדיקה של הבדיקה ממצה שחייה (ES). התוצאות הראו כי חרדה, ליקוי קוגניציה מרחבית, עניים שריר ביצועים ולאחר שנדחתה פעילות התנדבותית הציג בחולדות דגם לאשר את האבחנה של עייפות המרכזית. שינויים של המוליכות העצבית המרכזית גם לאמת את התוצאה. לסיכום, המודל בהצלחה מדומה עייפות המרכזית ולאחר מחקר עתידי עם המודל עשוי לעזור לחשוף את מנגנון פתולוגי של המחלה.

Introduction

עייפות היא אחד הגורמים העיקריים המאיימים על בריאות האדם¹. בעשרות השנים האחרונות, מחקרים שונים הוכיחו כי עייפות הוא המופעלות באופן עקיף אבל מונחה מרכזי, תמיד מלווה עם הפרעות רגשיות, קוגניטיביות. פיזיולוג איטלקי א Mosso הציע לראשונה את המילה עייפות מרכזית². זה מוגדר בדרך כלל מוגבל פעילות התנדבותית, קוגניציה ירידת ערך עקב תפקוד לקוי של הדחף התמסורת של מערכת העצבים המרכזית (CNS)³. לעומת עייפות שרירים היקפית, עייפות המרכזי מדגיש שינויי מערכת העצבים, כמו גם בהפרעות רגשיות/התנהגותיות הסוגר כולל דיכאון, חרדה, קוגניציה ליקוי של אובדן זיכרון. מחקר אחד מראה כי גורמים רבים יכול לגרום עייפות המרכזית, בין אילו פעילות פיזית מוגזמת, מתח נפשי הם די הכרחית⁴. באשר בפתוגנזה, תיאוריות כמו טריפטופן-kynurenine מסלול השערה⁵ מסבירות שינויי מסלולים מסוימים; עם זאת, מחקרים מעמיקים יותר נדרשים עדיין לחשוף את מתאמים המרכזי-ההיקפית של עייפות המרכזית.

כמו המנגנון הבסיסי של עייפות המרכזי הוא עדיין לא ברור, במודל חיה יעיל הוא די חשוב למחקר נוסף. הדגמים עייפות הקיימים הם בעיקר המושרה על ידי פעילות גופנית מוגזמת, כמו הליכונים⁶ ו שחייה שנטענו משקל⁷, עם חשש קטן על גורמים נפשיים. כדאי לדמות הפיתוח של מרכזי עייפות, הקבוצה שלנו פיתח מודל עכברוש עם MMPM. במהלך התהליך מידול, חולדות יישאר לעמוד על פלטפורמות צר בתיבת פלטפורמה מרובות במשך שעות ארוכות כולל חלק הזמן לישון. שונים של פעילות גופנית מוגזמת מודלים, המודל MMPM משתמש מניעת שינה חלקי כגורם נפשי תמורת זה מורכב בפתוגנזה של עייפות המרכזית.

מודל הערכה, אנו משתמשים הבדיקות OFT ו- EPM לקבוע חרדה רוח ואת פעילות התנדבותית. הבדיקה ES מבוצע כדי למדוד את ביצועי השרירים ההיקפיים. בנוסף, אנו לקחת את המוח של החולדה, לזהות דופמין (DA) / סרוטונין (5-HT) בתוכן שני hypothalamuses לבחון את ההבדלים נוירוטרנסמיטר מרכזי.

פרוטוקול שיובאו להלן נועד המודל המרכזי עייפות המושרה על ידי פעילות גופנית חוזרת ונשנית, חוסר שינה, מחקה מצב שכיח בחיי האדם. עם זאת, על-ידי התאמת משך מודל, זה יכול לשמש בתחומים רבים אחרים, כמו מחקרי תצפית ומתח שינה. בעתיד מחקר, אנו מקווים כי מודל זה יעזור לגלות עוד שינויים CNS וקשריהם עם מערכת היקפיים, כדי לחשוף את המנגנון הפתוגנזה של עייפות המרכזית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל החיות היו מתוחזק בהתאם להנחיות על ידי החקיקה הסינית על השימוש אתית, טיפול של חיות מעבדה.

1. מידול טרום הכנה

1. הכנת המעבדה
   1. הפעל את מנורת UV במשך לפחות 30 דקות לפני הניסוי.
   2. בקרת הטמפרטורה במעבדה ב 25 ± 3 מעלות צלזיוס, והלחות היחסית סביב 30%.
   3. להפעיל את המעבדה אור בשעה 6, תכבה את האור בשעה 18:00 להקים מעגל/כהה 12 h/12 שעות.
2. פלטפורמה מרובים תיבת בנייה
   1. לבנות מיכל פלסטיק אטום ללא כיסוי של 110 × 60 × 40 ס מ³.
   2. תקן 15 פלטפורמות מעגלית (h = 8 ס"מ, d = 6.5 ס מ) על החלק התחתון של הטנק, סניטר להפיץ שלוש שורות ועמודות חמש. להשאיר מספיק מקום בין כל פלטפורמה, בערך 10 ס מ בין טורים או 13 ס מ בין שורות.
   3. הגדר פורקן מים על הצד הלטראלי של הטנק, להתקין ברז.
   4. הופכים שער ברזל-חוט אחר תנועותיהם לטנק עם קופסת האוכל תלוי על זה.
3. קיבוץ וחולדות דיור
   הערה: חולדות זכרים Wistar של בן, 8 שבועות, במשקל של 200-210 g, משמשים את הניסוי. העכברושים חיים בקבוצות במהלך תהליך דוגמנות.
   1. מספר הזנב שורשים של החולדות עם עט מרקר.
   2. שוקל את החולדות לא לכלול את קלות או כבדות במיוחד, חלק את השאר באופן אקראי לקבוצות מודל ושליטה.
   3. לשים את החולדות בעדינות לתוך הכלובים נקי ולאפשר להם להסתגלות למעבדה לפחות 3 ימים. מספקים מספיק מים, אספקת המזון.

2. מידול עם MMPM

הערה: התהליך מתחיל בשעה 18:00 ומסתיים ב-8 בבוקר למחרת, עבור סכום כולל של 14 שעות ביום, במשך 21 ימים. כדי למנוע הפרעה גורמים, האדם נדרש לבצע את הניסוי כולו, כשאתה לובש אותו המעבדה. 10 חולדות Wistar משמשים את הניסוי.

1. מניחים את הטנק על משטח שטוח, למשל, על הרצפה. ואז למלא את המיכל בערך 7 ס מ של מים חמים (25 ± 3 ° C), כ- 1 ס מ מתחת פלטפורמת שטוח.
2. להכין מספיק אוכל ושתייה וכל העכברים למיכל עבור יום אחד. להכניס תיבת מזון למספוא ומים ולתלות אותו על השער.
   הערה: כמה עכברים חכם ללמוד על תיבת האוכל. אם כך, להסיע אותם בחזרה לתוך הטנק.
3. לקחת את החולדות קבוצה דגם הכלוב, לתפוס אותם על ידי הזנב, לשים אותם בעדינות לתוך הטנק. ההשקה כל העכברושים במים במקום פלטפורמות להמריץ את הפחד של מים. ודא כי כל עכבר מקבל פלטפורמה לעמוד עליה, בעוד חולדות של קבוצת הביקורת נשאר בכלובים המקורי שלהם עם מספיק אוכל ומים.
4. מכסה למיכל. נטר את החולדות כדי למנוע מהפציעה. אם עכבר נשאר במים למשך יותר משעה בלי לטפס על הפלטפורמה, תוציא את זה למיכל ולהסיר אותו מן הבחינה.
5. לאחר 14 h, לקחת את החולדות דגם מהמיכל, תייבשי את השיער שלהם עם מייבש. לסמן מחדש זנבות של החולדות אם זה נמוג. להחזיר את החולדות לכלובים המקורי שלהם ולספק להם מספיק אוכל ומים.
6. פלאש בכל פינה של הטנק. לרומם בצד אחד של הטנק, לפתוח את הברז כדי outflow את השפכים.
7. לחטא את המיכל עם 75% אתנול תרסיס, לחשוף אותם בפני האור האולטרה סגול.

3. דגם: התנהגותית מבדק

הערה: כל הבדיקות מבוצעות במעבדה התנהגותית. רעש, אור נוסף אסורה במהלך הבדיקה כדי למנוע הפרעה. במידת האפשר, השתמש את המשתמשים מקבלי אותו לערוך כל בדיקה. מעיל כהה וכפפות נדרשים עבור זיהוי סולם אפור בעיבוד תמונה. לבצע את OFT תחילה שכן יש לפחות. ההשפעה על ההתנהגות חולדה.

1. למוד
   1. בדוק את ההקלטה מעל תיבת שדה פתוח כדי לוודא זה מחובר כהלכה לתחנת העבודה ועוסק בכל פינה של התיבה. להתאים את התאורה לחסל צללים בתיבה.
   2. להעביר את החולדות למעבדה התנהגותית בכלובים המקורי שלהם. לאפשר להם להסתגלות במשך לפחות שעה לפני המבחן.
   3. לנקות, לנקות את התיבה עם 75% אתנול כדי להבטיח כי אין צואה או הריח נשאר מהניסוי הקודם.
   4. להסיר את חולדה מן הכלוב על ידי הגב והניחו אותה בעדינות לתוך האזור המרכזי של התיבה. במהירות נסיגה האצולה מהתיבה כדי לא לחסום את הזריקה.
   5. קלט המספר של החולדה, להתחיל בהקלטה. לספור ולהקליט את התדירות של פעילויות אנכי של החולדה, כולל גידול וטיפוס.
   6. לאחר 5 דקות, לעצור את ההקלטה, קח את החולדה מחוץ לקופסה, להחזיר אותו לכלוב.
   7. חזור על שלבים 3.1.3 - 3.1.6 עד כל העכברושים סיימו את המבחן.
2. EPM
   1. בצע את השלבים שלפני הסימון, להתאקלמות באשר OFT (שלבים 3.1.1 - 3.1.2).
   2. להסיר את חולדה מן הכלוב על ידי גבו ושם אותה בעדינות על החלק צומת של שתי זרועות. להנחית את החולדה לכיוון הזרוע השמאלית פתוח ולעזוב במהירות כדי לא לחסום את הזריקה.
   3. קלט המספר של החולדה, להתחיל בהקלטה. לספור ולהקליט את התדירות של הזרוע שונים כניסות. אם החולדה יוריד את המבוך במבחן, תרים אותו ולשלוח אותו למבוך. להקליט מידע מפורט עבור ניתוח נתונים.
   4. לאחר 5 דקות, לעצור את ההקלטה, קח את החולדה החוצה, להחזיר אותו לכלוב.
   5. הסר את הצואה, לנגב את המבוך עם 75% אתנול לחסל את הריח של חולדה לשעבר.
   6. חזור על שלבים 3.2.2 - 3.2.5 עד כל העכברושים סיימו את המבחן.
3. מבחן ES
   1. למלא את מיכל שחייה (70 × 30 × 110 ס מ³) עם 80 ס מ של מים חמים (25 ± 3 ° C).
      הערה: אם יש תרמוסטט במיכל, טמפרטורת המים להגדיר בסביבות 37 ° C, הדומה לטמפרטורת הגוף של החולדה. אם לא, לקבוע את טמפרטורת החדר לשמור את זה קבוע.
   2. להפוך מטען עבור כל עכברוש עם סיכת אשכולות ולקשור אותו בעדינות על שורש הזנב שלה. העומס שוקל 10% ממשקל של החולדה.
   3. תפוס חולדה בזנב ולזרוק אותו לתוך הטנק שחייה. אם החולדות מצטופפות או להיצמד לקיר, להבחין ביניהם ונהג אותם בחזרה למים.
   4. להתחיל תזמון כרגע כאשר העכברוש מכניסים מים ותזמון עצור כאשר הוא נחלש, אשר הוכח כמו הכשל להיאבק מחוץ למים עם הפה והאף מתחת למים במשך יותר מ 10 s.
      הערה: לפעמים, תשישות וטביעה מתרחש בפתאומיות. ודאו שיש לכם מספיק ניסויים כדי להקליט ולשמור את החיה בו זמנית.
   5. הסר את החולדות מותש מהמים מבלי להפריע לאחרים. תייבשי את השיער שלהם, לסמן מחדש את המספרים שלהם ולשלוח אותם חזרה לכלוב.
   6. להחליף את המים במיכל לאחר סיום קבוצה אחת. לאחר כל העכברושים נעשים, לרוקן למיכל שחייה, לנקות, לעקר אותה עם אתנול וביו -אור UV.

4. מודל ההערכה: נוירוטרנסמיטר מרכזי זיהוי

1. עזים ומתנגד העכברוש עם הזרקה הצפק התוך של 10% כלורין (3 מ"ל/ק"ג) עד שזה חסר הכרה.
2. לערוף את החולדה.
3. עושים חתך אורכי לאורך הקו שלאחר המדיאלי, לפתוח את הגולגולת לשני הצדדים, לחשוף את המוח. . תהפוך את הגולגולת, מסירים את המוח והניח את המוח על שקית קרח.
4. להפריד ולהסיר ההיפותלמוס, וזה האיזור בצורת מעוין בחלק המרכזי של הבסיס של המוח יש גבול ברור עם הרקמות הסובבות. למקם אותו צינור סטרילי ומקפיאים עם חנקן נוזלי. אחסן את כל הדגימות מקרר-80 ° C.
5. לזהות את התוכן של DA ו- 5-HT בהיפותלמוס באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC)⁸.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

נתאר מודל עכברוש של מרכזי עייפות בעזרת MMPM. 24 Wistar חולדות מחולקים באופן אקראי את קבוצת הביקורת וקבוצת מודל, עם 12 חולדות בכל קבוצה. המנגנון דגם מיועד מיכל מים עם פלטפורמות צר על החלק התחתון (איור 1). מודל חולדות לעמוד על הבמות במשך 14 שעות ליום, כולל זמן שינה חלקי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

MMPM מיועד במקור חסך שינה⁹. חולדות הן פצח מיכל מים עם פלטפורמות קבוע בתחתית. מונע על ידי הפחד האינסטינקטיבי של מים, חולדות יישאר לעמוד על הפלטפורמות, מתרחשת ללא שינה. המחקר מראה כי שעות שונות של חוסר שינה להוביל שינויים שונים עכברוש התנהגות ומצב רוח, כולל זיהוי לקות¹⁰,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
multiple platform sleep deprivation water tank	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company	license number SYXK (Beijing) 2016-0011	Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A , G1316A	G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector	Dutch ANTEC company		glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument	SONICS
ACS-ZEAS electronic scale	Phos technology development, Beijing.		The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD.		The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket.	Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China.		The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou,China.		Control water temperature
Small water pump	Xincheng technology co., LTD., chengdu,China.		Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software.	Nuldus,Netherlands		Measurement analysis of rat behavior videos.