הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנת מועשר בתאי המשמר stomatal שימושי עבור מחקרים ביולוגיים פיזיולוגיים ואחרים.

Abstract

המחקר של תאי המשמר חיוני הידע של תרומות ספציפיות מסוג זה תא לתפקוד הכללי של צמחים. עם זאת, לעתים קרובות קשה לבודד, וכך לומד אותם לעתים קרובות מספק אתגר.

מחקר זה יוצר שיטת העשרה תא המשמר stomatal. הפרוטוקול מנצל דבק בידוד תאי המשמר ולחלץ חלבונים מהתאים. שיטה זו משפרת את תקינות ואת התשואה של משמר תא במהלך בידוד ומספק מדגם אמין לחקר תהליכי איתות התא, איך הם תשבחות פנוטיפים התנועה stomatal. בשיטה זו, העלים צמח למחיצות בין שני חלקים של הקלטת, קלוף לחתיכות כדי להסיר את הצד abaxial. פרוטוקול זה הוחל על רקמת העלה תודרנית בידוד תאי המשמר. התאים טופלו עם fluorescein diacetate (FDA) כדי לקבוע את יכולת הקיום ועם חומצה אבציסית (ABA) כדי להעריך את הפיוניות התנועה בתגובה ABA. לסיכום, פרוטוקול זה מוכיח שימושי עבור הכנת תאי המשמר stomatal מועשר ובידוד חלבונים. איכות תאים וחלבונים מתקבל כאן אפשר פיזיולוגיים, מחקרים ביולוגיים אחרים.

Introduction

הפיוניות יש תפקיד חשוב ב פיזיולוגיה והכושר הכללי של צמחים. מבנים ספציפיים אלה צמח זעיר נוצרות על ידי שני תאים באפידרמיס מיוחדים המכונה תאי המשמר, מצויים בשפע ביותר על פני השטח abaxial של עלים. הפיוניות נחוצים לצורך עסקת חילופי גזים בין הצמח, האווירה, כמו גם השליטה של אובדן מים באמצעות דיות. תאי המשמר לווסת את הפיוניות צמצם באמצעות שילוב בין חיצוניים שונים (למשל, אור, לחות, קשר הפתוגן, רמות פחמן דו-חמצני) ופנימיים (למשל., הורמונים אנדוגניים) גירויים^1,2. ב-20 השנים האחרונות, סוג התא הזה הפך מערכת מודל עבור תא לומד איתות תהליכים במפעלים. תאים אלה מהווים חלק קטן של התאים הכולל עלה; לפיכך, לחקור שלהם סלולרי ייחודי, מאפייני הביוכימי והמולקולרי בצורה מתא בודד, יש צורך לבודד אותם מכל סוגי תאים אחרים עלה. בעבר, מחקרים משמר תא יש לעיתים קרובות מעורבים הכנת משמר תא protoplasts (GCP)^3,4,5. זה בדרך כלל דורשת השימוש בכמויות גדולות של דופן התא משפילים אנזימים ו/או שיבושים מכניים באמצעות מיזוג, הוכיחה להיות יקר וארוך כמו בדרך כלל זה לוקח שעות רבות כדי להכין מדגם GCP, לעתים קרובות פעמים עם תשואה קטנה. וחשוב מכך, כי תאי המשמר לשמש מלאה זוגות כדי לווסת את הפיוניות הצמצם, ניתן לראות את השימוש GCP כמערכת מלאכותי ללמוד איתות התא משמר.

. הנה, פיתחנו שיטה להכין הפיוניות בו תאי המשמר שלם מועשרים, לשמור על תגובות פיזיולוגיות לגירויים. שיטה זו בהשראת שיטה שבה השתמשת כדי לבודד mesophyll תא protoplasts^6,7. בשיטה שלנו, הפיוניות מוכנות תוך שימוש ברור דבק להפריד תחילה את רוב התאים mesophyll מחובר השכבה adaxial של העלה מהשכבה abaxial המכילות את המדרכה ואת משמר תאים. פעולה זו מתבצעת על ידי הדבקות נייר-דבק לשני הצדדים של העלה פילינג אותם בנפרד. התאים מהשכבה abaxial מותר לשחזר תחת אור במאגר פתיחת הפיוניות. מאוחר יותר תאים המדרכה מוסרות באמצעות כמות קטנה של דופן התא משפילים אנזימים, משאיר מאחורי תא משמר כי הם מועשרים בקלטת.

בשיטה זו פשוטה, התאים משמר stomatal כי הן קיימא מגיב יכולים במהירות, ביעילות תהיה מוכן, לוקח פחות משעה להשיג מועשר בתאי המשמר stomatal מקליפות 50 בעלות מינימלית. השיטה כאן מטיל פחות נזק לתאי הצמח מאשר שיטות קודמות איפה protoplasts מוכנים. בנוסף, החומרים נאספו מ כמויות חלבון רצויה זו שיטת התשואה. והכי חשוב, כי העלה שלא עובר מיזוג או עיכול ממושך פעמים ותאים משמר נותרו ללא פגע, תוצאות ללמודי הדוק יותר יהיו רלוונטיים לזה של הביולוגיה של התא משמר טבעי. בשיטה זו, תנועות stomatal ישויך בזמן אמת עם שינויים ברמה המולקולרית. לפיכך, הידע שנרכש ממחקרים בשיטה זו הכנה יהיה חשוב להבנה מקיפה יותר של איתות התא משמר.

השתמשנו הצמח תודרנית לבנה כמודל; אולם פרוטוקול זה ניתן ליישם את העשרת של stomatal תאי המשמר מינים אחרים כגון כרוב napus עם שינויים קטנים בזמן העיכול. מהווה הוכחה של המושג, הראו כי תאי המשמר stomatal מועשר באמצעות שיטה זו הם קיימא מגיב לגירויים כפי שמוצג על ידי fluorescein diacetate (FDA) assay לימודי ניצול של חומצה אבציסית הורמון צמחי (ABA), בהתאמה. בנוסף, הראו כי חלבונים באיכות גבוהה יכול להיות מבודד תאים אלה משמר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט של תהליך זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. גידול צמחים

1. לנבוט הגרעינים תערובת השתילה. לגדל צמחים בתוך תא הצמיחה של עוצמת האור של 140 µmol פוטונים מ'⁻² s ^{− 1} , של photoperiod של 8 שעות אור באורך 22 ° C ו- 16 h כהה ב 18 ° C 2 שבועות
2. השתלת שתילים בגדלים דומים באופן אינדיבידואלי לתוך 4 סירים קוטר המכיל את האדמה ולגדול במשך 3 שבועות באותם התנאים נוספים שמתואר בשלב 1.1.
   הערה: מים צמחים עם ברז מים פעמיים בשבוע כדי לשמור על לחות הקרקע.

2. הכנת הפיוניות מועשר

1. להסיר את העלים של צמחי לבנה א 5 - בן שבועיים בודדים עם אזמל.
2. לצרף כל עלה שתי חתיכות של דבק ברורה, עם חתיכה אחת הקפדה על הצד (נמוך יותר) abaxial, החלק השני הקפדה על adaxial (עליון) בצד של העלה. עזוב את הקלטת על העלה עבור 5 s.
3. עדין קליפת בנפרד שתי חתיכות של קלטות בעזרת האגודל והאצבע על כל יד כדי להפריד בין הצד abaxial עם המדרכה, משמר תאים, הצד adaxial עם תאים mesophyll.
4. המקום קליפות מהצד abaxial של העלים ב 60 מ של הפיוניות פתיחת מאגר (50 מ"מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MES-KOH, מותאם pH 6.2 עם 1 מ' KOH) בגודל 40 מ מ × 12 מ מ פטרי מנות כפי שהם שנאספו.
   1. חזור על השלבים שלעיל עד כל מדגם קליפות נאספים.
5. מקם את פטרי המכילות את קליפות אל החדר גדילה בתנאים אור הצהיר בשלב 1.1. להשאיר את קליפות תחת אור כבר שעתיים לחלוטין פתוח הפיוניות.
6. המקום קליפות לתוך 150 מ מ x 20 מ מ פטרי המכילות 50 מ של דופן התא לעכל תערובת אנזימים (0.7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, פוליוינילפירולידון 0.1% (w/v)-40 ו- 0.25% (w/v) שור אלבומין ב- 55% כתמיסה (0.55 מ' בסורביטול, 0.5 מ מ CaCl₂, 0.5 מ מ MgCl₂, חומצה אסקורבית 0.5 מ מ, 10 מיקרומטר ח'₂PO₄, 5 מ מ 4-morpholineethanesulfonic חומצה (MES) ב- pH 5.7 מותאם עם 1 מ' קו).
7. לנער את קליפות על מטרף הדדיים בצלחת פטרי ב-50 סל ד כעשרים דקות.
8. להסיר קליפות של אנזים פתרון עם פינצטה לאחר 20 דקות להעביר את קליפות 150 מ"מ x 20 מ"מ גודל פטרי המכילות 50 מ ל מים.
9. באמצעות פיפטה העברה, לשטוף קליפות 15 s פעמיים עם 10 מ"ל של מים כדי להסיר כל פתרון אנזים שיורית.
10. השתמש פינצטה כדי למקם את קליפות בצלחת פטרי בגודל 150 מ מ x 20 מ מ עם 50 מ של הפיוניות טריים פתיחת מאגר משמש בשלב 2.4. תקופת דגירה של h 1 בתנאי אור הצהיר בשלב 1.1 כדי לאפשר הפיוניות להתאושש.

3. חומצה אבציסית (ABA) טיפול ואת וזמינותו תנועה הפיוניות

1. בצלחת פטרי בגודל 150 מ מ x 20 מ מ. דגירה של קליפות הפיוניות מועשר ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב 50 מ של המאגר הפתיחה stomatal או ב- 50 מ של המאגר הפתיחה stomatal עם ריכוז סופי של 10 מיקרומטר ABA הפעם הטיפול המתאים.
2. במקום קליפות על מטרף ב-50 סל ד 5, 15, 30 דקות. לאחר כל מרווח הזמן להסיר את קליפת עם פינצטה, בצע את השלבים הדמיה בשלב 3.3.
3. קח תמונות של הפיוניות לפני טיפול ABA, בנקודות זמן שונות לאחר טיפול ABA עם מיקרוסקופ אור.
   1. . קח את קליפת והנח אותו על משטח זכוכית מיקרוסקופ.
   2. למקם את השקופית על הבמה מיקרוסקופ ולהתאים את הבמה כך ניתן לאבחן את התמונה של קליפת.
   3. התאם את הקנס, כמובן המוקד על המיקרוסקופ כדי לקבל תמונה ברורה של תאי המשמר.
   4. לקחת כמה תמונות של הפיוניות מרובים בהגדלה X 40.
4. למדוד 60 פתחים stomatal משתמש ImageJ⁸.
5. לחשב את שגיאת התקן והמשמעות -ערך-p < 0.05 את המידות צמצם stomatal 60.

4. חלבון החילוץ והפרדה מרחביות-דף

1. לטחון את קליפות 15 s בחנקן נוזלי מספיק כדי לכסות את קליפות באמצעות ומכתש צוננת.
2. לכל 50 קליפות, להוסיף 3 מ"ל של טריס רווי פנול (pH 8.8) 3 גרם חלבון החילוץ חיץ (0.9 M סוכרוז, 0.1 M טריס-HCl, 0.01 M EDTA, 0.4% מרקפטואתנול, 10 µL של מעכב פרוטאז, פוספטאז 1 מ"מ) עם פיפטה כדי המליטה ואז לטחון את קליפות של אילן גרינברג 5 דקות אינפורמטיבית בשכונה fume.
3. להעביר את תמצית באמצעות פיפטה ואת קליפות באמצעות פינצטה מתכת כדי Oakridge צנטריפוגה tube להתסיס על מטרף ב-50 סל ד עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
4. הסר את קליפות מהצינור צנטריפוגה Oakridge, centrifuge את התמצית ב g 5,000 x למשך 10 דקות. לאחר מכן העברה בעל תאים פנוליים השלב העליון צינור נקי מיקרו-צנטריפוגה באמצעות פיפטה.
5. התמיסה פנול חילצה חלבונים על-ידי הוספת 5 כרכים של קרח אצטט אמוניום 0.1 M ב- 100% מתנול. מערבולת בקצרה דגירה בין לילה ב-20 ° C.
6. צנטריפוגה ב 20,000 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, decant את תגובת שיקוע על ידי לאט נשפכים זה הצינור ולשמר בגדר חלבון בצינור.
7. לשטוף בגדר חלבון פעמיים עם 0.1 M אמוניום אצטט, מתנול, ולאחר מכן פעמיים עם אצטון 80% ופעם אחת עם אצטון 100% קר.
   הערה: מנקי נעשים על-ידי הוספת 10 מ"ל של ריאגנט מסוים הצינור של חלבון. להתסיס על מטרף ב-50 סל ד במשך 5 דקות, ואחריו צנטריפוגה ב g x 15,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז שופכים הכימית יצאה מהשפופרת שמירה רק בגדר חלבון.
8. להוסיף 1 מ"ל של אצטון 100% קר בגדר והשהה מחדש על ידי לאט pipetting למעלה ולמטה.
9. להעביר ההשעיה חלבון באמצעות פיפטה שפופרת מיקרו-צנטרפוגה 2 mL ואז צנטריפוגה ב 20,000 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
10. להסיר אצטון על-ידי decanting זה מהצינור ויבש בגדר בשכונה fume למשך 10 דקות.
11. להמיס החלבון של שפופרת מיקרו-צנטרפוגה עם µL 200 התפרקות מאגר (אוריאה 8 מ', 0.5% מרחביות, 30 מ מ טריס-HCl ב- pH 8.5) ו מערבולת במשך 30 דקות צנטריפוגה ב 20,000 g x-15 מעלות במשך 20 דקות ולאסוף תגובת שיקוע צינור חדש.
12. לכמת את ריכוז חלבון בעקבות פרוטוקול כימות⁹חלבון.
13. השתמש דגימות חלבון הפרדת חלבונים על ידי אלקטרופורזה בג'ל בעקבות פרוטוקול ה-¹⁰.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תמונת הנציגה של תודרנית לשמור תאים לפני ואחרי עיכול של mesophyll, תאים אפידרמיס מוצג באיור1. תא משמר הכדאיות לפני ואחרי הסרת mesophyll, תאים אפידרמיס ניתן לצפות באמצעות ה-FDA כדי למדוד פעילות אנזימטי ותקינות קרום התא (איור 1B וד' 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

משמר תאים הם מערכת מודל לימוד האות מנגנוני התמרה חושית בצמחים וזה חשוב לוודא כי הכנת דוגמאות השתמשו במחקר הוא המתאים ביותר כדי לענות על שאלות ביולוגיות. למרות העניין הגובר והולך משמר תאים בתוך קהילת המחקר צמח, יש אין שיטה אוניברסלית באיך להכין stomatal תאי המשמר שיאפשר תנועה stomatal והן פיזיולוג...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stainless Steel Surgical Scalpel	Feather	NC9999403
Scotch Tape (3M)	ULINE	S-9781
Petri Dish	Sigma-Aldrich	BR455701
Cellulase (Onozuka R-10)	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	21560003-3
Macerozyme R-10	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	21560003-4
DM6000B Microscope	Leica Microsystems
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails	Thermo Fisher Scientific	PI78443
Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	3119-0030
EZQ Protein Quantitation Kit	Thermo Fisher Scientific	R33200
Fluorescein Diacetate (FDA)	Thermo Fisher Scientific	F1303
Abscisic Acid	Sigma-Aldrich	A4906
Metro Mix 500	BWI Companies	TX-500
Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	161-0737
Bio-Safe Comassie (G-250)	Bio-Rad	161-0786
Microcentrifuge Tube (2mL)	USA Scientific, Inc.	1620-2700
ImageJ software	National Institute of Health
Tweezers	Sigma-Aldrich	F4017-1EA
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	456-1043
Microscope slides	Fisherbrand	12-550-A3