JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לפקח spectrophotometrically טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors לנתח אנזימטי אינטראקציות העלולות להתעורר עם אלה acceptors אלקטרון חוץ-תאית.

Abstract

טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה (tPMET) ממלא תפקיד הגנה על תאים מלחץ חותכות תאיים, כמו גם הגנה מפני נזק על ידי חמצון חוץ-תאית. תהליך זה של העברת אלקטרונים תאיים reductants כדי חמצון חוץ-תאית אינה מוגדרת היטב. כאן אנו מציגים מבחני spectrophotometric על ידי C2C12 myotubes לעקוב אחר tPMET ניצול acceptors את האלקטרונים חוץ-תאית: tetrazolium מסיסים במים מלח-1 (WST-1) ו- 2, 6-דיכלורופנול אינדופנול (DPIP או DCIP). באמצעות הפחתה של acceptors אלקטרונים אלה, אנו מסוגלים לעקוב אחר התהליך בניתוח בזמן אמת. עם התוספת של אנזימים כגון ascorbate אוקסידאז (AO), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) מבחני, אנחנו ניתן לקבוע איזה חלק של tPMET עקב ייצור ייצוא או סופראוקסיד ascorbate, בהתאמה. בעוד WST-1 הוצגה כדי להפיק תוצאות יציב עם רקע נמוך, DPIP היה יכול להיות מחומצן מחדש לאחר התוספת של אאו, עשב, אשר הודגם עם ניתוח spectrophotometric. שיטה זו ממחישה assay spectrophotometric בזמן אמת, רב טוב, מהיר, עם יתרונות על פני שיטות אחרות ששימשו לעקוב אחר tPMET, כגון ferricyanide (FeCN) וצמצום c ferricytochrome.

Introduction

היכולת של ממברנות פלזמה מטוהרים להפחית אלקטרון acceptors הוביל התצוגה כי קרום פלזמה יש קיבולת של חמצון-חיזור הגלום1. ראיתי בעבר פטריות, צמחים, בעלי חיים, tPMET הוא תהליך משותף ל4,3,2,אורגניזמים מספר5. באופן ספציפי, תהליך זה הוכח שמר האפייה, בתאים הגזר, אריתרוציטים, לימפוציטים, אוסטאוסרקומה, מלנומה, מקרופאגים, שרירי השלד ו נויטרופילים2,3, 4 , 5 , 6 , 7. בתהליך כי המשלוחים אלקטרונים על פני קרום פלזמה כדי להפחית את חמצון חוץ-תאית, tPMET מעורב תאיים רבים, לרבות: תא-צמיחה-5,-8, תא הכדאיות9, ברזל חילוף החומרים10, התא איתות11,12,13, והגנה מפני14,12,מינים חמצן תגובתי15. בשל מעורבותו של tPMET תאיים רבים, חוסר איזון של tPMET יש כבר המשוערות לתרום להתפתחות של כמה מצבים בריאותיים חמורים, כולל סרטן16, מחלות לב וכלי דם17, וחילוף תסמונת18.

יש דרכים רבות כדי לפקח על העברת אלקטרונים על פני קרום פלזמה, אך הטכניקה הנפוצה ביותר היא להעריך את ההפחתה של אלקטרון חוץ-תאית acceptors באמצעות מבחני ערכי צבע מוחלטים. Acceptors אלקטרון חוץ-תאית נפוצים הם מלחי tetrazolium, DPIP, FeCN c19,ferricytochrome20. המלח tetrazolium הנפוץ ביותר הוא ידוע מלח הדור השני WST-119. תרכובת זו קל לנצל מבחני ערכי צבע מוחלטים לעומת הדור הראשון מלחי tetrazolium עקב שתי קבוצות סולפונאט, אשר מגבירים את מסיסות המים21. WST-1, בשילוב עם methosulfate 1-מתוקסי-phenazine מקבל אלקטרון ביניים (mPMS), מצטמצם העברת אלקטרונים יחיד שני אירועים. הפחתה זו משתנה מחמצנים את חלש בצבע של WST-1 ל-20,formazan יותר אינטנסיבי, צהוב22. WST-1 יש מקדם גבוה הכחדה טוחנת של 37 x 103 מ-1ס מ-1, שמוביל וזמינותו גבוהים רגישות21,22. DPIP הוא מנוצל גם כמאשר אלקטרון חוץ-תאית לעקוב אחר tPMET. הוכח, כי DPIP יכול להיות מופחת extracellularly על ידי tPMET בלי הסיוע של אלקטרון ביניים acceptors23,24. עקב חוסר acceptors אלקטרון ביניים, DPIP יכול ישירות איסוף אלקטרונים של קרום פלזמה, בניגוד WST-124. בדומה DPIP, FeCN הוכח להיות מופחת extracellularly כדי ferrocyanide על ידי tPMET בלי הסיוע של אלקטרון ביניים acceptors19,24. בניגוד WST-1 ו- DPIP, FeCN יש מקדם נמוך הכחדה טוחנת המוביל אל רגישות וזמינותו נמוכה9. מקבל אלקטרון חוץ-תאית נפוץ אחר לעקוב אחר tPMET הוא ferricytochrome ג בדומה WST-1, ferricytochrome מגביר הפחתת c עם השימוש של מקבל אלקטרון ביניים, mPMS22. אבל בניגוד WST-1 בשיטת c ferricytochrome הוא פחות רגיש בשל רקע גבוה ואת מקדם נמוך הכחדה טוחנת22.

כאן אנו מציגים שיטה לניתוח בזמן אמת של tPMET באמצעות מבחני spectrophotometric. השיטה ניצלה את acceptors חוץ-תאית אלקטרון WST-1 ו- DPIP, כפי לשניהם יש מקדם גבוה הכחדה טוחנת בזמן להיות פחות יקר בהשוואה למטבע האחר נפוץ בשימוש acceptors חוץ-תאית אלקטרונים כגון ferricytochrome c. אנחנו מנוצל phenazine methosulfate (PMS) במקום mPMS יש להם האיפור כימי דומה ו PMS הוא הרבה פחות יקר. mPMS הוא יציב photochemically שהוא מאפיין חשוב עבור ערכת מסחרי צריך חיי מדף ארוכים. עם זאת, אנו עושים PMS טריים עבור כל assay, כך יציבות לא צריך להיות בעיה. אנו מציגים גם שיטה להערכת אנזימטי האינטראקציות האפשריות (ראה איור 1) בין אלקטרון חוץ-תאית מקבל אנזימים היכולה לשמש לאפיין עוד יותר את התהליך של tPMET. באופן ספציפי, אנזימים AO ו- SOD יכול לשמש לקבוע איזה חלק של tPMET הוא ascorbate תחבורה או שחרור סופראוקסיד חוץ-תאית, שתי שיטות נפוצות האלקטרונים להיות מועבר על-פני קרום פלזמה.

Protocol

הערה: ראה איור 1 סקירה סכמטי של השלבים החשובים.

1. WST-1 צמצום Assay

  1. לגדול, להבדיל C2C12 תאים חסיד באמצעות תא סטנדרטי לתרבות הליכים7 בצלחת 96-ובכן ניצול שורות A-F.
    1. השתמש מדיום בידול בהיקף בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 2% הסוס סרום, פניצילין U/mL 100 ו- 0.1 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.
    2. בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, תוספת בידול מדיה בחומצה אסקורבית 100 מיקרומטר. לאפשר לתאים דגירה בתקשורת בידול עבור ~ 24-48 שעות.
  2. להכין מלאי פתרונות WST-1 ו- PMS.
    1. כדי להפוך את מלאי 10 מ מ של WST-1, להמיס 0.033 גר' WST-1 (הנוסחה משקל (FW): g 651.34/mol) ב 5 מ של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS). חנות ב 4 º C.
    2. כדי להפוך את מלאי 5 מ מ של PMS, להמיס 0.0023 גר' PMS (FW: g 306.34/mol) ב- 1.5 מ"ל של יונים H2O (לשכפל2O). לאחסן ב-20 ° C, להגן מפני אור.
  3. להוסיף 0.0108 גר' גלוקוזה עבור ריכוז הסופי של 5 מ מ ל 11.4 של PBS או HEPES buffered תמיסת מלח (HBS; 20 מ מ HEPES נתרן מלח, 140 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2.5 מ מ MgSO4, 1 מ"מ CaCl2). הוסף µL 480 10 מ מ WST-1 עבור ריכוז סופי של מיקרומטר 400 ו- 48 µL של 5 מ מ PMS עבור ריכוז סופי של 20 מיקרומטר.
  4. בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. Aliquot אחד, להוסיף 6 µL של לשכפל2O ולחצו aliquot אחרים להוסיף 6 µL של 2 kU/mL אאו עבור ריכוז סופי של 2 U/mL.
  5. בעת פיקוח על מעורבות סופראוקסיד tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. כדי aliquot אחד, להוסיף µL 55 0.1 M KPO4 מאגר ולהוסיף את aliquot אחרים µL 55 של 6.5 kU/mL SOD עבור ריכוז סופי של 60 U/mL.
  6. לשטוף את התאים עם PBS. האחות התקשורת ולהוסיף 150 µL PBS. ואז מחוק לגמרי מגניב.
    הערה: הבדיקה מתבצעת באמצעות תאים מצופים, מצורף. לפיכך, אין שום צנטריפוגה או השימוש של טריפסין בתהליך הכביסה.
  7. להוסיף 100 µL של פתרון WST-1 (-) השתילות או (-) אאו לעמודות 1-6 ולהוסיף 100 µL של פתרון WST-1 (+) השתילות או (+) או על עמודות 7-12 בצלחת 96-ובכן. השתמש שורות G ו- H כפקדי רקע (קרי, לעקוב אחר שינוי בספיגת ב הכימית לבד בבארות ללא תאים).
  8. למדוד את הערכים ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטרים את כל 10 דקות לשעה-438 ננומטר.
  9. אחרי הקריאה, תשאף בתקשורת ושוטפים כל טוב עם µL 150 ל- PBS. ואז מחוק לגמרי מגניב.
  10. לחשב את השינוי שחל ספיגת במשך כל על-ידי חיסור את ספיגת הראשוני עבור באר מ ספיגת בכל נקודת זמן על כך. תקן שינוי זה עבור שינוי ספיגת (אם בכלל) שנצפתה הבארות רקע (קרי, וולס עם פתרון assay אך לא תאים).
  11. לניתוח, לנרמל את הנתונים ספיגת למדידה שליטה 60 דקות או לשטוף וולס עם PBS או HBS ולאחר מכן לבצע bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון וזמינותו.
  12. להוסיף 2 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA) תקן (נע בין 0.5-2 µL על העקומה רגיל, תלוי בדרגת זרימה של התאים) לבארות ריקות (שורות G ו- H), לאחר מכן להוסיף הכימית BCA כל בארות.
  13. לכמת את הנתונים באמצעות nmol של הפחתת WST-1 לכל µg של חלבון. שימוש 37 מ מ-1 ס מ-1 22 המקדם הכחדה עבור מופחתת WST-1-438 ננומטר.

2. DPIP הפחתת Assay

  1. לגדול, להבדיל C2C12 תאים חסיד עם ההליך אותו כשלב 1.1.
  2. להכין מלאי 10 מ מ DPIP פתרון כדלקמן. להמיס 0.029 גר' DPIP (FW: g 290.08/mol) ב- 10 מ"ל של לשכפל2O. אשר הריכוז של DPIP על ידי מדידת ספיגת על 600 nm עם ספקטרופוטומטרים. שימוש 1 מ-1 ס מ-1 23 המקדם הכחדה עבור DPIP מופחת ב 600 ננומטר. חנות ב 4 º C.
  3. להוסיף 0.0108 גר' גלוקוז 11.880 מ של PBS עבור ריכוז הסופי של 5 מ מ. להוסיף 120 µL 10 מ מ DPIP עבור ריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
  4. בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. Aliquot אחד, להוסיף 6 µL של לשכפל2O ולחצו aliquot אחרים להוסיף 6 µL של 2 kU/mL אאו עבור ריכוז סופי של 2 U/mL.
  5. בעת פיקוח על מעורבות סופראוקסיד tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. כדי aliquot אחד, להוסיף µL 55 0.1 M KPO4 מאגר ולהוסיף את aliquot אחרים µL 55 של 6.5 kU/mL SOD עבור ריכוז סופי של 60 U/mL.
  6. האחות התקשורת ולשטוף בתאים µL 150 ל- PBS. האחות של PBS ולהוסיף µL 100 DPIP פתרון (-) השתילות או (-) אאו לעמודות 1-6 ולהוסיף 100 µL DPIP פתרון (+) השתילות או (+) או על עמודות 7-12 בצלחת 96-ובכן. השתמש שורות G ו- H וויל כפקדי רקע (קרי, לעקוב אחר שינוי בספיגת ב הכימית לבד בבארות ללא תאים).
  7. למדוד את ספיגת ב 600 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים כל 10 דקות עבור ה 1 לכמת את השינוי שחל ספיגת ביחס הפקד בחלק הדומה צעדים 1.9-1.13 60 דקות.

3. קביעת האלקטרון מופחת Acceptors סובסטרטים אאו או עשב

  1. 5.436 מ של PBS או HBS, להוסיף 240 µL 10 מ מ WST-1 עבור ריכוז סופי של מיקרומטר 400 ו- µL 24 של 5 מ מ PMS עבור ריכוז סופי של 20 מיקרומטר.
    1. עבור DPIP, להוסיף µL 60 10 מ מ DPIP, עבור ריכוז סופי של 100 מיקרומטר, 5.940 מ של PBS או HBS.
  2. להוסיף 100 µL של פתרון אחד טוב בצלחת 96-ובכן שטוח התחתונה בהיעדרו של תאים ולמדוד את ספיגת בספקטרופוטומטר-438 nm, עבור WST-1, או 600 nm, עבור DPIP.
  3. להוסיף חצי מן הבארות עבור ריכוז סופי של 100 μM µL 1 של 10 מ מ ascorbate. נטר את ספיגת עד זה מייצבת.
  4. על ייצוב, להוסיף 1 µL של 200 U/mL אאו עבור ריכוז סופי של 2 U/mL מכל קידוח או להוסיף 1 µL של קו 6/השתילות mL עבור ריכוז סופי של U/mL 60 לכל טוב ולנטר את ספיגת לשעה.

תוצאות

סטטיסטיקה בוצעו עם ANOVA באמצעים חוזרות באמצעות תוכנה סטטיסטית RStudio25. גודל מדגם הם הצביעו על האגדות איור.

כדי לפקח על tPMET, C2C12 myotubes נוצלו יחד עם acceptors אלקטרון חוץ-תאית, WST-1 ו- DPIP. אאו שימש כדי לקבוע איזה חלק של WST-1 ו DPIP הפחתת נבע ascorbate ...

Discussion

הוצגו שתי שיטות ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors, WST-1 ו- DPIP, במבחני spectrophotometric לעקוב אחר tPMET, C2C12 myotubes. עם הצמיחה של שורות תאים בהליכים תרבות רגיל, קורא צלחת ספקטרופוטומטרים, אפשרי לעקוב אחר tPMET עם אלה acceptors אלקטרונים ב וזמינותו microplate פשוט. צמצום WST-1 הוא לשחזור מכל טוב-כדי-טוב בתוך וזמינותו, אבל יש הש?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות תומס בל, לין Mattathil, מארק Mannino, Neej פאטל לתמיכה טכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות הציבור של ארצות הברית פרס R15DK102122 במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה (NIDDK) ג'ונתן פישר. תוכן כתב היד הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נופי הרשמי של NIDDK או מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
C2C12 myoblastsAmerican Type Culture Collection CRL-1772
Dulbecco's modified eagle's medium - low glucoseSigmaD6046
Fetal Plex animal serum complexGemini Bio-Products 100-602
penicillin-streptomycinSigma516106
horse serumGibco Technologies16050-130
Dulbecco's phosphate buffered salineSigmaD8537
trypsin-EDTASigmaT4049
15 cm culture dishesTPP93150
96 well culture platesTPP92096
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
phenazine methosulfate SigmaP9625
L-ascorbic acidSigmaA5960
ascorbate oxidase SigmaA0157
superoxide dismutase SigmaS5395
2,6-dichloroindophenol sodium salt ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucoseSigmaG7528
HEPES sodium saltSigmaH3784
sodium chlorideSigmaS7653
potassium chlorideFisher Scientific BP366
magnesium sulfate heptahydrateSigmaM5921
calcium chloride dihydrateSigmaC7902
potassium phosphateFisher Scientific BP363
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I spectrophotometerBiotek Insturmentsdiscontinued 
Spectronic Genesys 5 SpectrophotometerThermo Scientific336001
PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterileMidSci781602
Iron (II) chloride tetrahydrateSigma220299
Iron (II) sulfate heptahydrateSigma215422
hypoxanthineSigmaH9636
xanthine oxidaseSigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Insturmentsdiscontinued 

References

  1. Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
  2. Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae. J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).
  3. Craig, T. A., Crane, F. L. Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells. Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).
  4. Mishra, R. K., Passow, H. Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).
  5. Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. Transplasma-membrane redox systems in growth and development. Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).
  6. Berridge, M. V., Tan, A. S. Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1. Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).
  7. Eccardt, A. M., et al. Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle. Antioxidants. 6 (4), 89 (2017).
  8. Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane. J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).
  9. Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells. J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).
  10. Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport. Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).
  11. Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).
  12. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. Multifunctional plasma membrane redox systems. Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).
  13. Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells. FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).
  14. Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane. Biochem Biophys Res Commun. 234, 79-81 (1997).
  15. Navarro, F., et al. Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes. Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).
  16. Herst, P. M., Berridge, M. V. Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines. Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).
  17. Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation. FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).
  18. Furukawa, S., et al. Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).
  19. Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease. Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).
  20. Berridge, M. V., Tan, A. S. High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).
  21. Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).
  22. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  23. Gurtoo, H. L., Johns, D. G. On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase. J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).
  24. Tan, A. S., Berridge, M. V. Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells. Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).
  25. . . R: A language and environment for statistical computing. , (2013).
  26. Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1). Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).
  27. Higaki, Y., et al. Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).
  28. Zuagg, W. Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level. J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).
  29. Dayan, J., Dawson, C. R. Substrate specificity of ascorbate oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).
  30. Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol. FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).
  31. Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica. 4, 15-20 (1996).
  32. Tan, A. S., Berridge, M. V. Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents. J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).
  33. Phillips, P. A., et al. Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway. Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).
  34. Altundag, E., et al. Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells. Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).
  35. Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).
  36. Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen. J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).
  37. Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases. Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135tPMETWST 1DPIPascorbateC2C12 myotubesspectrophotometric assay

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved