פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Benjamin Demaree; Daniel Weisgerber; Freeman Lan; Adam R. Abate

doi:10.3791/57598

Summary

תא בודד רצף חושף הטרוגניות genotypic במערכות ביולוגיות, אך טכנולוגיות הנוכחי חוסר התפוקה הכרחי עבור פרופיל עמוק של הקהילה הרכב ותפקוד. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה microfluidic עבור רצף > הגנום בתא יחיד 50,000 מ מגוונות תא אוכלוסיות.

Abstract

טכנולוגיות רצף עברו שינוי פרדיגמה של צובר לרזולוציה תא בודד בתגובה הבנה המתפתחת של התפקיד של הטרוגניות הסלולר במערכות ביולוגיות. עם זאת, תא בודד רצף של אוכלוסיות גדולות יש כבר הקשו על ידי מגבלות בעיבוד הגנום עבור רצף. בנייר זה, אנו מתארים שיטה של רצף הגנום בתא יחיד (SiC-seq) אשר משתמשת מיקרופלואידיקה droplet כדי לבודד, להגביר, ברקוד הגנום של תאים בודדים. תא אנקפסולציה בתוך microgels מאפשר טיהור ממודר tagmentation של ה-DNA, בזמן מיזוג microfluidic זוגות ביעילות כל הגנום עם ברקוד ייחודי oligonucleotide תא בודד, ומאפשר > 50,000 תאים בודדים היה לסדרם לכל הפעלה. רצף הנתונים demultiplexed על ידי ברקוד, יצירת קבוצות של קריאות שמקורם תאים בודדים. כשיטת תפוקה גבוהה ולא נמוכה-הטיה של תא בודד רצף, SiC-seq יאפשר מגוון רחב יותר של גנומית מחקרים מכוון אוכלוסיות מגוונות תא.

Introduction

הגנום משמשת מעין טביעת אצבע של זהות הסלולר ותפקוד, המכיל מכלול של אורגניזם של קידוד פוטנציאל. הבנה של ביולוגיה תאית ברמת הגנום יכול להסביר את המגוון פנוטיפי שנצפה בתוך אוכלוסיות הטרוגניות התא. הטרוגניות זו ניכר במערכות ביולוגיות, ויש לו השלכות רחבות על מחלה ובריאות האדם. לדוגמה, ג'ין עותק מספר וריאציות בין תאים סרטניים מקושרים את התפתחות והתפשטות של סרטן¹^,². זיהומים חיידקיים, פתוגניות האיים נוכח חלק קטן של הגנום יועבר בצורה אופקית, להוביל לשגשוג חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה³^,⁴. אתגר ראשוני בלימוד הגנום ברמת תא בודד הוא כמויות נמוכות של DNA זמינים, כמו גם את הצורך לנתח את אלפי תאים כדי לדגום את המגוון המלא של אחרים. מסיבות אלו, מגבלות תפוקה ניסיוני יש הפריע את האפקטיביות של מחקרים מתא בודד, ממתח תוצאות לכיוון תאי הנפוץ ביותר. בידוד תא בודד טכניקות כגון זרימת מיון⁵^,⁶, מלקחיים אופטיים⁷, embedment בתפזורת ג'לים⁸ולאחר מיקרופלואידיקה⁹ מסוגלים עיבוד מאות תאים עבור רצף; עם זאת, זה מייצג רק חלק קטן של דוגמאות לרוב. שיטה של רצף הגנום בתא יחיד עם תפוקה גבוהה במידה ניכרת תאפשר עמוק יותר ושלמה יותר פרופיל של אוכלוסיות תאים, ובכך הבהרת בתפקיד של גיוון genotypic בתוך קהילות אלה.

מיקרופלואידיקה droplet מאפשר מניפולציה תפוקה גבוהה של תאים, ריאגנטים הביולוגי בתוך מיליוני כורים בקנה מידה picoliter. עד כה, microdroplet טכנולוגיות השתמשו ללמוד דפוסי ביטוי דיפרנציאלי בין תאים ברקמות הטרוגנית¹⁰^,¹¹^,¹², עמוק רצף מולקולות ארוכות¹³^,¹⁴ ^,¹⁵, וניתוחים התנהגות כרומטין immunoprecipitation רצף (צ'יפ-seq) על תאים בודדים¹⁶. אכן, microdroplets מסוגלים תפוקה גבוהה, ממודר פעולות, שהופך אותם נוטה יישומים גנומיקה תא בודד. פיתוח טכנולוגיה זו מציג אתגרים טכנולוגיים ייחודיים משלו, עם זאת. תאים חייב להיות lysed, טהור, מוגבר עם הטיה מינימלי, לאוכלוסיות בצורה אחידה דגימת תאים. בנוסף, בשונה polyadenylated תעתיקים mRNA בתאים בתרבית של, יש מוטיב מולקולרי דומה אין הגנום כדי להקל על לכידתו של חומצות גרעין היעד. מסיבות אלו, רצף הגנום בתא יחיד היה קשה ליישם ב microdroplet פלטפורמות.

בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של גישת שדווחה בעבר microfluidic תא בודד מסוגל רצף הגנום של עשרות אלפי תאים ניסוי יחידה¹⁷. באמצעות טכנולוגיה זו, הנקראת SiC-seq, תאים חיידקיים נמצאים במארז בקנה מידה מיקרון hydrogels בנפרד lysed, tagmented, ואת התמזגה עם microdroplet המכיל ברקוד oligonucleotide ייחודי, אשר הוא משולבים על גבי DNA גנומי של התא דרך חפיפה בודדת סיומת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR). Hydrogels לשמש מיכלים מבודדים שבהם DNA גנומי גבוהה משקל מולקולרי הוא sterically עטוף, ומאפשר מולקולות קטנות יותר כגון דטרגנטים, אנזימים lytic כדי לגשת ולטהר את הדנ א לפני barcoding¹⁸. פרוטוקול זה מעבד > 50,000 תאים בודדים תוך מספר שעות, וכתוצאה מכך ספרייה לבר-קוד מוכן רצף. בעקבות הרצף, הקריאות הם demultiplexed לפי הרצף תא בודד ברקוד שלהם, וכתוצאה מכך dataset מכיל מיליוני קוראת, כל אחד עם מדד הסלולר.

Protocol

1. Microfluidic התקן פבריקציה נוספת

להכין microfluidic עיצובים המסכה באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD) (שסופק בתור. DWG; לראות את הקבצים המשלימים). יש עיצובים אלה להדפסה על-ידי הספק עם רזולוציה 10 מיקרומטר על סרט המעגל.
הערה: עבור התקני microfluidic רב שכבתית, המסכות המתאימה להכיל סימוני יישור.
עבור כל התקן, לפברק כדלקמן כייר מאסטר סו-8 (איור 1 א').
1. הכן רקיק סיליקון בקוטר 3 - על ידי מזיגת כ- 1 מ ל photoresist 3025 SU-8 במרכז כשהפחד. אבטח לחם הקודש על coater ספין צ'אק על-ידי החלת שאיבה.
2. ראה טבלה 1 רשימה של עוביים שכבה של ספין מהירויות עבור כל התקן. עבור כל ההתקנים, להתחיל את ציפוי ספין עם 30 s-500 סל ד, ואחריו 30 s במהירות המצוין.
3. הסר את וופל SU-8-סיליקון ספין coater ואופים רך זה על גזייה מוגדר 135 מעלות במשך 30 דקות מאפשרים כשהפחד להתקרר לטמפרטורת החדר לאחר האפייה.
4. לחשוף את וופל SU-8-סיליקון עם המסכה המתאימה microfluidic תחת מקבילות 190-mW, 365-nm UV LED במשך 3 דקות.
5. לאחר החשיפה, מוגדר קשה לאפות לחם הקודש על גזייה 135 ° C עבור 1 דקות. בעקבות צעד זה אפייה, לאפשר כשהפחד להתקרר לטמפרטורת החדר.
6. עבור התקן הכוללים שכבה אחת microfluidic, דלג לשלב 1.2.7. עבור התקן microfluidic רב שכבתית, חזור על שלבים 1.2.1 - 1.2.5 עבור השכבה השנייה של photoresist (איור 1B).
7. בעקבות אופים קשה הראשון עבור התקן שכבה אחת (או את אופים קשה השני עבור התקן רב שכבתית), לפתח את לחם הקודש במועט זה לתוך אמבט של פרופילן גליקול monomethyl אתר אצטט (PGMEA) למשך 30 דקות.
8. לאחר הפיתוח של רקיק, להשתמש בבקבוק מים המכיל PGMEA לשטוף את לחם הקודש. ואז לשטוף את וופל עם בקבוק מים המכילים אלכוהול איזופרופיל לפני הצבתו על גזייה 135 ° C עבור 1 דקות לייבוש.
9. מקם את לחם הקודש (המכונה מעתה ואילך המאסטר) לתוך צלחת פטרי לליהוק עם polydimethylsiloxane (PDMS).
עם הבסיס מוכן בשלב 1.2, המשך לבצע את ייצור ההתקן עם הליהוק PDMS.
1. הכינו את PDMS על-ידי שילוב של סיליקון הבסיס עם סוכן ריפוי 11:1 יחס במאסה. מערבבים את בסיס סיליקון, ריפוי סוכן בעבודת יד עם מקל מערבבים.
2. דגה את PDMS על-ידי הצבתו לתא degassing והחלת ואקום. לאפשר את PDMS דגה עד בועות אוויר כבר אינם גלויים (בדרך כלל 30 דקות).
3. שופכים בזהירות את PDMS degassed הבסיס, סופי PDMS-שכבה בעובי של 5 מ מ. דגה PDMS שוב על מנת לוודא את הסרת כל בועות האוויר.
4. לאחר degassing, אופים את PDMS ואת האמן של 80 מעלות צלזיוס במשך 80 דקות.
5. . נכנסים בזהירות המתים PDMS נרפא מתבנית הבסיס האפוי באמצעות סכין גילוח. ודא כי כל החתכים מעל פרוסות הסיליקון.
  הערה: חתכים שברחנו כשהפחד הסיליקון עלול לגרום lip מניעת חיבור אחיד.
6. אגרוף אינלטס ועודפים באמצעות אגרוף ביופסיה 0.75 מ מ. הסר את כל האבק, תועים PDMS באמצעות קלטת אריזה בצד תכונה של המכשיר.
7. לפני פלזמה בטיפול המכשיר, לנקות 50 מ"מ x 75 מ"מ זכוכית שקופית על-ידי שטיפה זה עם אלכוהול איזופרופיל מייבש אותו.
8. לטיפול פלזמה, מקום PDMS סלאב וזכוכית השקופית לתוך בונדר פלזמה עם התכונות פונה כלפי מעלה. לבצע את הטיפול פלזמה שימוש פלזמה₂ mbar O 1 1 מינימלית בונד את המכשיר אל הזכוכית שקופית על-ידי הבאת חשוף, או להתמודד, הצדדים יחד.
9. בעקבות הטיפול פלזמה, אופים את המכשיר ב 80 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
10. לבסוף, מזריקים נוזל טיפולי שטח למתכות זכוכית לאחד אינלטס לרנדר את ערוצי microfluidic הידרופובי. ודא כל הערוצים מוצפים לגמרי הפתרון לחזור על פעולת ההזרקה עבור כל dropmaker. אופים את המכשיר שטופלו ב 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות מתמוססות הממס עודף.

2. כימוס של תאים ב- Agarose Microgels

הערה: ראה איור 2A.

להכין 1 מ"ל של 3% w/v התכה נמוכה טמפרטורת agarose 1 x מאגר טריס-EDTA (TE). לשמור את הפתרון agarose על גוש חום 90 ° C עד מייד לפני המזרק טעינה.
להכין את התליה תא.
הערה: פרוטוקול זה והתקנים הקשורים microfluidic שלה יש מאומתים כדי לעבוד עם תאים חיידקיים, או מניות קפואים או טריים הכנה. בתרבית של תאים, בהתאם לסוג התא, עשוי לדרוש התאמה של הממדים ערוץ microfluidic כדי להתאים את המידות הגדולות יותר של התא.
1. Resuspend תאי 1 מ"ל של תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS).
2. לספור את התאים hemocytometer או על-ידי מיון זרימה. עבור 25 microgels מיקרומטר עם קצב עיטוף תא היעד של 1 ב 10, להכין 1 מ"ל של התא השעיה-ריכוז סופי של 2.4 x 10⁷ תאים למ"ל.
3. ספין התאים למטה ב 3000 g x במשך 3 דקות לשאוב תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של 17% v/v צפיפות בינונית הדרגתי (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS. לשמור את זה על הקרח עד ההעמסה מזרק.
לטעון מזרק 3-mL בשמן fluorinated (HFE), המכיל של 2% w/w perfluoropolyether-פוליאתילן גליקול (PFPE-PEG) חומרים פעילי שטח, להתאים את זה עם מחט 27 G, ולמקם אותו לתוך מזרק משאבה.
הערה: מתאים כל מזרקים עם מחט 27 G עבור microfluidic הצעדים פרוטוקול זה. כדי להפחית את הסיכון של חירור בשוגג, לשמור על מחטים כל כמוסות עד פעולת משאבת מתחילה.
לטעון את הבולם תא, agarose מותכת לתוך 1-mL מזרקים, להתאים את שני מחטים 27-מד, למקם אותם לתוך משאבות מזרק.
לחמם את agarose מזרק, משאבת לתנור קטן כדי למנוע את agarose של ג'לי מזרק, כניסת אבובים. להגדיר מפזר חום גבוהה ומקם אותה כך השטח חימום הוא כ- 10 ס מ מן המזרק. ודא כי הטמפרטורה נמדדת על המזרק כ 80 מעלות צלזיוס.
הערה: משתמשים מתבקשים לשמור על התנור-המרחק המומלץ בין מנגנון השאיבה כדי להפחית את הסיכון של נזק ציוד, לרבות התכה של הצנרת.
צור 25 טיפות microgel של מיקרומטר, באמצעות המכשיר dropmaking זרימה ושיתוף.
הערה: ראה איור 3A עבור התקן סכמטית המציין את המיקום של ריאגנט אינלטס, עודפים.
1. לחבר את מחטי מזרקים אינלטס התקן microfluidic באמצעות פיסות של צינורות פוליאתילן (PE). לפני החדרת הצינורות לתוך המכשיר, פריים המשאבות כדי להסיר את האוויר מן הקו.
2. חתיכת צינור להתחבר לשקע ולמקם הסוף חינם בשפופרת איסוף 15 מ"ל.
3. השתמש התעריפים זרימה (מומלץ) הבאים עבור dropmaking: µL/h 800 עבור HFE 2% w/w PFPE-יתד; 200 µL/h על התליה תא ב- PBS; µL/h 200 עבור agarose w/v 3%.
לאחר dropmaking, למקם את הצינור אוסף ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות להבטיח את gelation השלם של agarose.

3. שוברים ולשטוף את Agarose Microgels

להסיר את השכבה התחתונה של הנפט מהצינור אוסף באמצעות מזרק 3 מ ל מצויד עם מחט 20 גרם, דואגת שלא להפריע לשכבה העליונה של טיפות agarose.
לשבור את אמולסיות עם perfluorooctanol (PFO).
1. להוסיף 1 מ"ל של 10% v/v PFO ב HFE טיפות agarose. Pipet פתרון זה למעלה ולמטה במשך 1 דקה כדי להרגיע את אמולסיות ביסודיות את.
  הערה: עבור כל microgel לשטוף מדרגות, pipet הפתרונות עם טיפ 1,000 µL. Microgel ההשעיה אמורה להופיע אחידה וללא גושים לאחר pipetting אותו.
2. לסובב את צינור חרוטי ב g x 2,000 עבור 1 דקות לאסוף את microgels agarose. הסר את תגובת שיקוע PFO/HFE על ידי שאיפה; microgels עכשיו חופשיים של שכבה חומרים פעילי שטח שלהם והם יופיעו ברורה.
לשטוף את microgels עם חומרים פעילי שטח בהקסאן.
התראה: הקסאן הממס אורגניים נדיפים, לשטוף את שלב 3.3 צריך לנהל ברדס fume.
1. להוסיף 2 מ של 1% v/v סורביטן monooleate nonionic חומרים פעילי שטח (ראה טבלה של חומרים) בהקסאן כדי microgels agarose. Pipet למעלה ולמטה x 10 לערבב, המבטיח את הפרידה המלא של microgel גלולה.
2. לסובב את הצינור ב- 1000 g x עבור 1 דקות לאסוף את microgels. וארוקן את תגובת שיקוע להסיר הפתרון חומרים פעילי שטח/הקסאן.
3. חזור על חומרים פעילי שטח/הקסאן בכביסה.
לשטוף את microgels ב מאגר מימית כדי להסיר כל הממס האורגני שיורית.
1. הוסף 5 מ של מאגר ט [0.1% v/v octylphenol ethoxylate nonionic דטרגנט (ראה טבלה של חומרים) ב- 1 x TE] אל הצינור חרוט. Pipet למעלה ולמטה x 10 לערבב.
2. לסובב את צינור חרוטי ב g x 2,000 למשך 2 דקות לאסוף את microgels. וארוקן את תגובת שיקוע להסיר את המאגר ט.
3. חזור ט לשטוף 2 x.
4. הוסף 5 מ ל 1 x טה מאגר הצינור חרוט. Pipet למעלה ולמטה x 10 לערבב.
5. לסובב את צינור חרוטי ב g x 2,000 למשך 2 דקות לאסוף את microgels. וארוקן את תגובת שיקוע להסיר את המאגר טה.
6. חזור על שטיפת את טה.
לאמת את עטיפת תא ב microgels תחת מיקרוסקופ בהגדלה גדולה-X 400 על ידי כתמים של aliquot 10 µL של ג'ל עם חומצת גרעין x 1 כתם (ראה טבלה של חומרים).
הערה: Microgels תופיע ברור תחת בערוץ שקוף תוך תאי ש-DNA לזרוח תחת בערוץ ה-GFP (497/520 עירור/פליטה אורכי גל nm). כיסוי של ערוצים שקופים פלורסנט יראה התאים ב- microgels כפי שמוצג באיור 4A.

4. פירוק של תאים ב- Agarose באמצעות אנזימים Lytic

להכין 1 מ"ל של אנזים lytic קוקטייל באמצעות µL 800 טה מאגר (1 x), 2 µL של האנזים lytic שמרים (5 U/µL מניות, 10 U/mL הסופי), 30 µL של dithiothreitol (1 מ' מניות, הסופי 30 מ מ), 60 מ ג של ליזוזים (אבקת lyophilized), µL 15 של EDTA (0.5 M מניות סופי 7.5 מ"מ), 2 µL של mutanolysin (100 U/µL מניות, 200 U/mL הסופי), 2 µL של lysostaphin (10 U/µL במלאי, 20 U/mL הסופי) ו 30 µL של NaCl (1 מ' מניות, הסופי 30 מ"מ).
הוסף טה נוספים כדי להביא את אמצעי האחסון 1 מ"ל. מערבבים את הפתרון על-ידי vortexing.
להוסיף את כל 1 מ"ל של הפתרון אנזים lytic לא יותר מ- 1 מ ל microgels שטף. מערבבים מאת pipetting 10 x. דגירה התערובת ב 37 ° C עבור > 2 h ב שייקר (המרבי הוא הדגירה לילה).

5. Microgel סבון המבוסס על טיפול

בעקבות פירוק דרך lytic אנזימים (שלב 4), לשטוף את microgels.
1. ספין למטה microgels ב g x 2,000 למשך 2 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע. טיפות יופיע אטום לבן בגלל שאריות תאים התפזרו בגדר.
2. Resuspend את microgels ב 5 מ של מאגר טריס-HCl 10 מ מ ו- pipet למעלה ולמטה x 10 לערבב.
3. ספין התערובת למטה ב g x 2,000 למשך 2 דקות, ולאחר מכן הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
מבצע טיפול דטרגנט microgels.
1. Resuspend של ג'לים במאגר ליתיום dodecyl סולפט (בשלמותם) פירוק (עפעפיו 0.5% w/v ב- 20 מ מ טריס-HCl) ו- 60 µL של 0.5 M EDTA לאמצעי הסופי של 3 מ ל.
2. להוסיף 5 µL של אנזים Proteinase K (800 מניות U/mL). Pipet למעלה ולמטה x 10 לערבב, דגירה ואז את התערובת ב 42 מעלות צלזיוס על גוש חום עבור h 1 solubilize לקרום התא, לעכל את החלבונים.
בעקבות הטיפול דטרגנט, לשטוף את microgels.
1. ספין ברכבת התחתית חרוט עם microgels למטה ב 2,000 g x עבור 2 דק. הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
2. לשטוף את microgels עם 10 מ"ל של 2% v/v polysorbate 20 במים. Pipet למעלה ולמטה x 10 לערבב.
3. ספין הצינור חרוט למטה ב g x 2,000 למשך 2 דקות, ולאחר מכן הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
4. לשטוף את microgels עם 10 מ"ל אתנול 100% כדי להשבית כל אנזים שיורית. Pipet למעלה ולמטה x 10 לערבב.
5. ספין הצינור חרוט למטה ב g x 2,000 למשך 2 דקות, ולאחר מכן הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
6. לשטוף את microgels עם 10 מ"ל של 0.02% v/v polysorbate 20 במים. Pipet למעלה ולמטה x 10 לערבב.
7. ספין הצינור חרוט למטה ב g x 2,000 למשך 2 דקות, ולאחר מכן הסר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
8. אני חוזר polysorbate 20 לשטוף 3 x. עוברים את הפתרון מסננת תא 100-מיקרומטר לפני בכביסה האחרונה כדי להסיר כל גושים גדולים.
Resuspend את microgels ב 5 מ ל 10 מ מ מאגר טריס-HCl כדי למנוע השפלה הדנ א. ניתן לאחסן את microgels ב 4 ° C עד 1 שבוע לפני tagmentation (שלב 7).

6. יצירת ברקוד טיפות על ידי ה-PCR דיגיטלי

להכין מלאי 500-pM של בר פריימר (טבלה 2) ב 1 x טה המאגר בצינור נמוך-bind. לפני כל שימוש, לדלל את המפתח כדי מלאי עבודה של 1 pM וחום זה עד 70 ° C עבור 1 דקות על גוש חום.
להכין תערובת התגובה PCR 150-µL באמצעות 75 µL של מאסטר התחלה לוהטת אמינות גבוהה לערבב (ראה טבלה של חומרים) (2 x), 42 µL של ה-PCR-כיתה מים, 3 µL של פריימר DNA_BAR (10 מיקרומטר מניות, הסופי 0.2 µM), 3 µL של P7_BAR פריימר (מיקרומטר 10 מניות סופי 0.2 µM), µL 6 של דילול ברקוד (מניות 1 pM, הסופי 40 fM), 6 µL של polysorbate 20 (50% v/v מלאי, 2% הסופי) ו- 15 µL של פג 6 k (50% w/v מלאי, 5% הסופי). מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 x.
להכין מזרק HFE מגובה ידי ציור µL 200 של HFE שמן לתוך מזרק, להתאים את זה עם מחט. קטע של צינורות PE לצרף המחט, פריים הקו בעבודת יד. להוסיף בסוף צינורות PE הפתרון היעד וצייר בקפידה כל 150 µL של המיקס PCR לתוך צינורות PE ו מזרק. לטעון את המזרק לתוך מזרק משאבה.
לטעון מזרק 1 מ"ל עם שמן fluorinated (HFE), המכיל של 2% w/w perfluoropolyether-פוליאתילן גליקול (PFPE-PEG) חומרים פעילי שטח, להתאים את זה עם מחט, ולמקם אותו לתוך מזרק משאבה.
צור 25 טיפות ברקוד של מיקרומטר, באמצעות המכשיר dropmaking זרימה ושיתוף.
הערה: ראה איור 3A עבור התקן סכמטית המציין את המיקום של ריאגנט אינלטס, עודפים.
1. הכנס הים תאים של מכשיר dropmaker זרימה ושיתוף עם חתיכה קטנה של עופרת הלחמה.
2. לחבר את מזרקים עמוסה HFE ומערבבים PCR על פתחי הכניסה המכשיר microfluidic באמצעות פיסות של צינורות PE, באמצעות הים Agarose מותכת עבור הברקוד PCR מיקס. לפני החדרת הצינורות לתוך המכשיר, פריים המשאבות כדי להסיר את האוויר מן הקו.
3. חתיכת צינור להתחבר לשקע ולמקם הסוף חינם צינור PCR 0.2 מ"ל. השתמש התעריפים זרימה (מומלץ) הבאים עבור dropmaking: µL/h 600 HFE 2% w/w PFPE-יתד, µL/h 200 עבור המיקס PCR. לאסוף את הטיפות לתוך הצינורות PCR עם 50 µL טיפות כל צינור.
לאחר dropmaking, בזהירות להסיר את השכבה התחתונה של שמן HFE אמולסיות באמצעות טיפים pipet ג'ל העמסה ולהחליף אותו עם שמן fluorinated FC-40 המכיל של 5% w/w PFPE-יתד חומרים פעילי שטח. מחזור תרמי עם פרוטוקול הבאים: 98 ° C למשך 3 דקות, 40 x של (98 ° C עבור 10 s, 62 ° C עבור 20 s, 72 ° C עבור 20 s), 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ולאחר מכן הקש על 12 º C.
הערה: טיפות רכב תרמי-על אופניים ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 1 ליום.
ודא את ההגברה ברקוד וקצב אנקפסולציה.
1. להכין חומצת גרעין 1 x הכתים (ראה טבלה של חומרים) ב- HFE עם 2% w/w PFPE-יתד חומרים פעילי שטח; הכתם הוא שולי miscible ב HFE, יהיה לאגד ה-DNA ב טיפות.
2. להוסיף 1 µL של ברקוד רכב על אופניים תרמי אמולסיה µL 10 של שמן מוכתמים. דגירה אותם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. תמונה טיפות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ערוץ ה-GFP, אורכי גל עירור/פליטה 497/520 nm) בהגדלה גדולה-X 200 ולספור את קצב עיטוף ברקוד. שימו לב כי האות תהיה דיסקרטית: טיפות מוגבר ברקודים המכיל לזרוח בהירים, ואילו הטיפות ריק יופיע כהה (איור 4B).

7. Tagmentation של דנ א גנומי בטיפות

הערה: ראה איור 2B.

הכנת 500 µL של tagmentation פתרון באמצעות מן הדור הבא רצפי ספריית הכנה קיט (ראה טבלה של חומרים). השתמש µL 7 של האנזים tagmentation, µL 250 tagmentation מאגר, µL 243 של מים כיתה ה-PCR. לערבב אותם על ידי vortexing, ספין התערובת למטה כדי לאסוף. לטעון פתרון זה לתוך מזרק מגובה שמן 1 מ"ל HFE, להתאים את זה עם מחט.
להכין את microgels reinjection.
1. ספין דרך צינור microgel למשך 2 דקות ב 2,000 x g, וארוקן את תגובת שיקוע. העברת µL 200 של ג'ל לראש המזרק מגובה HFE עם טיפ pipet ג'ל העמסה ויסגור את הצינור עם חתיכה קטנה של הקלטת.
2. באמצעות מתאם מודפס 3D צנטריפוגה (ראה משלימה קבצים 1 ו -2), לסובב את המזרק microgel למשך 3 דקות ב 3000 g x.
3. הסר את תגובת שיקוע נוזלי במזרק באמצעות טיפ pipet ג'ל-טעינה. לדחוף את השכבה microgel הבסיס של הצינור מזרק. להתאים את המזרק עם מחט.
לטעון מזרק 3 מ עם שמן fluorinated (HFE), המכיל של 2% w/w perfluoropolyether-פוליאתילן גליקול (PFPE-PEG) חומרים פעילי שטח, להתאים את זה עם מחט, ולמקם אותו לתוך מזרק משאבה.
מחדש לתמצת את microgels לתוך טיפות המכיל נוגדנים tagmentation.
הערה: ראה איור 3B עבור התקן סכמטית המציין את המיקום של ריאגנט אינלטס, עודפים.
1. לחבר את מזרקים המכיל HFE tagmentation מיקס, microgels על פתחי הכניסה המכשיר microfluidic באמצעות פיסות של צינורות PE. לפני החדרת הצינורות לתוך המכשיר, פריים המשאבות כדי להסיר את האוויר מן הקו.
2. חתיכת צינור להתחבר לשקע ולמקם הסוף חינם מזרק 1-mL ריק עם הבוכנה נמשך אל קו 1 מ"ל.
3. השתמש התעריפים זרימה (מומלץ) הבאים עבור dropmaking: µL/h 2000 עבור HFE 2% w/w PFPE-יתד µL/h 200 עבור microgels, µL/h 500 על המיקס tagmentation.
ודא את קצב עיטוף microgel תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה גדולה-X 400. כ- 80-90% של הטיפות צריך להכיל microgel, כפי שמוצג באיור 4C.
להתאים את המזרק המכיל את אמולסיות tagmentation עם מחט, דגירה זה זקוף גוש חום או בתנור לשעה ב 55 ° C קטע הדנ א הגנומי.

8. החד-תאיים Barcoding על-ידי המיזוג כפול Microfluidic

הערה: ראה איור 2C.

להכין את טיפות ברקוד המיזוג על-ידי החלפת השבר שמן FC-40 HFE 2% w/w PFPE-יתד. בזהירות להעביר טיפות אלה לתוך מזרק 1 מ"ל, להתאים את זה עם מחט, ולמקם אותו לתוך מזרק משאבה.
לטעון את המזרק droplet microgel מתפשט, tagmented לתוך מזרק משאבה.
להכין µL 500 של PCR מיקס. הוסף את ריאגנטים לפי הסדר הבא כדי למנוע פוחת משקעים ויוצרים: 140 µL של ה-PCR-כיתה מים, µL 10 של פריימר P5_DNA (10 מיקרומטר מניות, הסופי 0.2 µM), µL 10 של פריימר P7_BAR (10 מיקרומטר מניות, הסופי 0.2 µM), 50 µL של פג 6k (50% w/v מלאי 5% הסופי), 50 µL של polysorbate 20 (50% v/v מלאי, 5% הסופי), 250 µL של מיקס מאסטר Taq (2x) (ראה טבלה של חומרים), µL 10 של פולימראז איזותרמי (ראה טבלה של חומרים), ו- µL 10 ניטרול מאגר (ראה טבלה של חומרים). לערבב אותם על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 x ולסובב את התערובת למטה לאסוף אותו. לטעון פתרון זה לתוך מזרק 1-mL מגובה HFE ', להתאים את זה עם מחט, ולמקם אותו לתוך מזרק משאבה.
עומס 3/מזרקים 3-mL בשמן fluorinated (HFE) המכילה מתאים כל אחד עם מחט 2% w/w perfluoropolyether-פוליאתילן גליקול (PFPE-PEG) חומרים פעילי שטח, ולמקם אותם לתוך משאבות מזרק.
לטעון שלושה מזרקים 1 מ"ל עם 2 M NaCl, מתאים כל אחד עם מחט, לשים אותם בצד.
למזג את טיפות ברקוד, טיפות הגנום tagmented, ומערבבים PCR באמצעות המכשיר המיזוג כפול.
הערה: ראה איור 5 עבור התקן סכמטית המציין את המיקום של ריאגנט, אלקטרודה אינלטס, עודפים.
1. להתחבר של מזרקים NaCl 3 2 אלקטרודה אינלטס ופיסות חפיר יחיד inletusing צינורות PE. עבור האלקטרודות, חלות לחץ תארגן את הדברים באופן ידני עד האלקטרודות מלאים לחלוטין תמיסת מלח. לאחר מילוי האלקטרודות, הפעילו לחץ ידני כדי המזרק חפיר עד החפיר מלא. חבר את הקצה חינם של החפיר עם חתיכה קטנה של עופרת הלחמה.
2. לחבר את מזרקים HFE 3 רכוב על משאבות אינלטס שמן מרווח 2 ו- dropmaking שמן inletusing חתיכות של צינורות PE. לפני החדרת הצינורות לתוך המכשיר, פריים המשאבות כדי להסיר את האוויר מן הקו.
3. לחבר את המזרק מיקס PCR microgel טיפות מזרק, ברקוד טיפות מזרק אינלטס בהתאמה שלהם באמצעות צינורות PE. לירות לכל droplet reinjection לצנרת עם אקדח בתמיסה לפני חיבורם מחטי מזרקים; הטיפול האנטי-סטטי מפחיתה את הסיכון coalescence droplet המושרה על ידי האשמות סטטי לאורך צינור PE.
4. חתיכה של צינורות PE להתחבר לשקע ולמקם הסוף חינם צינור PCR 0.2 מ"ל.
5. לחבר את המחט של המזרק אלקטרודה מהפך פלורסנט קתודה באמצעות סרטון תנין. להגדיר ספק כוח DC של מהפך 2 V.
6. להפעיל את המכשיר המיזוג כפול עם שיעור זרימת המומלצת: 300 µL/h עבור הטיפות microgel tagmented, µL/h 100 הטיפות ברקוד, 1500 µL/h עבור HFE 2% w/w PFPE-יתד (dropmaking שמן), µL/h 600 עבור ההגברה לערבב, µL/h 200 עבור (PFPE-יתד HFE w/w 2% ברקוד מרווח שמן), ו- 700 µL/h עבור HFE 2% w/w PFPE-יתד (microgel מרווח שמן). לאסוף את הטיפות לתוך המבחנות כ-50 µL של אמולסיה ב כל שפופרת.
לפני תרמית רכיבה על אופניים, בזהירות להסיר את השכבה התחתונה של שמן HFE אמולסיות באמצעות טיפים pipet ג'ל העמסה ולהחליף אותם בשמן fluorinated FC-40 המכיל של 5% w/w PFPE-יתד חומרים פעילי שטח. מחזור תרמי עם פרוטוקול הבאים: 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 30 x (95 ° C 15 s, 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה), 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ואז להחזיק על 12 º C.
לשחזר את ה-DNA לבר-קוד טיפות רכב תרמי-על אופניים.
1. בריכה את טיפות לתוך צינור microcentrifuge ולשבור את אמולסיות באמצעות µL 20 של PFO. מערבולת אותם 10 s לערבב.
2. לסובב את הצינור ב 10,000 g x עבור 1 דקות עד fractionate את התערובת לתוך מימית (למעלה), שלבים שמן (למטה). . ובזהירות להסיר את השכבה העליונה מימית מהצינור באמצעות pipet להעביר אותו צינור microcentrifuge להתעלם לשלב שמן.
3. לטהר את המוצר PCR לבר-קוד בעמודה ספין על פי הפרוטוקול של היצרן, elute אותו ב- µL 20 1 x טה המאגר.
4. להמשיך רצף שבוצעו וניתוח לפי שלבים 9 ו- 10.

9. ספריית הכנה ורצף

היכונו הספרייה תא בודד הרצף לפי הפרוטוקולים של היצרן עבור המקטע גודל-מבחר, כימות.
רצף הספרייה סוף-לזווג עם כימיה ברירת המחדל עבור קריאה 1 ו- 2 לקריאה. השתמש ומהצמיגים אינדקס 1 מותאם אישית I7_READ (טבלה 2) עבור אינדקס 15-bp לקרוא, התואם לברקוד תא בודד.

10. ניתוח נתונים מתא בודד

הערה: קבצי script מותאמים אישית פיתון עבור בקרת איכות וניתוח ראשוני של הנתונים SiC-seq ניתן להוריד מאתר https://www.github.com/AbateLab/SiC-seq.

להריץ את הסקריפט "barcodeCleanup.py" כדי לבצע בקרת איכות על קריאות לבר-קוד ולייצא את הנתונים בתא יחיד על מסד הנתונים SQLite. עבור ניסוי שליטה, השתמש סקריפט זה עם "-ליישר" הוגדר כדי ליישר את הקריאות כדי הגנום הייחוס המוכרת דגל.
לנתח את הטוהר של קבוצות ברקוד (עבור ניסוי שליטה) באמצעות קובץ ה-script "purity.py" ואשר את ערכי טוהר גבוהה בקנה אחד עם איור 6B.

תוצאות

SiC-seq ניסיוני זרימת העבודה מכיל 3 מכשירים microfluidic PDMS מפוברק באמצעות הליך ליתוגרפיה רך (איור 1). Dropmaker זרימה ושיתוף (איור 3 א) יוצר מיקרומטר 25 של טיפות ברקוד דיגיטלי עבור תיוג הדנ א עם מזהה ייחודי של תא בודד. Oligonucleotides הברקוד מורכב bp 15 מנוונת רצף ולצדו PCR ידיות הגברה (טבלה 2, בר פריימר). הברקודים נמצאים מדולל כדי ריכוז femtomolar כדי להשיג את עטיפת מולקולה בודדת, ולקבל כל טיפות fragment(s) ברקוד או 0 או 1. טיפות המכילות ברקוד הם מוגבר, מניב עותקים רבים של גדילי כפול הברקוד amplicons. כתם חומצת גרעין משמש כדי לוודא הגברה מוצלחת ולכמת את קצב עיטוף של השברים ברקוד (איור 4B). Microgels הנוצרים על-ידי שיתוף זורם השעיה תא החיידק, ג'ל agarose מותכת במחירים שווים זרימה (איור 2 א). Agarose מוכן-פעמיים הריכוז הסופי הרצוי, כמו תהליך dropmaking זרימה משותפת ביעילות מדללת את הפתרונות מימית בפקטור של 2. כפי agarose מתקררת, הוא עפור לתוך microgel בקוטר 25 מיקרומטר שיתפסו נפח כדורית של ה-droplet.

סדרה של צעדים רוחצים את פירוק מטהרת את הדנ א הגנומי ב microgels (איור 2B) גבוהה משקל מולקולרי. לאחר שבירת את אמולסיות, שוטף מימית מתבצעות בכמויות גדולות כדי לדלל את עקבות ממיסים אורגניים אשר יכול לעכב את הטיפולים אנזימטי במורד הזרם. Microgels שטף שנצפו תחת מיקרוסקופ כדי לאמת את קצב עיטוף תא (איור 4A). קוקטייל של אנזימים עם פעילות lytic רחב נוסף המתלה microgel לעכל את קירות התא של חיידקים, חיידקים האיקריוטים¹⁹. טיפול השנייה עם Proteinase K ודטרגנט ונמחקות החלבונים, solubilizes שאריות תאים.

Tagmentation של ה-DNA מטוהרים מתבצעת טיפות כדי למנוע זיהום צולב פוטנציאלי הנובע פעפוע של tagmented קטן שברי DNA בין microgels¹⁸. מכשיר כימוס droplet (איור 3B) compartmentalizes כל microgel עם אנזים מאגר ו tagmentation, אשר בו זמנית קטעים כפול גדילי DNA בעת גם "מסמן" אותה עם oligonucleotide שנטענו מראש²⁰. Microgels נטענים לתוך טיפות כמו חלקיקים לזינוק, להשגת המחירים כימוס מתקרב microgel 1 עבור כל טיפה עם כמה doublets²¹ (איור 4C).

בשלב הסופי של זרימת העבודה microfluidic (איור 2C), התקן מבצע פעולה המיזוג זוגי המשלב טיפה ברקוד 1 טיפה המכילות microgel 1, את הגברה התמהיל בתהליך בן שני שלבים מבוקרים. ראשית, droplet המכיל PCR ריאגנט לזווג, התמזגה עם טיפה ברקוד באזור שמוצג צהוב (איור 5). אלקטרודות מים מלוחים בערוץ microfluidic לייצר מעבר צבע גבוהה שדה חשמלי אשר מפעיל את המיזוג droplet. באופן דומה, ה-droplet הממוזג הראשון הוא מזווג עם טיפונת microgel, התמזגה בפעם השנייה באזור מוצגים בצבע אדום. טיפות נאספים, תרמי רכב על אופניים מחוץ שבב ב סיומת יחיד-חפיפה (SOE) PCR. בקצות משלימים וחופפים הברקוד ואת הדנ א הגנומי tagmented מאפשרים היתוך הגברה מעריכית של בונה לבר-קוד רק כראוי.

רצף הנתונים קודם המסוננות לפי איכות קריאה וכי אז מנותח על ידי קיבוץ של הקריאות לפי הרצף שלהם 15-bp תא בודד ברקוד. עבור קבוצה ברקוד להיחשב חוקיים, עליה להכיל מספר מינימלי של קריאות; סף זה מגביל את הניתוח לתאים עם כמות רצף נתונים שימושי ומסירה את הברקוד מוטציה ב- PCR "יתומים" ערכת הנתונים. במדגם זה לרוץ, הסכום המינימלי מוגדר כ- 7.5 קילו לכל קבוצה (50 קריאות של 150 bp כל). היסטוגרמה של הסעיפים ברקוד לעומת גודל הקבוצה מראה כי חלק ניכר של הקבוצות ברקוד תקף מעל גודל הסף (איור 6A).

בניסוי שליטה שבהן ידוע הרכב הקהילה מיקרוביאלי, משמשים את הטוהר ואת השפע היחסי מדדים כדי להעריך את איכות משחק ההמ-SiC לרוץ. . הנה, קהילה 10-תא סינתטי של חיידקים גראם שליליים 3, 5 חיידקים גראם חיוביים, שמרים 2 הוא ניתח. הטוהר של קבוצת ברקוד נתון מוגדר מספר קריאות מיפוי הגנום הנפוץ ביותר בקבוצה מחולק על ידי המספר הכולל של קריאות בקבוצה. הרוב המכריע של הקבוצות ברקוד יש purities גדול מ- 0.95 (איור 6B). שפע יחסי של סוגי תאים מחושבת על ידי ספירת את קריאות raw, על ידי ספירת קבוצות ברקוד, שבו הקבוצות מוקצים סוג התא המתאים הקונצנזוס הקריאות חבר שלה (איור 6C). השפע של קריאות וקבוצות ברקוד לעקוב אחר בפרופורציות שווה בערך, המציין כי הם להיות שנדגמו האוכלוסיות תא כזה כי מינים מסוימים לא כלולים בקבוצות קטנות או גדולות פרופורציה ברקוד. התוויית בסקירה צבירה של קבוצות ברקוד כל בזן אחד מציין כיסוי גבוהה ברחבי הגנום כולו, עם אזורי הנשירה כמה או לא (איור 7). ניתנת לאימות כמקורית האחידות של כיסוי עם התפלגות שכיחויות של ערכים כיסוי מנורמל, עם ערכים רוב ממורכזת סביב הממוצע (איור 7, הזחה).

figure-results-4938
איור 1 : ייצור של microfluidic התקנים על ידי פוטוליתוגרפיה. (א) מאסטר תבניות עם תכונה אחת לגובה מיוצרים על ידי סחרור ציפוי שכבה של סו-8 photoresist על גבי רקיק סיליקון. Photoresist הוא בדוגמת ואז עם מסכה photolithographic, UV אור, crosslinking SU-8 חשוף. לבסוף, uncrosslinked סו-8 הוא מומס אמבט מפתח. העובש שנוצר משמש להטיל PDMS אשר מודבקת על שקופית מזכוכית כדי לייצר את המכשיר microfluidic מלאה. (B) עבור התקן שכבה כפולה, הזיוף באופן דומה מתחיל בצעדים ציפוי וחשיפה ספין. שלבים אלה חוזרים לאחר מכן ליצור התקן דו שכבתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5827
איור 2: סקירה של זרימת העבודה SiC-seq. המתלה מיקרוביאלית (א) A הוא מעורקיה משותפת עם agarose מותכת במכשיר dropmaker כדי לכמס תאים בודדים ב- microgels. (B) microgels נחשפים לסדרת שוטף לטהר את ה-DNA גנומי חיידקי. Lytic אנזימים מעכלים את קירות התא של חיידקים גראם חיוביים, שמרים, אבקת solubilizes ההריסות הסלולר. Microgels הם מחדש שעברו אנקפסולציה לתוך טיפות עבור tagmentation להקטין זיהום צולב. (ג) המיזוג microfluidic משלב ברקוד PCR דיגיטלי הגנום microgel tagmented, שילוב הגברה בקצב > קילוהרץ. את שבב דליה כליף-PCR splices ברקוד תא בודד ייחודי על גבי הגנום tagmented והגדלה באופן סלקטיבי לחלוטין בונה לבר-קוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6807
איור 3: Microfluidic התקנים לצורך כימוס מחדש dropmaking ו- microgel. (א) לוח זה מראה dropmaker זרימה ושיתוף (25 מיקרומטר של תכונה גובה). מותכת agarose והתאים הם הציגו לתוך המכשיר במחירים שווים זרימה כדי לייצר 25 טיפות מיקרומטר בצומת מיקרומטר מיקרומטר x 25 25. עבור ברקוד דיגיטלי dropmaking, מפרצון תא מחובר לחשמל ולאחר שילוב PCR מוחדרים לים agarose. (B) לוח זה מציג מכשיר כימוס מחדש microgel (25 מיקרומטר של תכונה גובה). Microgels לזרום לתוך מפרץ צר בצורת משפך לשמור על הזמנת לזינוק שלהם ולקבל נפח של tagmentation לערבב לפני העטיפה מחדש-צומת מיקרומטר מיקרומטר 25 x 30. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7729
איור 4 : Micrographs של טיפות, microgels. (א) לוח זה מראה שטף microgels מיקרומטר 25 לפני פירוק אנזימטי. החיידק fluorescently מוכתמים על כימות של קצב עיטוף. פואסון טעינת נתונים סטטיסטיים להכתיב כי התאים להיות שעברו אנקפסולציה בקצב של 1 ב 10 טיפות או פחות כדי למזער את התדירות של אירועים מרובים-כימוס. (B) לוח זה מציג תמונת מיקרוסקופ זריחה של 25 טיפות ברקוד דיגיטלי של מיקרומטר, מטופלים עם כתם חומצת גרעין. טיפות המכיל קטעים ברקוד מוגבר לייצר אות חזק זריחה. (ג) לוח זה מראה microgels מחדש במארז 50 טיפות מיקרומטר. סגור-האריזה של microgels מאפשר כימוס המחירים מתקרבת ג'ל 1 לכל טיפה עם כמה doublets. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8695
איור 5 : Microfluidic התקן המיזוג כפול עבור barcoding הגנום בתא יחיד. מבצע מיזוג של שני שלבים זוגות ברקוד טיפות עם הגנום tagmented ב תפוקה גבוהה. Droplet של PCR מיקס ראשון שנוצר, התמזגה עם טיפונת ברקוד באזור שמוצג צהוב באמצעות אלקטרודות מים מלוחים. בשלב הבא, droplet המכיל microgel הציג, התמזגה בפעם השנייה באזור מוצגים בצבע אדום. שמן אינלטס מאפשרים שליטה מדויקת של המרווח בין טיפות reinjected. תא reinjection ברקוד ושמן מרווח שלה ממוקמים על השכבה מיקרומטר 25 קצר יותר, מוצללים בכחול. כל שאר התכונות המכשיר שייך לשכבה עבה יותר עם 45 מיקרומטר של גובה מוחלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9571
איור 6 : ברקוד המדדים קבוצה עבור קהילה מיקרוביאלי סינטטי 10-תא. (א) לוח זה מציג ההתפלגות של הברקוד גודל הקבוצות. מספר קבוצות של גודל נתון יורדת אקספוננציאלית כמו עליות גודל הקבוצה. הסף המינימלי של 7.5 קילו לכל קבוצה מגביל את הניתוח לקבוצות עם כמות מספקת של מידע ומסיר את רצף ה-PCR-מוטציה "יתומים". (B) לוח זה מציג ההתפלגות של ברקוד קבוצה purities. הרוב המכריע (> 90%) של הקבוצות הן של טוהר גבוהה מאוד (> 95%). (ג) לוח זה מציג שפע יחסי של 10 מינים החישוב ברמת הקבוצה קריאה ו ברקוד. 2 שיטות ספירה לייצר תוצאות דומות, המציין כי גודל קבוצה ברקוד יהיו עקביים ברחבי מינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-10508
איור 7 : צבירה גנומית סיקור Bacillus subtilis קבוצות ברקוד. קורא כל הקבוצות ברקוד מיפוי החיידק B. subtilis (N = 9,398) הם איחדו וניתח במצטבר. מפת כיסוי מעגלית מדגים אחידות כיסוי הקריאות SiC-seq, עם אזורים לא נושרת מבית הנצפה. קו מקווקו סביב המעגל מציין את הכיסוי הממוצע (5.55 x). ההיסטוגרמה שיבוץ של התדרים כיסוי יחסית מציגה בכמויות גדולות של הבסיסים מכוסים בעומק בקרבת הממוצע הגנום כולו, המיוצג על-ידי הקו המקווקו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

התקן	גובה השכבה הראשונה (מיקרומטר)	הראשונה שכבת ספין מהירות (rpm)	בשכבה 2nd גובה (מיקרומטר)	2 שכבת ספין מהירות (rpm)
שיתוף זרימה dropmaker	25	4000	N/A	N/A
ג'ל encapsulator מחדש	25	4000	N/A	N/A
המיזוג כפול	25	4000	20	5000

טבלה 1: פרמטרי ייצור ההתקן Microfluidic. טבלה זו מציגה רשימה של התקנים microfluidic שנמצאים בשימוש בזרימת העבודה SiC-seq שלהם במהירויות הנדרש לסיבוב photoresist ציפוי (מבוסס על מפרטי היצרן עבור 3025 SU-8).

תווית	רצף (5' > 3')
בר	GCAGCTGGCGTAATAGCGAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGNNNNNNNNNNNNNNNTAAGCCAGCCCCGACACT
DNA_BAR	CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA
P7_BAR	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCTGGCGTAATAGCG
P5_DNA	AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC
I7_READ	GCCCACGAGACGTGTCGGGGCTGGCTTA

טבלה 2: פריימר רצף.

משלימה קובץ 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 2: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

SiC-seq microfluidic זרימת העבודה יוצרת נתונים רצף הגנום בתא יחיד מתוך אלפי תאים חיידקיים. ברקודים דיגיטלי משולבים לתוך הגנום של תאים microgel-אנקפסולציה מאפשרים סיליקו deconvolution של הגדרות נתונים לקבוצות הקריאות לבר-קוד שמקורם באותו התא. ניסוי שליטה עם קהילה מיקרוביאלית של ההרכב ידוע יש צורך להעריך את הטוהר של הקבוצות ברקוד. חלק גדול של קבוצות נמוך-טוהר מציין כי שיעור עיטוף התא הוא גבוה מדי או שיש זיהום משמעותי droplet המתרחשים במהלך השלבים בעיבוד microfluidic. לפי נתוני פואסון, ברקודים של תאים צריך להיות אנקפסולציה ביחס למטרה של חלקיק 1 עבור כל 10 טיפות להגביל את הקצב של אירועים מרובים כימוס פחות מ 5% של כל טיפות שאינן ריקות. שיעור עיטוף גבוה יותר מאשר זה מגביר את שערי doublets באופן אקספוננציאלי, אז האימות של היחס כימוס במהלך תהליך dropmaking הוא בעל חשיבות קריטית. המשתמשים צריכים להיות זהירים במיוחד הסגירות של תאים מרובים ב- microgel יחיד כי קריאות של תאים שונים שיתוף אותו רצף ברקוד לא יכול להיות bioinformatically מופרדים. במקרה שתא 1 מקבל 2 ברקודים שונים, טוהר קבוצה ברקוד הוא מושפע למרות שפע מדדים מוטים בעת ספירה לפי רצף ברקוד.

זיהום צולב droplet שעלולים להתעורר גם בשל תנאי המיזוג שיוצרת. במהלך מבצע מוצלח, המכשיר המיזוג microfluidic (איור 5) ניתן לשייך מכאנית ופיקודית droplet ברקוד 1 עם 1 microgel ונפח של ריאגנט PCR. Non-אידיאלי זרימה המחירים יביא droplet זיווג-לא נכונים ratios: ברקוד 1 יכול להיות משויך עם 2 microgels, למשל. כל המחירים הזרימה הרשום בפרוטוקול נועדו להיות הערכות וצריך יותאם בהתאם סטיות במידות גאומטריה ו רביב המכשיר. למשתמשים בעלי גישה למצלמות עם יכולות הקלטה במהירות גבוהה (> מסגרות לשנייה 10,000) עליך לוודא המיזוג droplet נכונה בתחילת ובמהלך הפעולה microfluidic. משתמשים ללא גישה מצלמת מהירות גבוהה ניתן לאסוף את נפח קטן של הפלט הממוזג, באופן ידני למדוד את גודל droplet תחת מיקרוסקופ. גודל droplet צריך להיות אחיד: עודף של ברקודים שלא מוזג או טיפות microgel מציין כי שיעור reinjection צריך להיות מופחת בהתאם.

מספר כללי זהירות יש לנקוט בעת טיפול microgels ו- microdroplets כדי לשמר את שלמות שלהם. Microgels, למרות מכנית חזקה, חייב להיות מספיק מקורר לפני שבירת ושטיפת צעדים כדי להבטיח gelation מלאה. Microgels שאינה כדורית הם סימן לכך agarose לא היה נתון מספיק זמן כדי לחזק. כאשר הכביסה microgels, לסובב את המתלים למטה במהירויות הנדרשים כדי למנוע אובדן של המוצר. Agarose הידרוג בעל אינדקס השבירה מקרוב ההתאמה של מים, ייתכן שתתקשה לראות צינור²², כך שמשתמשים בקפידה צריך לזהות את הגבול ג'ל נוזלי לפני השאיפה. טיפות מים בתוך שמן רגישים coalescence על ידי הצטברות של כוחות סטטיים²³ על כפפות מעבדה, אבובים. מסיבה זו, אנו ממליצים להתייחס כל הקווים reinjection עם אקדח אנטי סטטי לפני לקרקע המשאבה וטעינה של מזרקים reinjection droplet בידיים חשופות. טיפות התמזגו גדולים ניתן להסיר על ידי סובבים לאיטם את אמולסיות בתוך מזרק ידנית כ רפה בעברית את טיפות גדולות יותר, אשר לצבור קרוב לצמרת עקב שלהם כוח גדול יותר קליל.

SiC-seq היא הטכנולוגיה הראשונה כדי להדגים את רצף הגנום בתא יחיד של > 50,000 תאים חיידקיים. פלטפורמה זו יתרונות משמעותיים בהתפוקה על גישות קיימות, ומאפשרת דגימה עמוק יותר של קהילות מיקרוביאלי הטרוגנית. עד כה, microfluidic טכנולוגיות רצף הגנום בתא יחיד המועסקים microchambers⁹ ו- microwells²⁴ לתא הבידוד, הגברה, אך עם תפוקות בטווח של רק עשרות מאות תאים. זרימה המיון של תאים בודדים לתוך⁵^,wellplates⁶ דורש אין מכשור microfluidic מיוחדים אך בעל תפוקה נמוכה באופן דומה. בהתחשב בכך דגימות קרקע ומים מהסביבה יש בדרך כלל הבדלים אלפא של > 1,000-המין רמה²⁵^,²⁶, SiC-seq יש יתרון מאוד בזכות יכולתה לדגום מספר גדול בהרבה של אורגניזמים. SiC-seq זרימת העבודה היא יכולת הסתגלות תא תשומות מעבדה התרבות, הסביבה הטבעית או גוף חי. דגימת תאים צריך רק להיות בתרחיף, ללא חלקיקים גדולים (> 10 מיקרומטר) לאבן המתאימה microfluidic אנקפסולציה. לדוגמה, שיטת הוחל בעבר למדגם של מי-ים באמצעות סדרה של שטיפת וסינון צעדים כדי לעבד מראש את התאים לפני כימוס¹⁷.

פרוטוקול SiC-seq מייצר כמות רצף נתונים דליל יחסית של כל תא ותא, לא יכול להיות מתאים עבור כל היישומים. כמה אלגוריתמים ביואינפורמטיקה כגון דה נובו הגנום הרכבה או משתנה נוקלאוטיד יחיד (SNV) מתקשר דורשים במעמקי כיסוי גבוה יותר לעבוד ביעילות. במקום זאת, ברקוד קבוצות יכולים להיות מקובצים באשכולות סיליקו מאת בטקסונומיה שיטות binning²⁷ כך אלגוריתמים יכול להיות מיושם על קבוצות גדולות של קריאות. היעילות barcoding הכוללת נמוכה יחסית של זרימת העבודה SiC-seq יכול גם להציג אתגרים במקרים בהם הזמינות של המדגם קלט נמוכה. SiC-seq מסתמך על צעד כימוס ברקוד פואסון-מבוזרות, לכן כ- 10% של התאים מקבלים ברקוד מולקולרית, הם מוגבר במהלך השלב הסופי ספריית הכנה. אמנם זה להשוות ערכות barcoding מבוסס-microdroplet¹⁰, משתמשים העובדים עם דגימות תאים יקר שיש קושי להשיג את התשואה ספריית נאותה של רצף, ייתכן שתצטרך להגדיל את מספר מחזורי PCR בגמר שלב הגברה. פתרון פוטנציאלי נוסף עבור משתמשים בעלי מומחיות microfluidic הוא למיין טיפות ברקוד חיובי לאחר השלב ה-PCR דיגיטלי, ובכך להביא את היעילות הכוללת barcoding > 85%²⁸.

כיוון עתידי פוטנציאלי SiC-seq טכנולוגיה מתאימה את זרימת העבודה עבור שימוש עם תאי יונקים, לסלול את הדרך החדשה מחקרים קליניים של תא בודד. לדוגמה, ניתוח של וריאציית עותק מספר בין אחד סרטן תאים מאי לקדם את ההבנה שלנו של התפקיד של הטרוגניות הפתולוגיה סרטן². לחלופין, שילוב SiC-seq עם שיטות קיימות בדיקה ולהעשיר רצפי DNA של עניין²⁹ תאפשר את רצף תא בודד יישוב של subpopulations או זנים נדירים של תאים. עם דגימות סביבתיים, הגנים בתוך מסלול מטבולי ידוע יכול להיות ממוקד וניתח התרגום לצד השכנה גנים לזהות את הרומן איי גנומית. מ בתוך סביבה הפונדקאי. האנושי, חיידקים פתוגניים כייל נמוך יכול להיות מבודד ודוגמאות וסודרו ברמת תא בודד כדי לבחון יותר מקרוב את מקורם genotypic של התקפה אלימה.

Disclosures

הפטנטים הנוגעים זרימת עבודה זו עשוי להיות מורשה ביו המשימה, של אבטה רבי איזה אדם הוא מניות.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע דרך פרס הקריירה (גרנט מספר DBI-1253293); במכון הלאומי של בריאות (NIH) (מענק מספרים HG007233-01, R01-EB019453-01, 1R21HG007233, DP2-AR068129-01, R01-HG008978); והתוכנית הגנה מתקדמת מחקר פרויקטים סוכנות חיים יציקה (חוזה מספרים HR0011-12-C-0065, N66001-12-C-4211, HR0011-12-C-0066).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3" silicon wafers, P type, virgin test grade	University Wafers	447
SU-8 3025 photoresist	Microchem	17030192
Spin coater	Specialty Coating Systems	G3P-8
Photomasks	CadArt Servcies	(custom)	See Supplemental Files for mask designs
PGMEA developer	Sigma-Aldrich	484431
Isopropanol	Sigma-Aldrich	109827
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Krayden	4019862
Degassing chamber	Bel-Art	42025
0.75 mm biopsy punch	World Precision Instruments	504529
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm)	Corning	294775X50
Aquapel (hydrophobic glass treatment)	Pittsburgh Glass Works	47100
PE-2 polyethylene tubing	Scientific Commodities	B31695-PE/2
1 mL syringes	BD	309628
27 gauge needles	BD	305109
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-501
Novec HFE-7500 fluorinated oil (HFE)	3M	98-0212-2928-5
FC-40 fluorinated oil	Sigma-Aldrich	F9755
PEG-PFPE surfactant	Ran Biotechnologies	008-FluoroSurfactant
Space heater	Lasko	CD09250
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	a9414
TE (10X)	Rockland	mb-007
PBS 1X, pH 7.4	E&K Scientific Products	EK-65083
OptiPrep (density gradient medium)	Sigma-Aldrich	d1556
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)	Sigma-Aldrich	370533
Span 80 (sorbitane monooleate)	Sigma-Aldrich	s6760
Hexane	Sigma-Aldrich	139386
Tween 20 (polysorbate 20)	Sigma-Aldrich	p2287
Lysozyme Type IV	MP Biomedicals	195303
Mutanolysin	Sigma-Aldrich	M9901
Zymolyase (yeast lytic enzyme)	Zymo Research	e1004
Lysostaphin	Sigma-Aldrich	L7386
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Tris-HCl, pH 7.5, 1M	Invitrogen	15567-027
Dithiothreitol (DTT)	Teknova	d9750
Lithium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L9781
Proteinase K	New England Biosciences	P8107S
Ethanol, 200 Proof (100%)	Koptec	V1001
SYBR Green I (nucleic acid stain)	Invitrogen	S7563
PEG 6k	Sigma-Aldrich	81260
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	t8787
Nextera DNA Library Prep Kit	Illumina	FC-121-1030
Phusion Hot Start Flex Master Mix (High-Fidelity Hot Start Master Mix)	New England Biosciences	m05365
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)	Applied Biosystems	4464263
Warmstart 2.0 Bst Polymerase (isothermal polymerase)	New England Biosciences	m0538m
NT buffer from Nextera XT kit (neutralization buffer)	Illumina	FC-131-1024
Cold cathode fluorescent inverter	(custom)	(custom)
DC power supply	Mastech	HY1503D
Zerostat 3 anti-static gun	Milty	5036694022153
3D-printed centrifuge syringe holder	(custom)	(custom)	See Supplemental Files for 3D print file
Zymo DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003

References

Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
Ni, X., et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21083-21088 (2013).
Schmidt, H., Hensel, M. Pathogenicity islands in bacterial pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews. 17, 14-56 (2004).
Martínez, J. L., Baquero, F. Interactions among strategies associated with bacterial infection: pathogenicity epidemicity, and antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 647-679 (2002).
Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9 (5), 1038-1048 (2014).
Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. Journal of the Royal Society Interface. 5 (24), 671-690 (2008).
Xu, L., Brito, I. L., Alm, E. J., Blainey, P. C. Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods. 13 (9), 759-762 (2016).
Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (50), 17947-17952 (2014).
Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
Rotem, A., et al. High-throughput single-cell labeling (Hi-SCL) for RNA-Seq using drop-based microfluidics. PLoS One. 10 (5), 1-14 (2015).
Amini, S., et al. Haplotype-resolved whole-genome sequencing by contiguity-preserving transposition and combinatorial indexing. Nature Reviews Genetics. 46 (12), 1343-1349 (2014).
Zheng, G. X. Y., et al. Haplotyping germline and cancer genomes with high-throughput linked-read sequencing. Nature Biotechnology. 34 (3), 303-311 (2016).
Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nature Communications. 7, 11784 (2016).
Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
Lan, F., Demaree, B., Ahmed, N., Abate, A. R. Single-cell genome sequencing at ultra-high-throughput with microfluidic droplet barcoding. Nature Biotechnology. 35 (7), 640-646 (2017).
Novak, R., et al. Single-cell multiplex gene detection and sequencing with microfluidically generated agarose emulsions. Angewandte Chemie Internation Edition. 50 (2), 390-395 (2011).
Gill, C., Van De Wijgert, J. H. H. M., Blow, F., Darby, A. C. Evaluation of lysis methods for the extraction of bacterial DNA for analysis of the vaginal microbiota. PLoS One. 11 (9), 1-16 (2016).
Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome Research. 24 (12), 2033-2040 (2014).
Abate, A. R., Chen, C. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
Jain, A., Yang, A. H. J., Erickson, D. Gel-based optical waveguides with live cell encapsulation and integrated microfluidics. Optic Letters. 37 (9), 1472 (2012).
Karbaschi, M., Shahi, P., Abate, A. R. Rapid chemical-free breaking of microfluidic emulsions with a hand-held antistatic gun. Biomicrofluidics. 11 (4), 1-6 (2017).
Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nature Biotechnology. 31 (12), 1126-1132 (2013).
Chao, Y., et al. Metagenomic analysis reveals significant changes of microbial compositions and protective functions during drinking water treatment. Scientific Reports. 3 (1), 3550 (2013).
Fierer, N., et al. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), 21390-21395 (2012).
Mande, S. S., Mohammed, M. H., Ghosh, T. S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges. Briefings in Bioinformatics. 13 (6), 669-681 (2012).
Eastburn, D. J., et al. Microfluidic droplet enrichment for targeted sequencing. Nucleic Acids Research. 43 (13), e86 (2015).
Clark, I. C., Abate, A. R. Finding a helix in a haystack: nucleic acid cytometry with droplet microfluidics. Lab on a Chip. 17 (12), 2032-2045 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135 microdroplets metagenomics barcoding

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: