JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Hydrogels מהונדסים חלבון רקומביננטי הן ממינוי תרבית תאים 3D הם מאפשרים tunability מלאה של עמוד השדרה פולימר ולכן, microenvironment את התא. כאן, אנו מתארים התהליך של היטהרות חלבון רקומביננטי כמו אלסטין ויישומו בחיי הידרוג 3D תא אנקפסולציה.

Abstract

טכניקות מימדי תרביות רקמה (2D) היה חיוני להבנת ביולוגיה של התא הבסיסי. עם זאת, היעדר מערכות התרבות המסורתית של רקמות 2D מטריצה תלת מימדי (3D), וכתוצאה מכך משמעותי נתק בין תוצאות נאסף במבחנה ו vivo בתוך. כדי לטפל מגבלה זו, החוקרים היה לתכנן פלטפורמות תרביות רקמה הידרוג תלת-ממד שיכולים לחקות את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של microenvironment תא ויוו . מחקר זה הניעה את הצורך לפתח פלטפורמות גשמי התומכים תא 3D כימוס של מבחני הביוכימי במורד הזרם. חלבון רקומביננטי הנדסה מציעה ערכת כלים ייחודיים הידרוג תלת-ממד גשמי עיצוב ופיתוח על-ידי מתן שליטה מסוימת של חלבון רצף ולכן, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני תוצאות מטריקס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly אלסטין, כמו חלבון (ELP), אשר יכול לשמש כדי hydrogels טופס עם תכונות מכניות באופן עצמאי tunable וריכוז ליגנד תא-דבק. בהמשך אנו מציגים מתודולוגיה תא אנקפסולציה בתוך אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels ומוטבעים מכתים immunofluorescent עוקבות של תאים עבור ניתוח במורד הזרם כמת.

Introduction

במהלך המאה האחרונה, מימדי תרביות רקמה (2D) התפתחה כלים אינטגרלי ללמוד תא יסוד ביולוגיה במבחנה. בנוסף, הפרוטוקולים יחסית נמוכים ופשוטים לקבלת תרבית תאים 2D הובילו האימוץ שלה על פני תחומים רבים ביולוגי ורפואי. עם זאת, מחקרים שנעשו בעבר הראו כי פלטפורמות 2D מסורתי עשוי להוביל לתוצאות כי לסטות בצורה ניכרת האלה שנאספו ויוו, גורם זמן יקר ומימון מבוזבז עבור מחקר קליני מונחה1,2, 3. אנחנו ואחרים משערים כי אי-התאמה זו לייחס חוסר רמזים הביוכימי, biophysical יליד מסופקים על התאים תרבותי על משטחים 2D, אשר יכול להיות הכרחי עבור הפצת אופטימלית, ההבשלה של סוגי תאים שונים.

כדי לטפל אלה גשר מגבלות ולעזור הפער בין 2D מחקרים במבחנה , ויוו , חוקרים יש פלטפורמות מפותחת הידרוג תלת מימדי (3D) התא-כימוס1,4,5 ,6. Hydrogels הם חומרים אידיאלי כדי לסכם את microenvironment אנדוגני של ה מטריצה חוץ-תאית (ECM) ויוו עקב שלהם תכונות מכניות רקמה דמוית ומבנה נפוחות-מים המאפשרת מעבר מהיר של חומרים מזינים, איתות גורמים7,8. יתר על כן, 3D hydrogels ניתן לעצב יש שליטה עצמאית על מאפייני מכני וביוכימי לגרדום. מטריקס מכניקה9,10,11,12 והן תא-דבק ליגנדים13,14,15 ידועים להשפיע על התא התנהגות במבחנה , ויוו. לפיכך, hydrogels 3D עם מאפיינים tunable מציעים פלטפורמה כדי לחקור את היחסים סיבתי בין תאים microenvironment שלהם. קריטריונים עבור מטריצה הידרוג 3D אידיאלי כוללים תא פשוט, שאינו-ציטוטוקסיות-כימוס, כמו גם tunability עצמאית של תכונות מכניות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, מחקה של מוטיבים תא-דבק מקורית.

שניהם סינתטיים (למשל., פוליאתילן גליקול, חומצה polylactic, פוליפוני (חומצה גליקולית)), נגזר באופן טבעי (למשל., alginate, קולגן, Matrigel) hydrogels יש יתרונות על פני 2D in vitro לקשרי תרבות פלטפורמות; עם זאת, יש להם גם חסרונות משמעותיים אשר להגביל את התחולה שלהם. הראשון, פלטפורמות רבות סינטתיים, נגזר באופן טבעי לדרוש תנאים קשים crosslinking יכול להיות רעיל לתאים בתרבית של, מה שהוביל ירדה תא הכדאיות7. בנוסף, פלטפורמות סינתטיים רבים חוסר אתריים מקורית ויש צורך להיות functionalized דרך משני תגובות כימיות, אשר יכול להוסיף את העלות והמורכבות מוגברת16. לבסוף, בעוד חומרים באופן טבעי-derived מכילים בדרך כלל מהותי בתחומים ביו-אקטיביות, הם לעיתים קרובות מוטרדים על ידי השתנות אצווה-כדי-אצווה גבוהה, לעיתים קרובות מוגבלות ויוצרים ג'לים חלשה יחסית7,17.

חלבון רקומביננטי הנדסה מציג ערכת כלים ייחודיים לעיצוב חומרים על-ידי מתן שליטה מפורשת על חלבון רצף, לפי סיומת, פוטנציאל מכני וביוכימי מאפייני הידרוג הסופי לגרדום18. בנוסף, באמצעות מינוף המנגנון הביולוגי הידוע של Escherichia coli (e. coli) לבטא חלבונים, חומרים יכול להיות מיוצר באופן חסכוני ועקבי עם השתנות מוגבל אינטר - ו אינטרה-אצווה. החלבון כמו אלסטין (ELP) המוצג כאן יש שלושה תחומים מהונדסים: (1) T7 ו His6 תג מאפשר תיוג ויה fluorescently מתויג נוגדנים, (2) אזור 'אלסטין דמוי' מקנה תכונות מכניות אלסטית ומאפשרת עבור חומר כימי crosslinking, ו- (3) אזור 'ביו-אקטיבי' מקודד עבור התא-דבק מוטיבים.

באזורנו אלסטין דמוי מבוסס על רצף הקנוני של אלסטין5 (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) שבו ארבעה מתוך 'Xaa' חומצת אמינו באתרים איזולאוצין (Ile), אבל יכול להיות מתוכנן להיות כל חומצה אמינית פרט פרולין. רצף זה מעניק ELPs רקומביננטי עם התחתון התנהגות טמפרטורה (LCST) פתרון קריטי שעלולים להיות מנוצלים לרעה לביטוי שלאחר טיהור פשוטה באמצעות תרמית רכיבה על אופניים19,20. בית מלון LCST זה ניתן לכוונן אותו תרמית צבירה בטמפרטורות שונות על-ידי שינוי של חוות 'Xaa' שאריות21,22.

כאן, עמדה 'Xaa' על אחד חוזר כמו אלסטין חמש הוחלף את הצגת amine ליזין (Lys) חומצת אמינו, אשר מנוצל עבור הידרוג crosslinking. העבודות הקודמות שלנו הראו crosslinking הלא-ציטוטוקסיות וחזק באמצעות תגובה עם כלוריד (THPC)23phosphonium tetrakis (hydroxymethyl) crosslinker אמין-ריאקטיבי. מאת בדרגות שונות הכוללת חלבון התוכן crosslinker ריכוז, אנו מסוגלים לייצר hydrogels זה ניתן לכוונן אותו span של נוקשות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית טווח (~0.5-50 kPa)9,23,24. בנוסף כוונון תכונות מכניות, התא אדהזיה בתוצאות הידרוג מן השילוב של תחומים תא-דבק קאנונית בתוך עמוד השדרה של החלבון אמרסון, לייק ופאלמר. לדוגמה, שילוב של מורחבים נגזר fibronectin 'RGDS' חומצת אמינו הרצף מאפשר תא הידבקות וגמישות הסתגלותי, ואילו מקושקשות, מחייב 'RDGS' משתנה מגבילה את תא-מטריקס אדהזיה24. מאת להתכוונן על היחס של התא-דבק חלבונים ללא דבק, כמו גם ריכוז החלבון הכולל, אנו מסוגלים לייצר ביעילות hydrogels שיימתחו מגוון רחב של ליגנד ריכוז. . Resultantly, פיתחנו פלטפורמה הידרוג עם decoupled נכסים הביוכימי, biophysical, אשר ניתן לכוונן באופן עצמאי לתרבות 3D אופטימלית של סוגי תאים שונים.

בנוסף נוקשות מטריקס וליגנד דבק tunability, hydrogels רקומביננטי מציעים את היכולת פרופילים ספציפיים השפלה גשמי עיצוב, אשר הכרחי תא התפשטות, התפשטות של הגירה בתוך ההקשר 3D4 , 9. את ההשפלה הזו המוענקת על ידי הפרשת תא פרוטאזות שמתמקדים 'RGDS' מורחבת9 או רצף אלסטין דמוי25. אמרסון, לייק ופאלמר hydrogels יש גם הוכח כדי לתמוך את מבחני הביוכימי עוקבות הדרושים ללימוד תא הכדאיות ותפקוד כולל immunocytochemistry, כמו גם מיצוי DNA/RNA/חלבון עבור הפוכה כמותיים תמלול-תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) והמערבית כתם9. אמרסון, לייק ופאלמר משתנים גם השתמשו במספר דגמים ויוו , ידועים להיות נסבל היטב על ידי המערכת החיסונית26.

יחדיו, אמרסון, לייק ופאלמר כמו פלטפורמה גשמי ללימודי תא-כימוס מציע מגוון רחב של יתרונות בהשוואה פלטפורמות חומרים סינתטיים או נגזר באופן טבעי, אשר לעתים קרובות חוסר באותה מידה של tunability הביוכימי, הביו-פיסיקלי ו הפארמצבטית. בנוסף, פשוטה-ציטוטוקסיות לשימוש של אמרסון, לייק ופאלמר עם מגוון רחב של סוגי תאים (למשל., צ'יק העזוב שורש הגרעינים14,24, מאתר קדמון עצבית תאים9,27, שור תאי גזע אנושי mesenchymal neonatal chondrocytes28, האדם אנדותל תאים29,30) מאפשר מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית של ECM 3D אנדוגני בהשוואה תרבית תאים 2D. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי נגזר recombinantly, ELPs לשימוש כפלטפורמה הידרוג tunable 3D תא אנקפסולציה. בהמשך נציג את המתודולוגיה תיוג פלורסנט למטה-stream, מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים שעברו אנקפסולציה.

Protocol

1. לשכנו ביטוי בפרוטוקול

  1. יום 1: גידול המושבה starter
    1. להכין פלטות אגר אמפיצילין, כלורמפניקול מאת autoclaving 25 גר' לוריא ציר 15 גרם של אגר לכל 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. ברגע הפתרון הוא מקורר עד ~ 60 ° C, להוסיף 1 מ"ל של מניות אמפיצילין (100 מ"ג/מ"ל מים הנדסה גנטית) ו- 1 מ"ל כלורמפניקול מניות (34 מ"ג/מ"ל אתנול 70%) 1 ליטר של אגר לפתרון הסופי ריכוזי µg 100/mL µg 34/mL , בהתאמה. 20 מ של הפתרון הסופי להעביר צלחות פטרי 10 ס מ עם פיפטה סרולוגית ולאפשר את אגר לגבש. לעטוף את צלחות פטרי עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב 4 º C.
      הערה: צלחות פטרי שניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבועיים.
    2. פסים מדגם קטן של BL21 (DE3) pLysS e. coli מן מניה חיידקי מוכנות מראש שמכיל וקטור pET15b קידוד של אמרסון, לייק ופאלמר עניין על צלחת אגר אמפיצילין, כלורמפניקול.
      הערה: בחר אמפיצילין, כלורמפניקול לחיידקים המכילים וקטורים הן pET15b והן pLysS, בהתאמה.
    3. למקם את הצלחת מרוחים במהופך בתוך אינקובטור ב 37 º C. לאפשר מושבות חיידקים לגדול בין לילה.
      הערה: לא דגירה הלוחות יותר מ 16 h כפי אמפיצילין תגרע והוא המושבות שאין עליו אמפיצילין ההתנגדות יכול ליצור.
  2. יום 2: הכנה של המדיה והתרבות ביטוי starter
    1. הסר את התרבות החיידק החממה. מצלמות-מיקרוסקופים הצלחת וחנות לתקופה מקסימלית של 4 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.
    2. להכין בקבוקון תרבות המתנע (250 מ"ל), הביטוי תרבות מבחנות (12 x 1 L) אוטוקלב. עבור 1 ליטר של אמצעי ביטוי, להוסיף 1 ליטר של מים הנדסה גנטית בבקבוקון תרבות במבוכה 2 L g 47.6 מרק נהדר ו- 4 מ"ל של גליצרול, קאפ ברדיד אלומיניום.
      הערה: התשואות טיפוסי הם 60-100 mg/L חלבון אמצעי ביטוי.
    3. לטעון המתנע בלוק לתוך החממה חזק מראש ומחוממת, של 37 ° C, דגירה בלי עצבנות.
    4. להוסיף µL 250 סטרילי-מסוננים (מסנן מיקרומטר 0.22) אמפיצילין מניות (100 מ"ג/מ"ל מים הנדסה גנטית) תרבות starter של ריכוז סופי של 100 µg/mL. מיד מתחילים לזעזע את התרבות starter-250 סל"ד.
      הערה: כלורמפניקול משמש רק עבור המושבה הבחירה על פלטות אגר, איננה כלולה במחיר בעבור תרבויות נוזלי.
    5. לחסן את התרבות starter על-ידי הוספת לשכנו פלסמיד המכיל e. coli שמושבה בודדת מהצלחת מרוחים ולאפשר את התרבות starter לרעוד ב 37 ° C עבור 16 h.
    6. למקם את המדיה תרבות ביטוי מבחנות לתוך מראש להתחמם, 37 ° C רועד חממות, דגירה בין לילה בלי עצבנות כך המבחנות מוכנים לחסן למחרת בבוקר.
  3. יום 3: גרימת ביטוי חלבון ב e. coli
    1. להפוך את המניות אמפיצילין טריים, סטרילי-מסוננים (100 מ"ג/מ"ל מים הנדסה גנטית). להוסיף 1 מ"ל של מניות אמפיצילין את הבקבוק כל אמצעי הביטוי עבור ריכוז סופי של 100 µg/mL.
    2. מתחילים לזעזע התקשורת ביטוי ב 250 סל"ד.
    3. לקחת דגימה 2 מ"ל של אמצעי התקשורת מן הבקבוק כל ביטוי ולהוסיף cuvette ריקים צפיפות אופטית קורא 600 nm (OD600).
    4. לאחר השלמת 16 h starter תרבות דגירה, לחסן את הבקבוק. ביטוי לכל על ידי העברת 20 מ"ל של התרבות starter בכל הבקבוק ביטוי באמצעות פיפטה סרולוגית.
    5. לאחר השלמת 1 h עצבנות, למדוד את יתר600 באחת המבחנות הביטוי. לאחר שלב זה, למדוד את יתר600 כל 20 דקות, בודקים בקבוקון שונה בכל פעם.
    6. בבית יתר600 של 0.6, להפחית את הטמפרטורה של כלי המכיל המבחנות ביטוי ל 32 מעלות צלזיוס.
    7. בדוק את יתר600 כל 10 דקות. בבית יתר600 של 0.8, זירוז הביטוי על-ידי הוספת 1 מ"ל של 1 מ', סטרילי-מסוננים β-איזופרופיל thiogalactoside (IPTG) במים הנדסה גנטית כדי הבקבוק כל ביטוי.
    8. לאפשר את e. coli ב ביטוי מבחנות לבטא במשך 7 שעות.
    9. 20 דקות לפני הסוף של הביטוי, מראש מגניב צנטריפוגה רצפות גדולים עד 4 ° C.
    10. לאסוף את כל 12 L של הביטוי מדיה לתוך צנטריפוגה בודדים מכולות ואיזון.
    11. Centrifuge התקשורת ביטוי-> g 12,000 x למשך 15 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגה קומה.
    12. יוצקים את תגובת שיקוע של כל מיכל צנטריפוגה. בעזרת מרית, לאסוף את כדורי תא לתוך שקית נעילת מיקוד שנשקל מראש.
    13. מחדש להשעות את צניפה במאגר סטרילי-מסוננים עשר (100 מ של מאגר לכל 25 גר' גלולה), להסיר את כל הבועות אוויר עודף על ידי עיסוי בגדר. עבור 1 ליטר של מאגר עשר, להוסיף 5.8 גר' נתרן כלורי, 1.21 g של טריס הבסיס ו- 0.37 גרם ethylenediamine tetraacetic חומצה (EDTA) ניתרן מלח וגופרית והרכבו 900 מ ל מים הנדסה גנטית. להתאים את ה-pH ל 8.0 ולהביא 1 ל' בשלב זה, חומציות מספיקים.
    14. מניחים את השקית נעל-zip המכיל בגדר תא מושעה מחדש לתוך מכולה משני ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. יום 4-6: פקיעת הקיר תא החיידק באמצעות הפשרת ההקפאה מחזורים
    1. להסיר בגדר קפוא מהמקפיא, לאפשר לו להפשיר באיטיות ב 4 ° C עם עצבנות עדין משתמש של תפקודי לב / נשימה.
    2. לאפשר בגדר להפשיר עד כמה נוזל קיים. להוסיף ~ 30-40 מ ג של deoxyribonuclease (DNase) כדי יודע lysate. בנוסף, להוסיף 1 מ"ל של 100 מ מ phenylmethylsulphonyl פלואוריד (PMSF; מעכב פרוטאז) אלכוהול איזופרופיל לכל 100 מ של תא lysate. אפשר את lysate לנער בן לילה.
      הערה: הוספת DNase ו PMSF נחוץ רק עבור מחזור הפשרת ההקפאה הראשונה.
      התראה: PMSF הוא רעיל אם נשאף. מסיכת פנים אמור לשמש בעת טיפול אבקת PMSF.
    3. ברגע lysate התא מופשר הוא לחלוטין, להקפיא את lysate ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד קפוא לגמרי.
    4. חזור על הליך ההקפאה-הפשרה בסך הכל בשלושה מחזורים. להשאיר את lysate הקרת ב 4 ° C לאחר ההפשרה אחרונה ההקפאה. חנות µL 100 של raw lysate לניתוח נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) בסיומו של טיהור.
    5. לאחר ההפשרה האחרון, להתאים את רמת החומציות של המופשרים lysate כדי 9.0 באמצעות 1 M NaOH. בשלב זה, חומציות מספיקים. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה (בן לילה הוא המתאים) על תפקודי לב / נשימה.
  5. יום 7-9: לשכנו טיהור באמצעות אופניים תרמי ספין קרים וחמים
    1. מגניב לצנטריפוגה קומה 4 מעלות 20 דקות לפני צנטריפוגה.
    2. Aliquot ואיזון המופשרים lysate לתוך צנטריפוגה מיכלים.
    3. Centrifuge את הדגימות-> g 15,000 x עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. חנות µL 100 של תגובת שיקוע לניתוח מרחביות-דף לאחר השלמתו של טיהור.
      הערה: לאחר, צריך שתוציאו החלבון לשכנו יישאר בבית תגובת שיקוע עקב מסיסות גבוהה שלה במים בטמפרטורה שמתחת LCST שלה (< 32 ° C).
    4. להעביר את תגובת שיקוע מכולות צנטריפוגה חדש ולאזן כראוי.
    5. להוסיף נתרן כלורי (NaCl) בשלושה חלקים ריכוז סופי של 1 מ' (5.84 g של NaCl עבור כל 100 מ של תגובת שיקוע). לוודא NaCl מתווספת בשלושה חלקים כדי לאפשר פירוק מספיקות.
    6. להתסיס עבור h 3 ב 37 ° C-250 סל"ד ב חממה חזק.
    7. h 1 לפני סוף עצבנות, לחמם צנטריפוגה קומה עד 37 מעלות צלזיוס.
    8. צנטריפוגה > g 15,000 x עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. חנות µL 100 של תגובת שיקוע לניתוח מרחביות-דף לאחר השלמתו של טיהור וזורקים את תגובת שיקוע הנותרים.
      הערה: לאחר, צריך שתוציאו החלבון בילדיו צריך להיות מגורען עקב שלה מסיסות נמוכה במים בטמפרטורות מעל LCST שלה (> 32 ° C).
    9. מחדש להשעות את צניפה על-ידי הוספת 10 מ"ל מים בלוק, הנדסה גנטית לאדם 1g של גלולה. להשתמש במרית מתכת מועכים בגדר כדי לסייע פירוק החלבון.
    10. התאם את רמת החומציות של המופשרים lysate כדי 9.0 באמצעות 1 M NaOH. בשלב זה, חומציות מספיקים.
    11. להתסיס בן לילה-4 מעלות צלזיוס על תפקודי לב / נשימה.
    12. חזור על הפעולות אופניים תרמי ספין קרים וחמים עבור סכום של שלושה מחזורי (כלומר., חזור על שלבים 1.5.1 דרך 1.5.11 שלושה מחזורים סה כ).
  6. יום 10-15: לשכנו דיאליזה, lyophilization
    1. Centrifuge בגדר תנאי מחדש ומפרידה טרום מקורר-> g 15,000 x עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. חנות µL 100 של תגובת שיקוע לניתוח מרחביות-דף לאחר השלמתו של טיהור.
    2. Desalt הפתרון חלבונים על-ידי dialyzing את תגובת שיקוע הנותרים קרום דיאליזה 3.5 kDa נגד 4 ליטרים של מים הנדסה גנטית טרום מקורר-4 מעלות צלזיוס. להחליף את המים דיאליזה פעמיים ביום עבור סכום כולל של 6 פעמים מעל 3 ימים.
      הערה: כרכים supernatant טיפוסי הם בין 5 ל 30 מ"ל.
    3. Centrifuge הפתרון dialyzed ומפרידה טרום מקורר-> g 15,000 x עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. חנות µL 100 של תגובת שיקוע לניתוח מרחביות-דף בסוף הטיהור.
    4. להקפיא וכתוצאה מכך supernatant ב-80 מעלות צלזיוס צינורות חרוט שנשקל מראש.
    5. Lyophilize הפתרון קפוא במשך 3 ימים והמסה המוצר הסופי כדי לקבוע את התשואה חלבון.
    6. מצלמות-מיקרוסקופים הצינורות המכילים הסופי lyophilized החנות והמוצרים לשכנו ב 4 º C.
    7. לפעול למען חברה דמוקרטית-דף כדי לקבוע את הטוהר של החלבון.
      הערה: פרוטוקולים עבור מרחביות-דף ישתנו בהתבסס על תנאים ג'ל agarose ספציפיים. לניסויים שלנו, חלבון lyophilized הסופי היה התפרקה על ריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל מים יונים, לרוץ במהירות 140 V 70-100 דקות בג'ל אקרילאמיד 12% (w/v) תחת תנאים denaturing.

2. התא כימוס ב- 3D אלסטין, כמו חלבון Hydrogels

  1. הכנת תבניות סיליקון
    1. השתמש אגרוף ביופסיה לקוטר הרצוי כדי ליצור חורים בסדין סיליקון בעובי 0.5 מ מ, לגזור ריבוע סביב כל חור. חזור עבור מספר תבניות הרצוי.
      הערה: קוטר ועובי של התבניות יכול להיות מותאם כדי להפוך את יישום מסוים התנאים התרבות תאים. בפועל, עבור תרביות תאים של 50 106 תאים למ"ל, תבניות בעובי 0.5 מ מ עם 4 מ"מ ו 5 מ מ קטרים מומלצים עבור ה-DNA/RNA מספיק והפקת חלבונים, בהתאמה. עבור immunostaining, אגרוף ביופסיה 2 מ מ יכול לשמש במקום ליצור שלושה חורים סמוך לכל עובש מרובע כך משכפל שלוש יכול להיות צבעונית לכל טוב.
    2. הסר ניילון נצמד בכל צד של העובש בודדים עם פינצטה.
      הערה: יש להימנע ממגע עם משטח סיליקון חשוף כמו זיהום יכול להפחית בעתיד פלזמה מליטה יעילות.
    3. באמצעות פינצטה, סדר את אותו מספר של תבניות סיליקון חשופות, coverslips זכוכית דקה (מס ' 1, בקוטר 12 מ מ) לסירוגין שורות על המכסה הפוך של צלחת 48-. טוב. עם סיום, לכסות את המכסה של לוח 48-טוב כדי למנוע זיהום.
    4. חמצן פלזמה מתייחסים המכסה כל צלחת 48-טוב (כלומר., בתבניות ושקופיות זכוכית). מיד לאחר מכן, השתמש מלקחיים להיפוך כייר סיליקון על גבי coverslip זכוכית סמוכים. לחץ בחוזקה על העובש כדי להבטיח מליטה. תן התבניות דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
      הערה: משך הטיפול פלזמה חמצן משתנה בהתאם לכלי המשמש. תנאים אופייני לכלי שלנו הם חלון הפעלה של לחץ גז בין 0.3-4 mbar, זרימת גז חמצן-20 ס מ3/min, וחשיפה מדגם פלזמה עבור s 10-20.
    5. לעקר את התבניות על-ידי autoclaving. לאחסן התבניות בטמפרטורת החדר בסביבה סטרילית עד השימוש.
      הערה: התבניות שבהן ניתן לאחסן בשלב זה ללא הגבלת זמן.
  2. הכנה של פתרון מניות אלסטין, כמו חלבון
    1. הסר בילדיו lyophilized אחסון 4 ° C. חם החלבון לטמפרטורת החדר לפני פתיחת צינור כדי להבטיח עיבוי לא בונה על החלבון על פני שימוש חוזר.
    2. להמיס בילדיו באגירה פוספט תמיסת מלח של Dulbecco (DPBS) ב 4 ° C עם עצבנות מתמדת (כלומר., המסתובבים) בין לילה.
      הערה: ריכוז פתרון מניות לשכנו עוד יותר לדלל אותו עם התוספת של פתרון crosslinker יחס נפח על-ידי המשתמש. לדוגמה, עבור 3% (w/v) הסופי ריכוז לשכנו, להכין 3.75% (w/v) לשכנו מניות פתרון זה להיות מדולל ביחס 4:1 הנפחי של אמרסון, לייק ופאלמר פתרון: crosslinker פתרון. התאם את הריכוז ככל הדרוש עבור היישום הרצוי.
    3. מסנן סטרילי לשכנו הפתרון מניות באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. לאחסן לשכנו על הקרח כאשר אינו בשימוש.
  3. ב אבטחה הקבינט, להעביר את התבניות סטרילי באמצעות פינצטה סטרילי אל צלחת 24-ובכן רקמות-תרבות.
  4. הכנה של פתרון מניות THPC
    1. לדלל THPC, DPBS מוקדמת פשוט לשימוש. התאם את ריכוז THPC פתרון על פי ריכוז לשכנו הסופי הרצוי crosslinking יחס.
      הערה: עבור הפרוטוקול, ריכוז לשכנו הסופי של 3% (w/v) ייעשה על ידי ערבוב הפתרון מניות לשכנו עם הפתרון THPC ביחס נפח של 4:1. להתאים לפי הצורך.
    2. להוסיף µL 2.6 בפתרון THPC (80% במים) µL 997.4 של DPBS.
      הערה: בריכוז זה של THPC מקביל יחס 1:1 stoichiometric של קבוצות מתיל הידרוקסי THPC ו אמינים העיקרי על חלבון לשכנו בעת ערבוב פתרונות-היחס הנפחי 4:1 שתואר עבור הידרוג לשכנו הסופי 3% (w/v). הפתרון THPC צמיגה, טיפות של פתרון עשוי להישאר בצד של קצה פיפטה. עבור ריכוזים מדויק, להימנע טיפות כאלה כאשר דילול לתוך DPBS. ניקוי המכולה מניות THPC עם גז חנקן למניעת חמצון של פוספין איון של crosslinker.
    3. מערבולת הפתרון לערבב ולשמור על קרח.
    4. מסנן סטרילי THPC במניה הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. לדלל את THPC מניות פתרון נוסף עם DPBS סטרילי כדי להשיג יחס stoichiometric crosslinking התחתון (למשל-, 0.5:1 או 0.75:1).
      הערה: THPC הוא רגיש חמצן, הפתרון מדולל אמור לשמש בתוך מספר שעות לאחר ההכנה.
  5. מביצועם התאים על ידי דגירה עם טריפסין-EDTA להשעיה תא בודד, גלולה התאים, ולספור את התאים מחדש מושעה בינוני באמצעות hemocytometer.
    הערה: פרוטוקולים המדויק עבור שלב זה יהיה תלוי בכבדות סוג התא הרצוי ויישום. עבור התאים העצביים קדמון בשימוש בכל רחבי פרוטוקול זה, נערך דגירה טריפסין-EDTA 0.025% בטמפרטורת החדר למשך דקות 1.5. התאים היו מגורען ב g x 200 למשך 2 דקות. עבור תאים מוגברת הכדאיות, תאים המחבוש בתנאים נורמליים בינוני. צפיפויות תא אופייני המשמש תא כימוס נע בין 1-50 106 תאים למ"ל נפח הידרוג הסופי. להתאים לפי הצורך.
  6. Aliquot מספר תאים לתוך שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 סטרילי הרצוי.
  7. Centrifuge התאים ב- g x ~ 200 עבור 3 מינימלית בקפידה, וארוקן את תגובת שיקוע ולשמור בגדר תא על קרח.
    הערה: חיוני לרוקן לחלוטין את כל תגובת שיקוע כדי להמתיק דילול נוסף אמרסון, לייק ופאלמר, THPC crosslinker. מהירות צנטריפוגה ספציפית משתנה עם סוג התא.
  8. להשעות מחדש בגדר תא בפתרון מניות לשכנו, כך שאמצעי האחסון 80% נפח סופי (בהנחה יחס של 4:1 של אמרסון, לייק ופאלמר פתרון: THPC פתרון). פיפטה מיקס 20 - 25 פעמים כדי ליצור תערובת הומוגנית של תאים אמרסון, לייק ופאלמר.
    הערה: להימנע כשתפסת התחתון של צינור כדי להמתיק בטמפרטורה של מעבר פאזה עוקבות של אמרסון, לייק ופאלמר. כל עובש 2 מ מ עם משכפל שלוש דורש µL 7.5 נפח סופי (כלומר., 6 µL של אמרסון, לייק ופאלמר פתרון מניות ו- 1.5 µL של פתרון מניות THPC) מחולק באופן שווה לתוך החורים 3 (כלומר., 2.5 µL נפח סופי לכל חור). עבור התבניות 4 ו- 5 מ"מ, נפח סופי של 7.5 µL ו- 15.5 µL נדרש, בהתאמה.
  9. להוסיף פתרון מניות THPC התליה תא/לשכנו עבור אמצעי האחסון האחרון 20% הנותרים. פיפטה מיקס 20 - 25 פעמים כדי ליצור תערובת הומוגנית.
  10. מיד pipette את אמצעי האחסון הסופית המתאימה של תערובת תא/בילדיו/THPC לתוך כל עובש על ידי תנועה מעגלית. חזור על כל תבניות.
  11. דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ואחריו דגירה נוספים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    הערה: תקופת הדגירה הראשון תסייע להקל crosslinking הראשונית של הידרוג לפני הגדלת הטמפרטורה לזו מעל LCST של ELP וגרימת סגרגציה השלב התרמי שלו.
  12. לאט לאט להוסיף µL 750 תא חם תרבות בינוני מכל קידוח של צלחת 24-ובכן, הימנעות לשבש את ג'ל.
  13. דגירה של hydrogels ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים.
    הערה: מלא בינוני שינויים מומלצים בכל 1-2 ימים בהתאם לסוג התא. כדי להגביל את הלחץ על הג'ל, השתמש בכוס פסטר פיפטה מודבקת עם טיפ פיפטה µL 200 כאשר כ רפה בעברית בינוני מן הבאר.

3. Immunocytochemistry של תאים ב- 3D בילדיו Hydrogels

  1. הכן את הפתרון קיבעון על ידי ערבוב 10 מ ל 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA) 30 של mL DPBS. לחמם את הפתרון 37 מעלות צלזיוס.
  2. האחות המדיום מהצלחת 24-ובכן, לשטוף בעדינות עם 1 מ"ל של DPBS.
  3. להוסיף µL 750 של הפתרון קיבוע מכל קידוח, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אל תשתמש החממה תרביות רקמה כדי למנוע זיהום של תרבויות אחרות עם אדי מחברים.
  4. בזהירות תשאף הפתרון קיבוע מכל קידוח, השמטת את מחברים לגורם המכיל פסולת מסוכנת המתאים.
    התראה: חשיפה PFA יכול לגרום לגירוי העור, העיניים. כפפות/בטיחות משקפיים ולעבוד בשכונה fume כימי.
  5. להוסיף 1 מ"ל של DPBS כל דגימה. מיד וארוקן את DPBS וזורקים לתוך פח אשפה מחברים.
  6. לשטוף את הדגימות פעמיים עם 1 מ"ל של DPBS 10 דקות כל אחד.
    הערה: הדוגמאות שניתן לאחסן ב DPBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע לאחר שחתמת את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים.
  7. Permeabilize כל דגימה עם 750 µL של פתרון permeabilization (100 מ של DPBS ו 0.25 mL של טריטון X-100; PBST) לשעה בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה-15 סל ד.
  8. מחוק לגמרי את PBST ומוסיפים µL 750 של חסימת פתרון (95 מ"ל ל- PBS, 5 g של אלבומין שור (BSA), 5 מ של סרום ו- 0.5 מ של טריטון X-100) על כל דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות על כיסא נדנדה-15 סל ד.
    הערה: הפתרון חסימה צריך להכיל סרום מן המינים מארח בו גידלו את הנוגדנים משני (למשל., עז, חמור) וסינון סטרילי-מסוננים דרך 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
  9. להכין את הפתרון דילול נוגדנים (97 מ של DPBS, 2.5 g של BSA, 2.5 מ של נסיוב (מתוך מאותו המין המארח כמו שלב 3.8) ו- 0.5 מ של טריטון X-100). לדלל נוגדן ראשוני באמצעות הפתרון דילול נוגדן ולהוסיף 500 µL של הפתרון כל דגימה. לאטום את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים, דגירה בין לילה-4 מעלות צלזיוס על כיסא נדנדה.
    הערה: Nestin נוגדנים ראשי Sox2 היו 1:400 מדולל בפתרון דילול נוגדן של התרכזות מקוריים היצרנים.
  10. תשאף הפתרון נוגדן של כל מדגם ולשטוף את הדגימות עם PBST עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה-סל ד 15. חזור על השלב שטיפת 3 פעמים.
  11. לדלל משני הנוגדנים ו- 5 מ"ג/מ"ל המניה דאפי (1:2, 000) באמצעות הפתרון דילול נוגדן ולהוסיף 500 µL של הפתרון כל דגימה. מכסה את הצלחת 24-היטב ברדיד אלומיניום, דגירה בין לילה-4 מעלות צלזיוס על כיסא נדנדה.
    הערה: כמו נוגדנים משניים הם רגיש אור, הדגימות חייבת להיות מוגנת מ photobleaching עבור כל השלבים הבאים. עז עז של עכבר אנטי אנטי-ארנב משני נוגדנים היו שבערך מדולל בפתרון דילול נוגדן של התרכזות מקוריים היצרנים.
  12. תשאף הפתרון נוגדן של כל מדגם ולשטוף את הדגימות עם PBST למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על הנדנדה. חזור על השלב שטיפת 3 פעמים.
  13. הצב טיפת hard-set הרכבה בינונית על גבי המשטח של שקופית מזכוכית. באמצעות מלקחיים, להסיר עודפי פתרון העובש מאת בקלילות סופג את הקצה של העובש על מגבת נייר. בזהירות המקום כייר במהופך על המדיום הרכבה ולהימנע היכרות עם בועות.
  14. לאפשר המדיום הרכבה להקשיח במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר. לאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר או 4 ° C. לאפשר המדיום הרכבה להגדיר באופן מלא במשך 48 שעות לפני הדימות כפי מקדם שבירה של המדיום ישתנה במהלך התקשות. חותם את הדגימות אל השקופית כיסוי זכוכית עם לק ברור להפחתת זיהום או דגימת תנועה.
  15. תמונה הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

תוצאות

ELPs בשימוש פרוטוקול זה המורכב מעובדים חמישה אזורים: תג T7 His6 תג, אתר פצילות enterokinase (EK), אזור ביו-אקטיביות, אזור כמו אלסטין (איור 1). T7 ותגי His6 מאפשרים זיהוי קל באמצעות טכניקות תספיג סטנדרטי. מבוא של אתר המחשוף EK מאפשר הסרת אנזימטי של האזור תג, במידת הצורך. האזור ב...

Discussion

ביטוי חלבון רקומביננטי טיהור הוא כלי רב עוצמה כדי לסנתז biomaterials עם הפארמצבטית גבוהה. בעיקר בשל כניסתו של שיבוט מולקולרי ממוסחר, פלסמידים רקומביננטי מותאם אישית ניתן לרכוש מהספקים מספר, אשר מפחית באופן משמעותי את הזמן כדי לעבוד עם חומרים כמו ELPs. באופן דומה, ניתן לבקש פלסמידים ישירות מן המעב?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה פאלמר, ה באבו (סטנפורד נוירוכירורגיה) למתן מאתר באמנות NPCs. וקטור באיור 4 בשימוש ומותאמים מאמנות רפואי שרת תחת יצירתי של מלאי ייחוס 3.0 רישיון (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). חלק מעבודה זו בוצעה ב סטנפורד ננו משותפים מתקנים (SNSF), הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מרכזים לגיל הרך-1542152. N.A.S. מאשר תמיכה מן הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים (32GM 008412). ובין מאשר תמיכה של NRSA NIH מראש דוקטורט (F31 EB020502), חוקרים לגשת לתוכנית של Siebel. S.C.H. מאשר תמיכה של מכוני הבריאות הלאומיים (U19 AI116484 ו- R21 EB018407), הקרן הלאומית למדע (DMR 1508006), מכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית (RT3-07948). מחקר זה קיבל מימון הברית עבור הדרכה (AR3T), ומחקר השיקום רגנרטיבית נתמך על ידי יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי הילד לבריאות והתפתחות האדם (NICHD), המכון הלאומי הפרעות נוירולוגיות שבץ (NINDS) ו המכון הלאומי של הדמיה ביו, בביו-הנדסה (NIBIB) של המכונים הלאומיים לבריאות תחת P2CHD086843 מספר פרס. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Elastin-Like Protein Expression and Purification
10 cm Petri DishesThermo Fisher ScientificFB0875713
70% EthanolRICCA Chemical2546.70-1
Ammonium SulfateSigma-AldrichA3920-500G
AmpicillinThermo Fisher ScientificBP1760-25G
Bacto AgarThermo Fisher Scientific9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Competent CellsInvitrogenC606003
ChloramphenicolAmresco0230-100G 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
EDTA disodium salt, dihydrateThermo Fisher ScientificO2793-500
GlycerolThermo Fisher ScientificBP229-4
IsopropanolThermo Fisher ScientificA451-4
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher ScientificBP1755-10G
Luria BrothEMD Millipore1.10285.5007
ParafilmVWR52858-000
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)MP Biomedicals195381
Sodium ChlorideThermo Fisher ScientificBP358-212
Sodium HydroxideSigma-AldrichS 8045-1KG
Syringe Filter Unit (0.22 μm)MilliporeSLGP033RB
Terrific BrothMillipore71754-4
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels
0.22 μm syringe filtersMilliporeSLGV004SL
0.5 mm thick silicone sheetElectron Microscopy Science70338-05
24-well tissue culture plates Corning353047
Disposable Biopsy Punch (2 mm)Integra Miltex33-31
Disposable Biopsy Punch (4 mm)Integra Miltex33-34
Disposable Biopsy Punch (5 mm)Integra Miltex33-35
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) Corning21-031-CM
No. 1 12 mm glass coverslipsThermo Fisher Scientific12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)Sigma-Aldrich404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTAThermo Fisher 15400054
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15701
Bovine Serum Albumin (BSA)Roche3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Molecular ProbesD1306 
Donkey SerumLampire Biological Labs7332100
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)Molecular ProbesA-11017
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)Molecular ProbesA-11071
Goat SerumGibco16210-072
Mouse Nestin Primary AntibodyBD Pharmingen556309
Mouse Sox2 Primary AntibodyCell Signaling Technology23064S
Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium Vector LabsH-1400 

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering1353Dimmunostaining

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved