JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית מבודד מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). פרוטוקול זה כולל הכנת קפואה דגימות של רקמות אנושיות מעיים, cryosectioning, ethanolic מכתים, התייבשות, הפונקציה LCM, והפקת RNA.

Abstract

מטרת שיטה זו היא להשיג דגימות RNA גבוהה-שלמות של הגרעינים המעית שנאסף מבולבל, resected טריים מעיים רקמה אנושית באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). זיהינו חמישה שלבים בזרימת העבודה כי הם חיוניים להשגת RNA מבודד מן הגרעינים המעית עם כמות ואיכות גבוהה מספיק בשביל RNA-תת סעיף. ראשית, בעת הכנת רקמת המעי, כל מדגם חייב להיות כל נוזל עודף הוסר על-ידי סופג לפני שיטוח serosa ככל האפשר לרוחב החלק התחתון של תבניות הבסיס גדול. דוגמאות ואז מוקפאים במהירות על גבי slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane. שנית, בעת חלוקתה הרקמה, חשוב למקם cryomolds כך מעיים מקטעים מקבילים המטוס מלא של מקלעת myenteric, ובכך מניב את פני השטח הגדול ביותר של הגרעינים המעית לכל שקופית. שלישית, במהלך LCM, napthalate פוליאתילן (עט)-ממברנה שקופיות מציעים את המהירות ואת גמישות חלוקה לרמות את הצורות לא אחידה של הגרעינים המעית בעת איסוף הגרעינים המעית הגדול ביותר. רביעית, להמחשת ברורים של הגרעינים המעית בתוך המקטעים, צבעים התואמים לאתנול, כמו Cresyl, ויולט, מציעים מעולה לשימור RNA תקינות ביחס צבעי מימית. בסופו של דבר, על החילוץ של RNA מן הגרעינים בשבי, נצפו הבדלים בין מסחרי ערכות חילוץ RNA הניב סופריור RNA כמות ואיכות, תוך צמצום זיהום ה-DNA. אופטימיזציה של גורמים אלה בפרוטוקול הנוכחי מאיץ את זרימת העבודה במידה רבה ותשואות הגרעינים המעית דגימות עם איכות יוצאת דופן של RNA וכמות.

Introduction

שיטה זו נועדה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה של הגרעינים המעית של רקמה אנושית מעיים באמצעות לייזר לכידת microdissection (LCM). הפרוטוקול המתואר כאן מוטבה כדי לספק מספיק תשואות ואיכות RNA RNA רצף (RNA-seq) והוא נועד לשמש עם רקמת המעי האנושי resected טריים, מבולבל, קפואה.

הפרעות תנועתיות מערכת העיכול, במעיים פונקציונלי להשפיע על אחד של כל ארבעה אנשים בארצות הברית. מערכת העצבים המעית (ENS), המכונה גם השני המוח1, לעתים קרובות במרכז בהפרעות אלה, כפי שהיא משחקת תפקיד מכריע בטן הומאוסטזיס, תנועתיות. מניפולציה של תנועתיות המעיים הוגבלה כלל כריתה כירורגית לרקמות aganglionic/noncontractile, שינוי תזונה כרונית ו/או תרופות. באופן מפתיע, transcriptome המלא של התרנגולות למבוגרים נשאר היה לסדרם, במידה רבה הגבלת היכולת שלנו לזהות מולקולות בתוך התרנגולות ניתן לפלח הם או מנוצל טיפולים תאי גזע.

ישנן שיטות מעטים יחסית לבידוד RNA מן הגרעינים המעית אנושי. הגישה הראשונה, דיסוציאציה תא2, דורש טמפרטורות גבוהות דגירה דגירה ארוך פעמים; שניהם אשר ידועים לקדם השפלה RNA ולשנות את2,transcriptome3. גישה חלופית, הפונקציה LCM, יותר אמין משמר את transcriptome ומגן RNA שלמות. אף על פי מספר מחקרים השתמשו LCM כדי לאסוף את הגרעינים מוקפאות רקמת המעי האנושי4,5,6, גישות אלה היו גם הקשו על ידי RNA איכות וכמות המסכן, היו די עתירי עבודה, או צריך שינוי של להכתים או RNA מיצוי טכניקות לעבודה בידיים שלנו. LCM פרוטוקולים אחרים המיועדים לשימור RNA שנמצאו במוצר LCM מדריכים מספק שיפורים נוספים7,8, אבל הסתגלות שהיה נחוץ כאשר חל על הבידוד של הגרעינים המעית8, 9. מסיבות אלו, פיתחנו פרוטוקול ממוטבת בהתבסס על משאבים אלה מניב כמויות ניכרות של RNA גבוהה-שלמות מן הגרעינים המעית האנושי, יש זרימת עבודה מהיר יחסית, ולא מייצר תוצאות עקביות לרוחב גדול מספר דוגמאות.

במחקר זה, אנו מציגים תקציר של תהליכי אופטימיזציה המאפשרים את הבידוד של RNA גבוהה-שלמות מן הגרעינים המעית הטרייה resected. מרקמות מעיים. השיטה שלנו משלבת חמישה היבטים חשובים. הראשון, resected טריים, מבולבל דגימות מעיים אנושיים צריך חיתוך לפי מידה, יש לחות עודפת כל מוסרים עם טישו מעבדה, משוטחים על תבנית הבסיס גדול לפני פלאש-ההקפאה על גבי slurry של קרח יבש ו- 2-methylbutane (2 MB). שנית, היסטולוגית מקטעים של המעי צריכים להיות מוכנים לקבל את המטוס מלא של מקלעת myenteric בשקופית, אשר מציעה מטען רב של הגרעינים המעית. ההצלחה עם שלב זה היא תלויה במידה רבה על תהליך הכנת הרקמה. שלישית, המבנה לא אחידה של גרעיני ב התרנגולות מחייב שימוש פוליאתילן napthalate (עט) ממברנה שקופיות6, אשר מציעים את מהירות ודיוק הגדול ביותר במהלך תהליך LCM. צבעי הרביעי, אתנול תואמת, כגון Cresyl, ויולט, אמור לשמש כדי לשמר את שלמות RNA בזמן צביעת המעית הגרעינים. . האחרון, תהליך החילוץ RNA הוא קריטי עבור תוצאות מוצלחות עם ה-RNA-תת סעיף. חיפשנו גישה החילוץ RNA אשר מייצרת שלמות RNA גבוה, הגדלת התשואות RNA כאשר החל אוספים קטנים של הגרעינים המעית, מבטלת את ה-DNA זיהום ו שומר על מינים RNA רבים ככל האפשר.

יחדיו, אופטימיזציה של גורמים אלה במחקר הנוכחי במידה רבה מאיץ את זרימת העבודה ותשואות דגימות של הגרעינים המעית עם דופן RNA בכמות ובאיכות. התוצאות היו עקביות במידה רבה בקרב קבוצה גדול למדי של דגימות, המציין את העקביות של גישה זו. יתר על כן, השתמשנו גישות אלה כדי בהצלחה רצף של RNA דגימות מן הגרעינים המעית עשרות. האסטרטגיות מודגש כאן ניתן גם בהרחבה להתאים לביצוע LCM של הגרעינים הרצוי או גרעינים של ההיקפית ואת מערכת העצבים המרכזית במקרים אחרים הדורשים את הבידוד של RNA באיכות גבוהה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הפרוטוקולים המתוארים כאן אושרו על ידי ואנדרבילט אוניברסיטת מוסדיים סקירה לוח (IRB).

1. הכנה לפני ההגעה רקמות

  1. לקבל אישור IRB נאות ולתאם עם סוכנויות תרומת איבר אנושי כדי לקבל את רקמות מעיים resected טריים, מבולבל מתורמים אשר עונות על הקריטריונים מחקר כל הנדרש לצורך המחקר.
    הערה: פרוטוקול זה ניתן להתאים לשימוש עם מודלים אחרים מכרסמים ועכברים.
    1. מיד לאחר כריתה של כל אחד מהמקטעים מעיים, ביסודיות לשטוף לומן עם PBS צונן או באמצעי אחסון רקמות כדי להסיר שאריות חומר luminal או צואה.
    2. לאחר שטיפה, השלכת פסולת קיבול הביולוגי המתאים, להטביע את רקמות נפח מספיק של רקמת אחסון בינוני (כמו 3 - 5 פעמים נפח רקמת המעי) ולאחסן שכותרתו בנפרד, מים חזק מפלסטיק מכולות, שקוע בתוך קרח או בקירור עד לשימוש).
    3. תהליך הרקמה בתוך 18-26 שעות מרגע אוסף כדי למנוע השפלה RNA משמעותי.
      הערה: בהתאם הניקיון של קטע המעי, אחסון, זה ייתכן שניתן להרחיב את מגבלת הזמן המוצע שלנו.
  2. להכין את כל החומרים הדרושים עבור אוסף רקמה אנושית מראש, כמצוין בפרוטוקול הזה (עיין טבלה של חומרים למידע מפורט יותר מוצר). ודא כי כל נדרש ציוד מגן אישי שחוקה בכל עת.
  3. להכין דליים קרח יבש יחד עם slurry קרח יבש כפי שמוצג באיור1.
    1. לרסק קרח יבש מספיק כדי למלא 4 דליים קרח רגיל מעגלית ודלי קרח מלבני אחד. לאחד הדליים רגילים צריך להיות קטן (11 x 21 ס מ) מעבדה רקמות להציב בפני השטח של קרח יבש. במידת האפשר, השתמש בתיבות חדש, נפתחה מעבדה רקמות.
    2. הפוך של slurry קרח יבש על ידי powderizing 2 ל' של קרח יבש בתוך דלי קרח נקי מלבני.
    3. להוסיף 2 MB טרום מקורר על פני השטח של קרח יבש. מעט לערבב ולשטח את slurry באמצעות פיפטה עצה תיבת כיסוי פני הצורה slurry לתוך ערוץ מוקף גדול יותר חתיכות קרח יבש לאורך צידי מלבני הדלי.
    4. מקום מספר גושי קרח יבש לאורך קצות דלי קרח דק כדי לעודד הקפאה מהירה יותר. צריך להיות מקום ≥4 בתבניות הבסיס כדי מתאימים ברפיון בדלי slurry קרח יבש בזמן נתון.
      1. באופן אופציונלי, מחסנית דלי קרח בתוך עוד דלי קרח מלבני מלא ¼ בקרח יבש. המיקום הזה עוזר כדאי לבודד את slurry קרח יבש ומונע את הצורך שינויים תכופים של קרח יבש ו 2 MB במהלך ההליך.
    5. מקם את דליים קרח יבש ב פס לפי הסדר הבא: 1) קרח יבש slurry דלי, דלי קרח 2) מעבדה רקמות-יבש, 3 & 4) נורמלי דליים קרח יבש, דלי קרח יבש 5) מלבני (איור 1א').

2. הכנת קפואה רקמות מעיים אנושיים

הערה: כל התהליך הזה יכול לקחת בין 45-80 דקות קטע המעי, בהתאם לאיכות רקמת המעי. אנו ממליצים גם איסוף דגימות בקרת איכות כדי להעריך את איכות ה-RNA, היסטולוגיה לפני שתמשיך עם הפונקציה LCM.

  1. למלא מגש גדול עם קרח רטוב ולמקם קרשי חיתוך כירורגי על גבי הקרח היבש.
  2. בהגדרת הזה, מקררים בקבוקונים 500-mL ו- 100-mL לאחסון את רקמת ואת מקטעי החתוך בפתרון אחסון הקרה. בסיס צונן מראש תבניות על לוחות חיתוך כך שתהיה מוכן לקבל רקמות.
  3. עם קבלת רקמת המעי טריים, יוצקים את התקשורת שבו מועבר הרקמה, לשמור אותו בבקבוקונים טרום מקורר. להשאיר קצת מקום אלה ספלים לאחסון זמני של רקמת המעי, מקטעי החתוך, שיוכן בצעדים העוקבים.
  4. לחתוך באורך של 20 ס מ, אשר מספק בשפע רקמות (40-60 ס מ2) ליצירת RNA ליישומים במורד הזרם ודוגמאות בקרת איכות על קטע המעי. בהתאם שלמות רקמות, זה עשוי להיות ריאלי להשיג בידוד RNA לעיבוד הזרם באורך קטן בהרבה (קרי, 5 ס מ של המעי).
  5. לקצץ משם שומן ורקמות של המעי באמצעות מספריים כירורגיים. ממסר אדיפוז לאורך serosa המעי פוגעת ביכולת לשטח מלא רקמות בצעדים העוקבים. בזהירות לקצץ את הרקמה כדי להימנע חותך serosa במהלך ההסרה של שומן, רקמת חיבור, אשר יכול לגרום נזק של מקלעת myenteric מבנית או להפוך את החלק החיצוני של הרקמה לשטח לצר על חלוקתה.
  6. עושים חתך אורכי לאורך כל המדגם מעיים, רצוי באתר של מצע המעי העליון מצורף.
  7. לנתח משם ולמחוק את החיידק אצלה מן המעי הגס, כך זה משטחת בקלות רבה יותר, לאחר ששוחרר ממתח.
  8. לפעור את הצד רירית המעי למטה על גבי קרש חיתוך צוננת וחותכים רצועות 1.25 ברוחב ס מ מ באורך מלא של הרקמה.
    הערה: רקמת המעי לעיתים קרובות מרחיב לאחר חיתוך, אז צריך להיות מותאם לגודל זה בהתאם.
  9. לאחסן זמנית את הרצועות בפתרון אחסון רקמות צוננת.
    הערה: אנו משתמשים פתרון אחסון הקרה UW קאהן כי יש חיי מדף ארוכים, היא חסכונית יחסית, והוא ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד שהוא נדרש.
  10. להסיר רצועת רקמה פתרון אחסון הקרה, לחתוך אותו ל מקטעים ~1.5-2 ס מ באורך.
  11. כתם במהירות את מקטעי מעיים על ערימה של מגבונים מעבדה, כדי להסיר עודפי נוזלים ולמנוע היווצרות גבישי קרח לאורך serosa מעיים במהלך פלאש-הקפאה. אם הרקמה לא התייבש מספיק, זה יהיה קשה להשיג חלקים באיכות גבוהה מ מקלעת myenteric.
  12. שכבה רירית-הצד מחק חתיכות מעיים על גבי טרום מקורר, גדול חד פעמיות הבסיס כייר פלסטיק (37 מ מ x 24 מ מ x 5 מ מ).
  13. בזהירות לשטח כל קטע על ידי בקלילות מתיחה הרקמה על פני התבנית בסיס באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי לחץ כלפי מטה בעדינות ולהוציא בועות אוויר זה יכולה להיות. לכודה מתחת serosa. שימו לב כי הרקמה מתרחב בזמן שיטוח. אם יש צורך, לקצץ את מקטעי וחותכים את הדגימות הנותרים על גודל קטן יותר.
    הערה: אם הרקמה הוא נמתח יותר מדי, זה יעוות את מקלעת myenteric. לאחר כל בועות האוויר יוסרו, להעריך את העובי של המדגם להקפאה. אם יש צורך, דחוף את הקצוות של פנימה הדגימה עד המדגם מעיים מתקרב העובי המקורי.
  14. מניחים את התבנית בסיס שנטען על פני הקרח היבש, 2 MB slurry. הרקמה צריך להקפיא לחלוטין בתוך 30-60 s, תלוי בגודל עובי מקטע המעי.
  15. יבש בתחתית התבנית הבסיסית כדי להסיר שאריות 2 MB על ידי שפשוף במהירות את בסיס התבנית על הרקמות מעבדה טרום מקורר בדלי השני של קרח יבש.
  16. להעביר את הדגימה מיובשים לאמבטיה השלישי של קרח יבש ולקבור אותה מתחת לפני השטח של קרח יבש עד שהוא מוכן להיות עטוף.
  17. במהירות להתבונן לתחתית התבנית הבסיסית לפני גלישה, כדי לבחון את איכות הכנת הדוגמא. רשום דוגמיות לא שטוח, או בועות אוויר גדולים, כמו אלה יש להימנע cryosectioning, הפונקציה LCM.
  18. לעטוף את הדגימה בנייר אלומיניום שכותרתו מראש זה מונח על גבי קרח יבש בדלי כך עטיפה של רקמות מתרחשת בזמן שאני. נשאר קפוא לגמרי.
  19. לעטוף את הדגימה עם שכבה של ניילון נצמד, כדי למזער את רקמת להתייבשות במהלך האחסון ב- 80 ° c
  20. חנות דגימות בדלי מלבני עד שהם יהיו מוכנים להעביר למקפיא.
  21. מראש תווית ולהירגע מראש מקפיא תיבות ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון מיידי של דגימות אחרי אוסף.
  22. לקחת חלק קטן של רקמה מתוך כל קטע המעי עבור הערכה של RNA תקינות לפני ביצוע הפונקציה LCM.
    1. תווית מראש צינור ללא RNase 2-mL עבור כל קטע, מלא ≥500 µL פירוק המאגר. אנו ממליצים להשתמש ערכת חילוץ RNA "D", המופיעים בטבלה של חומרים.
    2. Homogenize חתיכה קטנה (2 מ מ x 2 מ"מ) של המעי אצל מהמגן מיקרו רקמות סטנדרטי (20-40 s, עד להישאר אין חתיכות רקמה). לאחר מכן, מיד להקפיא את הרנ א lysate על קרח יבש, החנות ב-80 מעלות צלזיוס עד שתמשיך עם החילוץ-RNA.
    3. באופן אופציונלי, להטביע חלק מהסעיפים במדיום הקפאת רקמת (TFM) בתור גיבוי. הכנת הרקמה סעיפים בדיוק באותו אופן המתואר בסעיף זה, אך להטביע דוגמאות TFM בתוך כייר הבסיס להקפאה-פלאש.

3. Cryosectioning

  1. לפני cryosectioning, להכין את כל החומרים הדרושים עבור צביעת והתייבשות, להעביר את דגימות רקמה הרצוי מהמקפיא-80 ° C לתוך דלי קרח יבש.
  2. להכין את cryostat לשימוש על-ידי קביעת הטמפרטורה האופטימלית חיתוך (-18 ל-22 מעלות צלזיוס), ניגוב למטה משטחים עם 100% אתנול, בטיפול הלהב ולצחצח מגש עם פתרון טיהור RNase.
  3. לדבוק בצורה הטובה ביותר את הדוגמית להוכיח הצ'אק, השתמש הגישה הבאים.
    1. למקם את המלקחיים קרח יבש במשך לפחות 30 s לפני הסרת העטיפה את דגימת מעיים והנחתי אותה על פני השטח של קרח יבש serosa-הצד-הלמעלה.
    2. למזוג גבעה 3-5 מ מ של רקמות מקפיא בינוני (TFM) אל בעל הדגימה cryostat גדול ולהעביר מיד את דגימת מעיים serosa-הצד-up על גבי TFM.
    3. במהירות העברה בעל הדגימה קרח יבש ולכסות עם קרח יבש powderized לאחר המאפשר את TFM לדבוק המדגם עבור 2-5 s בטמפרטורת החדר. להבטיח TFM יישאר מתחת למישור מקלעת myenteric.
      הערה: באופן אידיאלי, המשטח החיצוני של רירית המעי מלא דוגלים TFM לפני TFM מתחיל לקפוא ללא הפשרתו של המדגם.
  4. הר בעל הדגימה לראש הדגימה של cryostat ויישר את הדגימה עם הלהב cryostat, כך המטוס של מקלעת myenteric יהיה מקביל להב חיתוך.
  5. להגדיר את עובי אופטים cryostat 8 מיקרומטר. המטרה של יישור באופן מושלם את הדגימה הוא לקבל הגדול ביותר האפשרי שטח הפנים של מקלעת myenteric בכל שקופית. עובי זה מומלץ בדרך כלל על הרקמה האנושית והן מכרסמים, אך ניתן להתאים, לפי הצורך.
  6. חתך דרך serosa שרירים אורכיים עד שהגיע על מקלעת myenteric.
    1. כדי לאתר את מקלעת myenteric, הר קטע לדוגמה לשקופית, מכתים את המקטע עם צבע מימית, כגון 1% Cresyl סגול או כחול טולדין, וכו '.
    2. עיין בסעיף תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה 40-2000 X לזיהוי צומת בין שכבות שריר אורכי, מעגלית. פרמטרים במיקרוסקופ הינם מסופקים בכל טבלה של חומרים. בתחילת חלוקתה, serosa יסומן על ידי הנוכחות של רקמת חיבור. קצת שומן מצע המעי העליון הנותרים עשוי גם להיות נוכח לאורך serosa. גיליון של השכבה החיצונית שרירים אורכיים ואז מתחיל. פעם הגיע לגבול בין שכבות שריר אורכי, עגול, חלק הגרעינים המעית יתקיימו.
      הערה: בסעיפים מספר הבא, מקלעת myenteric יהיה גלוי לעין, עם רצועות גדולות של הגרעינים להיות נוכח בתוך מקטע יחיד (איור 2C). אם הרקמה אינה שטוחה לחלוטין בתחילת חלוקתה, אז רק על חלק הגרעינים יהיה נוכח בכל מקטע בזמן נתון. לפעמים, ייתכן המדגם מעיים של מקלעת myenteric מטבעו לא אחידה, למרות הרקמה המופיעים שטוח לחלוטין. הדבר נכון במיוחד עבור דגימות התריסריון. מניסיוננו, הדוגמיות הללו יכול לקחת עוד זמן כדי לעבד עם הפונקציה LCM, אך ניתן לאסוף מספיק RNA הפעלה של יום אחד. המיקום המדויק של מקלעת myenteric יכול להשתנות במידה ניכרת בין דגימות, בהתבסס על הרקמה והכנות שלה להקפאה.
  7. בגין איסוף מקטעים טורי עבור הפונקציה LCM, עם אוספים אופטימלית לספק את המספר הגדול ביותר של נוירונים, עכשיו, דונלד לכל שקופית. בהתאם פני השטח של המדגם, ניתן לשלב מספר מקטעים לשקופית עט-ממברנה בודדת.
  8. הר הסעיפים על העט ממברנה שקופיות, מקורר בקצרה ב cryostat עבור s 5-10. כאשר הרכבה, הרקמה צריך להמיס רק במעט, מקסימאלית שמירה על תקינות RNA.

4. מכתים

הערה: לקבלת סקירה של תהליך צביעת, עיין טבלה 1. כל הפתרונות המשמש אך ורק סטנדרט 50-mL בקבוקונים חרוט. לטיפול החיצוני של הצינורות עם פתרון טיהור RNase אינו מופיע כדי לשפר תוצאות (נתונים לא מוצג).

  1. הכן תמיסה רוויה של ויולט Cresyl 4% אתנול 95% לפחות יום אחד מראש, באופן מלא מחדש להשעות את הננס Cresyl לפני טעינת את המזרק.
    הערה: ריכוז האתנול ייתכן שיהיה עליך להיות הנמיך עבור צביעת יעילה, כפי שמתואר במקטע דיון. לא בדקנו אם באמצעות אתנול 50% או 75% במהלך צביעת משמעותית מפחית את תקינות ה-RNA. ויולט cresyl וכך צריך להיות מוגן מפני אור הינם רגישים לאור.
  2. לאחר הרכבה מקטעים של מקלעת myenteric אותן לשקופית, מיד להטביע השקופית בקבוקון חרוט של 95% אתנול (טרום מקורר ב-20 ° C) במשך 30 s.
    1. אם הסעיפים תואם באופן מלא אל השקופית בשלב הקודם, מעט חמים התחתון של השקופית עם בכפפה יד (מחיקה מעבדה צריך להיות ממוקם באמצע השקופית, כפפות), ב"זכות מלאה לפני השוקע 95% אתנול. פתרון זה יכול להיות שימוש חוזר עבור שקופיות לפחות 3-6 מבלי להפחית את תקינות ה-RNA.
  3. הנח את הפנים שקופיות על מחיקה מעבדה להציב על גבי מיכל קדם טיפול, ללא RNase8.
  4. מראש ממלאים מזרק 3-mL עם 4% Cresyl ויולט וצרף מסנן מזרק 0.2-מיקרומטר.
    הערה: אנו ממליצים מסננים אצטט תאית.
  5. להחיל 6-10 טיפות של כתם ישירות על גבי רקמות סעיפים8 , דגירה s 10-30, או עד מספיק צבע נשמר כאשר בטל צבעונית. בעת צביעת, סובב בעדינות את המיכל שקופיות ידנית על מנת להבטיח כי הסעיפים הרקמה הם מצופים אחיד הכתם.
  6. יוצקים את הכתם, מיד מבטל את כתם השקופית בקבוקון של 75% אתנול. להטביע את השקופית שוב ושוב עד לצבוע עודף יש שרידים בעיקר מתוך המדגם. זה עשוי לקחת בין 10-20 s.
  7. גיבוש סופי של דה-צביעת בטבילת שוב ושוב את הדגימה בבקבוקון של אתנול 95% עבור Submerge ס' 10 המדגם שוב ושוב עד כל עודף הכתם הוסר.
    1. שינוי משך destaining, לפי הצורך, כדי לייעל את ההכתמה של הגרעינים. אם יותר מדי הכתם יוסר, המדגם הופכת שקופה מדי, זה עשוי להיות קשה לדמיין
      הערה: פרוטוקול זה מכתימים מוטבה בהתבסס על מספר פרסומים5,8,10,11 אשר נדרש שינוי לפני התקבלו תוצאות משביעות רצון. לכן, הריכוז של אתנול המשמש לצבוע, במהלך תהליך destaining צריך להיות שונה, בעת הצורך להשיג תוצאה מיטבית.

5. התייבשות

  1. מיד לטבול את השקופית אתנול 100% 2 - 3 פעמים, עבור סכום כולל של 10-20 ש'.
  2. להטביע את השקופית אתנול 100% נטול מים לפחות ב-30 s. כמו אתנול נטול מים מאוד היגרוסקופי, להוסיף מולקולרית הנפות (8-12 mesh) בקבוקון 100% אתנול לפני תחילת ההליך כדי להסיר מים נספג ובכך לחלוטין. יותר מייבשים את מדגם5.
  3. שוב ושוב טובלים השקופית קסילן עבור s 15-20. שלב זה מסיר לחלוטין את השכבה של אתנול בשקופית. להוסיף הנפות מולקולרית מבעוד מועד הצינורות של קסילן, כדי מלא לספוח עודפי אתנול ומים מולקולות5.
    התראה: Xylenes מסווגים מכשלה בעיניים ודרכי הנשימה העליונות, אמור לשמש בשכונה fume כימי.
  4. להטביע את השקופית של קסילן (עם הנפות מולקולרית, רשת 8-12) לפחות 10 דקות.
    הערה: ניתן לקחת הפסקה קצרה לאחר שלב זה, במידת הצורך. דוגמאות ניתן להשאיר קסילן במשך 4-5 שעות ללא השפעות מזיקות כדי להכתים, הפונקציה LCM או RNA תשואה/תקינות.
  5. באופן אופציונלי, בנפרד להכין כמה שקופיות נוספים בשלב זה. אם מכינים בסיבוב השני של השקופיות לאחר השלמת LCM על כל השקופיות מוכן, הרקמה ב cryostat ייתכן שתצטרך להיות refaced, עקב התייבשות של המשטח רקמות. עד ארבעה מקטעים ייתכן שתצטרך להיות מושלך לפני ניתן לאסוף במקטעים שמיש.

6. לייזר לכידת Microdissection (LCM)

  1. הסר את השקופית של קסילן, מילה נהדרת זה בשכונה fume כימיים לפחות 1 מינימלית הכנס מחסנית משתי אותיות הפונקציה LCM לשלב מיקרוסקופ LCM. טעינת השקופית לבמה ולרכוש תמונה סקירה של השקופית.
  2. לזהות את המיקום הרצוי עבור הפונקציה LCM וטען כובע אותן לשקופית.
  3. יישור הלייזר האינפרא-אדום (IR) ולהתאים את כוחה ואת משך כדי להפוך בקוטר 20-30 מיקרומטר ללכוד נקודה.
  4. אתר הלייזר אולטרה סגול (UV) והגדר של חיתוך המתאים מהירות ועוצמה.
  5. חלוקה לרמות את הגרעינים הרצוי להיאסף באמצעות התוכנה LCM, מקפיד להישאר בגבולות האזור לאספנים על המכסה (מתואר סקירה שקופיות של התוכנה כמו עיגול ירוק).
  6. בכל אחד של העקבות, להתאים את הנקודות IR כזה יש לפחות אחד IR לזהות כל מיקרומטר 100-500.
  7. לחץ על לחצן גזור IR/UV להמשיך עם האוסף של כל הגרעינים מסומן.
  8. לאחר השלמת אוספים, או להעביר את הכובע למיקום חדש, חזור על התהליך אוסף או לבחון את הכובע LCM בתחנה QC ברגע הכיפה מספיק מלא עם גרעיני (או עד המועד המומלץ של 60-80 דקות).
  9. אם פסולת קיימות על המכסה, נגב את זה משם תוך שימוש במכחול שקצהו פיין יש כבר טרום טיפול עם פתרון טיהור RNase, לשטוף עם מים ללא נוקלאז ולאחר יבשים לגמרי.
  10. בזהירות לבחון את הכובע על ידי העין או עם הגדלה במיקרוסקופ שדה בהיר כדי להבטיח כל פסולת הוסר. אם לא ניתן להסיר את הלכלוך על-ידי שימוש במכחול שטופלו מראש, השתמש טיפ פיפטה בסדר (חינם RNase) כדי לגרד משם את ההריסות.
  11. אבטח את הכובע על גבי צינור microfuge 0.5 mL מלא µL 230 מאגר פירוק RNA (מאגר RLT מ- RNA ערכת חילוץ "B", עם β-mercaptoethanol הוסיף-ריכוז של µL 10/mL).
  12. הפוך את הכובע, בקצרה מערבולת, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  13. צנטריפוגה אצל ≥ 5,000 x g במשך 5 דקות, ואז העברת microfuge צינור לקרח יבש.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. RNA lysates ניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא השפעה משמעותית על השפלה RNA לפחות שבוע אחד. אם RNA בידוד מתבצעת באותו היום, ואז מקררים את הדוגמאות על הקרח עד הם מוכנים לחילוץ.
  14. לבצע כל אוספים נוספים בתוך מגבלת הזמן המקסימלי המומלץ של 80-90 דקות לאחר הסרת השקופית קסילן. כל הסעיפים מיובש נחשפים בלחות, RNases יכול בהדרגה הופכים מחדש. הגבלת התקופה באוסף ניתן למזער תופעות כאלה, מקסימאלית לשמור RNA שלמות.

7. RNA בידוד

  1. היכונו של תחנת עבודה ללא RNase RNA עקירות.
  2. היכונו ערכת חילוץ RNA כל צינורות, ריאגנטים לפי ספר ההוראות.
    הערה: אמנם יש הרבה ערכות זמינים עבור בידוד RNA בעקבות LCM, היו לנו הטוב ביותר הצלחה באמצעות ערכת חילוץ RNA "B", מופיע ברשימת החומרים. ראה איור 5 השוואה side-by-side של ריאגנטים מיצוי ה-RNA.
  3. להסיר דגימות מהמקפיא-80 ° C, להפשיר במהירות בתוך אמבט מים 37 º C.
  4. מיד מערבולת הקרת דגימות עבור 2-3 s לפיזור אחיד המלחים thiocyanate guanidinium.
  5. לשלב כל דגימה עם אמצעי אחסון שווים 70% אתנול. בריכת lysates 2 או יותר יחד, במידת הצורך להגיע ריכוז ה-RNA מספיקות.
  6. המשך לפי הוראות היצרן במדריך עבור תהליך החילוץ RNA, באמצעות פרוטוקול אופטימיזציה עבור דגימות microdissected.
  7. Elute RNA בשלב הסופי לתוך המינימלי המומלץ נפח המים ללא נוקלאז (14 µL).
  8. בעקבות בידוד ה-RNA, aliquot µL 1-2 של RNA של כל מדגם חדש מראש בתווית RNase ללא צינור לבקרת איכות הערכה/איכות עם מכשיר מיקרופלואידיקה שיכולים להמחיש כמויות קטנות של RNA, כגון Bioanalyzer. Aliquot µL 1 נוספים לתוך צינור נפרד על כימות עם ערכת כימות של RNA רגישות גבוהה.
    1. להתאים את השלבים הבאים, בהתאם לצורך, כדי להשיג כמות מספקת של RNA לניתוח במורד הזרם (כלומר., בריכה מספר גדול יותר של הפונקציה LCM כמוסות לפני החילוץ-RNA).
  9. חנות RNA ב-80 מעלות צלזיוס עד איסוף מספיק דוגמאות לניתוח במורד הזרם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנחנו עשינו מספר שיפורים הפרוטוקולים הקיימים המאפשרים את האוסף מהירה יחסית של הגרעינים המעית מדגימות המעי האנושי באמצעות הפונקציה LCM, עמידה בסטנדרטים ביותר עבור ה-RNA-תת סעיף. ראשית, אנחנו אופטימיזציה ההקפאה המהירה של מקטעי רקמת המעי בתבניות הבסיס גדול להציב בפני השטח של ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הליך זה מאפשר את האוסף יעיל של הגרעינים המעית רבים כמקור להפקת RNA עבור ה-RNA-תת סעיף. כאן, אנחנו האיץ את התהליכים המתוארים הפרוטוקולים הקיימים תוך שמירה מקסימאלית RNA שלמות. כמו כל השלבים בהליך זה תלויות זו בזו, זה חשוב כי כל הבעיות ניתן לסלק מן תחילת המחקר, כי כל דוגמאות מוכנות באופן דומה כמו אח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

אנחנו אסירי תודה על התורמים ובני משפחותיהם אשר אפשרו את העבודה הזאת אנחנו מעריכים גם הסיוע של צוות המכון הבינלאומי לרפואה, טנסי סיפורים אישיים שעזרת אוסף קואורדינטות של רקמות השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים, NIH OT2-OD023850 לתמיכה2 וקצבה EMS של NIH T32-DK007673 כדי AMZ. אנחנו מודים לצוות של משאב משותף פתולוגיה ואנדרבילט Translational גישה לכלי LCM, ייעוץ על הכנת הרקמה. ואנדרבילט רקמות פתולוגיה משותפים המשאב נתמך בחלקה על ידי NIH מענקים P30-CA068485-14 ו- U24-DK059637-13. אנו מודים המרכז גישה הגנום טכנולוגיה במחלקה לגנטיקה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על העזרה עם אנליזה גנומית. GTAC היא נתמכת באופן חלקי על ידי NCI סרטן מרכז תמיכה גרנט #P30 CA91842 כדי Siteman מרכז הסרטן ועל ידי ICTS/CTSA #UL1TR002345 מענק של המרכז הארצי עבור מחקר משאבים (NCRR), מרכיב של נבחרת מכונים לבריאות (NIH), וכן NIH מפת הדרכים למחקר רפואי. פרסום זה הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את התצוגה הרשמי של NCRR או NIH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Neutral-buffered formalinSigmaHT501128-4L
2-MethylbutaneFisherO3551-4
3-mL syringeBD309628
50-mL conical tubes, polypropylene Corning05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposableElectron Microscopy Sciences5025511
Belzer UW  Cold Storage SolutionBridge to LifeN.A.
CapSure Macro LCM capsArcturus, ThermoFisherLCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal   Glad  N.A. 
Cresyl Violet AcetateAcros OrganicsAC405760025
Cutting BoardElectron Microscopy Sciences63308
Ethanol, 190-proofPharmco-AAPER111000190
Ethanol, 200-proofPharmco-AAPER111000200
Glass Microscope slidesFisher12-550-343
Gloves, extended cuffMicroflex 19010144
Gowns, surgical-disposableKimberly-Clark 19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)Nalgene  1335920B
Kimwipes (large)Kimberly-Clark 34120
Kimwipes (small)Kimberly-Clark 34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)ThermoFisherN.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm Southeast Pathology Instrument ServiceN.A. 
Light MicroscopeOlympusCX43
Microscope objective (20X)Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17N.A.
Microscope objective (10X)Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-N.A. 
Molecular SievesAcros OrganicsAC197255000
Nuclease-free waterAmbionAM9937
PicoPure RNA extraction kitApplied Biosystems12204-01
Pellet PestleKimble Kontes4621973
PEN membrane LCM slidesArcturus, ThermoFisherLCM022
RNase-free tubes, 1.5 mLAmbionAM12400
RNaseZAP SigmaSigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)Applied Biosystems12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)Qiagen74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)Invitrogen15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)Qiagen74134
Splash Shield, disposable faceshieldFisher17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"Fine Science Tools14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)Nalgene  190-2520
Tissue Freezing MediumGeneral Data HealthcareTFM-5
XylenesFisherX3P1GAL

References

  1. Gershon, M. D. The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , HarperCollinsPublishers. 1st edn (1998).
  2. Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226(2015).
  3. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36(2010).
  4. Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
  5. Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  6. Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276(2014).
  7. PALM Protocols - RNA handling. , ZEISS. Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011).
  8. Schlaudraff, F. L. M. Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis. , Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015).
  9. Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
  10. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  11. Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
  12. Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
  13. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42(2014).
  14. Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3' tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851(2014).
  15. Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
  16. Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
  17. Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17(2016).
  18. Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).
  19. Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
  20. Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  21. Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575(2015).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136microdissection LCMRNACresylRNA RNA Seq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved