הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

Summary

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

Abstract

השימוש של מודלים מאתר לחקות מחלת כליות האדם הופך נפוץ יותר ויותר. המחקר שלנו מתמקדת להערכת הפונקציה glomerular סוכרת כלייתית ועכברים podocyte ספציפיים של VEGF הנוק-אאוט; לכן, פרוטוקול זה מתאר כליות מלא העבודה לשימוש במעבדה שלנו לצורך הערכת מודלים אלה העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. לעומת שיטות אלטרנטיביות הציג בספרות כדי להעריך את הפונקציה glomerular, השימוש בשיטת המתוארים במאמר זה מאפשר את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה היבטים מרובים. באמצעות שיטה זו, החוקר יכול לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון של המחלה נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה. השיטות לאפשר להערכה תפקודית מפורט של המכשול glomerular סינון באמצעות מדידה של השתן אלבומין קריאטינין יחס חדירות מים glomerular בודדים, וכן בדיקה מבנית והן אולטרה מבנית באמצעות חומצה המחזורית שיף הכתם מיקרוסקופ אלקטרונים. יתר על כן, ניתוח של dysregulated גנים ברמת mRNA, חלבון מאפשר ניתוח מכניסטית של הפונקציה glomerular. פרוטוקול זה מתאר את השיטות כלליים אבל יכולת הסתגלות ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

Introduction

השימוש של מודלים מאתר לחקות מחלת כליות האדם הופך נפוץ יותר ויותר. הדגמים מאתר כזה כוללים מודלים ספונטנית כגון באופן ספונטני עם יתר לחץ דם עכברושים (שומר)¹, streptozotocin (STZ)-induced סוכרתית חולדות, עכברים²והקלד db/db בעכברים סוכרתיים II³, מודלים מהונדס גנטית כגון ראשי ספציפי podocyte מוקד סגמנטלי glomerular טרשת נפוצה (FSGS) מודלים⁴, podocyte ספציפיים כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF-A) הנוק-אאוט (קו VEGF-A) דגם⁵, תסמונת אלפורט מודלים⁶והיא רכשה מודלים כגון כריתת כליה 5/6⁷ ו- ureteral חד צדדית את החסימה (UUO) מודל⁸. על מנת להעריך את ההיבטים השונים של הפונקציה glomerular במודלים אלה, מספר טכניקות זמינים. מטרת הנייר בשיטה זו היא להדגים מקיף העבודה מעלה כי יש לבצעו במודלים של העכבר של מחלת כליות כדי להעריך באופן מלא פונקציה glomerular.

הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו הוא שהם מאפשרים את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה היבטים מרובים. זה כולל הערכת את החדירות glomerular, חלבון וגם כדי מים, מומים מבניים glomerular ו שינויים הביטוי/שחבור של mRNAs, חלבונים חיוניים לתפקוד נורמלי glomerular. באמצעות שיטה זו, החוקר הוא מסוגל לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון המחלה, אשר נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה.

בספרות, זה תופעה שכיחה יוצגו עם דגם העכבר של מחלת glomerular איפה פנוטיפ נקבעת על-ידי רמה מוגברת של אלבומין בשתן. עם זאת, אין עדות לכך כי שיטה אחת לקביעת glomerular פונקציה אינה תמיד יעילה; מדידת קצב הפרשת אלבומין בדרכי השתן או על יחס השתן אלבומין קריאטינין (uACR) רק מספק מידע על תפקוד הכליות הכולל, ולא מתוך glomeruli בודדים. מחקרים קודמים הראו כי החדירות יכול להשתנות glomeruli שונה מן באותה כליה^5,9,10. בנוסף, הערכה של החדירות של הפרט glomeruli היא דרך רגישה יותר להעריך פונקציית glomerular; הטכניקה של מדידה של חדירות מים glomerular בודדים (L_pA / V_אני) הראתה להיות רגיש יותר לשינויים בתפקוד glomerular מאשר מדידה uACR⁹. Assay הזה הוא מועיל במודלים עכבר, כי הם עמידים בפני פרוטאינוריה, כגון אלה על רקע c57BL/6¹¹. היתרון של המאמר הנוכחי של השיטה היא כי זה בוחן הן את החדירות כליות מוחלטת כדי אלבומין, כמו גם את החדירות glomerular בודדים למים.

בחינה של מומים מבניים glomerular מוערך לעתים קרובות על ידי סוללה של כתמים כגון חומצה המחזורית שיף (PAS), trichrome, ואת כתמי כסף. אלה מאפשרים כליות פתולוג מיומן להעריך את הרמה של מחלת כליות באמצעות שיטת הניקוד. למרות כל שיטות טובות, שינויים במבנה-המאקרו glomerular הם לא תמיד נצפו אי-ספיקת כליות חריפה מודלים¹². שיטה זו מציעה כי בנוסף בביצוע טכניקות היסטולוגיה כליות שתוארו לעיל, האולטרה-המבנה glomerular גם וצריך להעריך באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM). פקעית מוכתם יכול להיראות נורמלי יחסית במיקרוסקופ אור רגיל; עם זאת, בעת הערכת עם EM, שינויים קטנים רוחב גלומרולרי במרתף (GBM), podocyte הרגל תהליך הצטנעות, fenestrations אנדותל וכיסוי של sub-podocyte שטח ניתוח. לכן חיוני כי glomerular אולטרה-מבנה והן -מבנה שקובעת כדי לקבוע המנגנון של תפקוד glomerular.

בנוסף להערכת מומים מבניים glomerular, שינויים ב- mRNA, ביטוי חלבונים שחבור, וכן הפעלת חלבון (למשל, זרחון), צריך להיבדק להבהיר עוד יותר על מנגנוני המחלה glomerular. כאשר מסתכלים על מחלת glomerular, או, לדוגמה, כאשר קו/over-expressing גן בפרט glomerular תאים, כגון ספציפי podocyte VEGF-A KO העכבר⁵, זה חשוב כי השינויים חלבון ה-mRNA נבדקים רק בהישג תאים glomerular, לא כל הכליה. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבה glomeruli מבודדים מן קליפת הכלייה העכבר, ולאחר מכן החלבון/רנ א הם מבודדים. זה מאפשר ניתוח ספציפי של dysregulation חלבון/mRNA glomeruli של מודל המחלה.

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

Protocol

כל הניסויים נערכו על פי חקיקה בבריטניה ואישור הוועדה האתית מקומיים. מחקרים שנעשו בבעלי חיים אושרו על-ידי אוניברסיטת בריסטול מחקר בוועדת האתיקה.

1. השתן אלבומין קריאטינין יחס (uACR)

הערה: uACR משמש כדי להעריך את החדירות של GFB כדי אלבומין. הנוכחות של אלבומין בשתן מצביעה על חדירות מוגברת מעבר GFB, אשר הוא מנורמל ל קריאטינין לפקד עבור וריאציות של קצב זרימת השתן. Albuminuria הוא סמן נפוצה מחלת כליות כרונית.

1. איסוף שתן על בסיס ניסיוני, במרווחי זמן קבועים (פעם בשבוע עד פעם חודשי) עד הקצה ניסיוני.
2. להגדיר את העכבר כלובים מטבוליים עם דיאטה מים והעשרה. הצב עכברים (זכר, בגילאי 6-8 שבועות) בכלובים בודדים עבור 6-אייץ ' בחדר שקט.
3. עכברים החזרה רגיל הדיור, לאסוף שתן מהכלובים ריק. נדרש מינימום של 50 µL.
   הערה: אם העכבר אינו מייצר שתן בזמן נתון, חזור ביום אחר בחדר חם.
4. Centrifuge בשתן ב 500 x g עבור 10 דקות לאסוף את השתן ולשמר משקעים כדי להעריך את אובדן podocyte. אחסן את השתן ב-20 ° C לטווח קצר בנקודה זו.
5. לדלל את השתן לתוך 1% אלבומין שור (BSA) ב 1 x Tris buffered תמיסת מלח (TBS pH 7.5) ב שבערך על דילול 1:10000, בהתאם לחומרת albuminuria.
   הערה: עוצמת הקול בסוף אמור להיות > µL 400. מיטוב כדי לקבוע דילול נכון כל זמן הצבע.
6. לכמת את ריכוז אלבומין השתן באמצעות של העכבר אלבומין אנזים immunosorbent מקושר assay (אליסה) לפי הוראות היצרן.
   1. בקצרה, מעיל לצלחת אליסה, אשר ממוטבת עבור איגוד חלבון, עם 100 µL של נוגדן ראשוני אנטי-העכבר אלבומין (10 µg/mL ב 0.5 M ביקרבונט-קרבונט pH 9.6) לשעה בטמפרטורת החדר.
   2. שטיפת עודפי נוגדנים מן הבארות חמש פעמים עם 1 x TBS פלוס 0.05% Tween (pH 8.0), ולהוסיף 200 µL של חסימת פתרון (1 x TBS עם 1% BSA pH 8.0) ללילה בטמפרטורת החדר.
7. לשטוף את הצלחת חמש פעמים ולהוסיף µL 100 תקנים (דילול טורי: 2000 µg/mL כדי µg/mL 15.63 ב 1 x TBS עם 1% BSA, pH 8.0), הריק, והדוגמאות מדולל דולר. להשאיר לשעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשטוף צלחת חמש פעמים.
   1. להוסיף 100 µL של נוגדן זיהוי HRP לכל טוב (10 ng/mL ב 1xTBS עם 1% BSA, pH 8.0), דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח.
   2. לשטוף את הצלחת חמש פעמים ולהוסיף 100 µL של אנזים מצע פתרון טוב לכל. להשאיר את הצלחת בחשיכה לפתח למשך 15 דקות, לעצור את התגובה על-ידי הוספת 100 µL של חומצה גופרתית מ' 0.18 (H₂אז₄).
      התראה: H₂כדי₄ הוא מאכל.
8. לקבוע את ריכוז אלבומין כל מדגם על-ידי קריאת את הצלחת ספיגת של 450 ננומטר. השתמש העקומה סטנדרטי כדי לכמת את אלבומין נוכח כל דגימה. אם חוזר טכני יש קורות חיים ערך גדול מ- 5%, חזור על וזמינותו הדגימות.
9. לחלופין, להעריך את ריכוז אלבומין השתן באמצעות אלקטרופורזה. להוסיף 5 µL של 4 x חלבון לדוגמה טעינת מאגר µL 15 של שתן. מחממים דגימות עד 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן טעינה לתוך ג'ל טריס precast 4-12%.
   1. הפעל את הג'ל 100 וולט, הכתם למשך הלילה בכחול Coomassie לכל הפרוטוקול של היצרן.
   2. לאחר הדמיה הג'ל, השתמש densitometry כדי להעריך את הקיפול שינוי ריכוז אלבומין יחסי שליטה.
      הערה: אם אין להקות שנצפו אלבומין כאשר צפוי, להעריך את ריכוז חלבון בשתן, לכוונן את עוצמת הקול של שתן לג'ל ההתפחה הוספנו.
10. לדלל את דגימת שתן raw ב- dH₂O-1:1, 1:5 ו- 1:10.
    הערה: עוצמת הקול בסוף אמור להיות > 70 µL. מיטוב כדי לקבוע את הדילול נכון של כל דגימה.
11. לכמת את ריכוז קריאטינין השתן שימוש assay כימי לפי ההוראות קיט. בקצרה, טען µL 20 של קריאטינין סטנדרטים, שתן ריק, או מדולל על צלחת טוב 96 דולר.
12. לקבוע את ריכוז קריאטינין כל דגימה על-ידי קריאת את הצלחת ספיגת של 490 nm לפני ואחרי התוספת של הפתרון חומצה (זהירות, שורף; למנוע מגע עם העור).
    הערה: ההבדל בין הערכים ספיגת הוא ביחס ישר לריכוז קריאטינין בכל מדגם. עיקול רגיל הוא דור של הסטנדרטים. אם חוזר טכני יש קורות חיים ערך גדול מ- 5%, חזור על וזמינותו הדגימות.
13. ליצור את uACR (µg/מ ג). לנרמל את הנתונים לערך הבסיסית של כל בעכבר על ייצוג גרפי.

2. רקמת ואוסף דם

הערה: בכליות ורקמות glomerular יכול לשמש כדי להעריך סמנים ביטוי מבנית, חלבון ו- mRNA של מחלת כליות. הדם יכול לשמש כדי להעריך סמנים של תפקוד הכליות, כגון קריאטינין, אשר יכול להיות מוסדר למעלה, מחלת כליות, המעידה על הפחתת הקיבולת סינון של glomeruli.

1. להכין את הפתרונות הבאים: גלוטראלדהיד 2.5% טרי ב- 0.1 M נתרן cacodylate (pH 7.3), 4% paraformaldehyde 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), תמיסת רינגר יונקים (115 מ מ נתרן כלורי (NaCl), 10 מ מ סודיום אצטט (CH₃COONa), 1.2 מ מ סודיום פוספט (נה₂HPO₄), 25 מ מ סודיום ביקרבונט (NaHCO₃), 1.2 מ מ מגנזיום גופרתי (MgSO₄), 1 מ מ סידן כלורי (₂CaCl), גלוקוז D (+) בעובי 5.5 מ מ, pH 7.4) עם 1% BSA, 1 x PBS.
   התראה: 2.5% גלוטראלדהיד: רעיל, sensitizer, מגרה; השתמש ב- fume cabinet. 0.1 cacodylate נתרן M: רעיל, שימוש בארון fume. 4% מחברים: מקבע, שימוש בארון fume
2. להכין את החומרים הבאים: איזופלוריין, חומצה ethylenediaminetetraacetic קטן (EDTA)-מצופה צינורות דם, מחטים 23-25 גרם, 5 מ"ל EDTA מצופה מזרקים, צלוחיות זכוכית 10 מ ל, צלוחיות פלסטיק 10 מ"ל, צינורות פלסטיק 0.5 mL, בתבניות חד פעמיות רקמות, קרח יבש, נוזל N ₂, כלי ניתוח העכבר, חיתוך אופטימאליים בינוני (אוקטובר).
3. הנח את העכבר תחת הרדמה עמוקה, אשר מאומתת על ידי העכבר להיות שאינם מגיבים שמוק מחט כדי לרפד את הרגל, באמצעות תא איזופלוריין, או נתיבי המקבילה של הרדמה מסוף כגון בזריקות הרדמה סוכנים (פנטוברביטל, 50 מ"ג/ק"ג בקרום הבטן [IP]; avertin, ה-IP 240 מ"ג/ק"ג), או חשיפה פחמן דו-חמצני (CO₂) (75% CO₂/25% O₂).
4. ללקט העכבר באמצעות ניקוב הלב לתוך החדר השמאלי ולאסוף כמה שיותר דם ככל האפשר. העברת הצינור דם EDTA מצופים עבור עד 4 שעות. אם מועדף, יכול ליקטו עכברים דרך צוואר הרחם פריקה עם מטופל לא להיקרע ומוחלף.
5. שווייץ הכליות דרך הבטן לרחוץ קרח קר 1 x PBS.
6. לבחון glomeruli קורטיקלית, להסיר את מוט אחד של קליפת הכלייה וחותכים לחתיכות³ 1 מ מ. כדי לבחון glomeruli עמוק ארתרוזיס-מדולרי, חזור על אותה שיטה עם רקמת לשד. מקום 5 מ של 2.5% פתרון גלוטראלדהיד בקבוקון זכוכית EM. חנות ב 4 º C.
   התראה: 2.5% גלוטראלדהיד פתרון: רעיל, sensitizer, מגרה; השתמש ב- fume cabinet
   הערה: תהליך בתוך חודש לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
7. כלים, להסיר בשליש העליון של הכליה, כדי להבטיח glomeruli בקליפת המוח והן ארתרוזיס-מדולרי יהיה נוכח, וכן תיקון ב- 5 מ של 4% paraformaldehyde ב 4 ° C עבור ה 24 העברה עד 5 מ"ל של 70% EtOH למשך 24 שעות לפני הטבעה של פרפין.
   התראה: 4% מחברים: מקבע, שימוש בארון fume
8. עבור immunofluorescence, מקום שלישי הכליה, כדי להבטיח glomeruli בקליפת המוח והן מדולרי יהיה נוכח, לתוך רקמות עובש ואת המעיל ב אוקטובר במקום על קרח יבש להקפיא ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
9. עבור חלבון ו- RNA, מקום 3 x 2 מ מ³ חתיכות של קליפת הכלייה לתוך צינורות פלסטיק 0.5 mL, הצמד להקפיא נוזלי N₂. חנות ב-80 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך רקמות עבור ה-RNA, מקום רקמות 5 כרכים של RNA מייצב פתרון ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
10. עבור בידוד של glomeruli, לחתוך את רקמת הכליה הנותרת והציבו ב 5 מ של תמיסת רינגר יונקים עם 1% BSA על קרח. היכונו ניפוי glomeruli מיד.

3. קריאטינין פלזמה

הערה: קריאטינין פלזמה ניתן להמציא מוסדר מחלת כליות, המעידה על הפחתת הקיבולת סינון של glomeruli. רמות חנקן (BUN) של שתנן בדם יכול גם להיות מוערך, אף הפרוטוקול לא מתואר כאן.

1. Centrifuge את דגימת הדם ב 500 g x למשך 15 דקות ב 4 º C.
2. לאסוף את הפלזמה, אשר יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C לטווח קצר בנקודה זו.
3. לכמת את ריכוז קריאטינין פלזמה שימוש assay קריאטינין כימי לפי ההוראות למעלה עבור קריאטינין השתן בפרוטוקול 1.11.
4. לקבוע את ריכוז קריאטינין כל דגימה על-ידי קריאת את הצלחת ספיגת של 490 nm לפני ואחרי התוספת של הפתרון חומצה.
   הערה: ההבדל בין ערכים אלה ספיגת הוא ביחס ישר לריכוז קריאטינין בכל מדגם. עיקול רגיל הוא דור של הסטנדרטים. אם חוזר טכני יש קורות חיים ערך גדול מ- 5%, חזור על וזמינותו הדגימות.

4. בידוד של Glomeruli

הערה: יכול להיות מבודדים Glomeruli כדי להעריך את החדירות של הפרט glomeruli ex-vivo, וכן את הביטוי של חלבון ספציפי וסמנים mRNA של מחלת glomerular.

1. . קח את רקמת הכליה יכניסו תמיסת רינגר יונקים עם 1% BSA ומנתחים glomeruli באמצעות תקן ניפוי טכניקה¹³. בקצרה, מחסנית של 70 מיקרומטר (למטה), 100 מיקרומטר, 125 µm, 175 מיקרומטר, מיקרומטר 250 ו מיקרומטר 425 הנפות (העליון) על גביע זכוכית.
2. מועכים את הכליה, באמצעות מזרק בוכנה, לתוך מיקרומטר 425 ניפוי, יקדם באמצעות קרח קר בתרבית של תמיסת רינגר BSA 1%. הסיביות של הכליה יידחפו, להסיר את המסננת העליון, להמשיך לעשות את אותו הדבר הבא. . אני חוזר עד רק ה-100 מיקרומטר הנפות מיקרומטר 70 נותרו.
3. העברת הקציר glomerular נשמר על ידי מיקרומטר 100 על 70 מיקרומטר הנפות עד 10 מ"ל של תמיסת רינגר טריים יונקים עם BSA 1%, על קרח.
   הערה: אם מספר glomeruli לכל תמיסת רינגר mL כמה, להפחית את עוצמת הקול של תמיסת רינגר נהגו לאסוף glomeruli שתי הנפות.
4. הסר מ של התמיסה המכילה glomeruli לתוך שני צינורות נפרדת (2.5 מ ל כל אחד), צנטריפוגה-1000 g x 10 דקות ב 4 º C. להסיר את תגובת שיקוע, הצמד להקפיא glomeruli נוזלי N₂ לפני אחסון ב- 80 ° C עבור חלבון והפקת RNA במועד מאוחר יותר.
5. מקם את הפתרון הנותרים המכילים glomeruli באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C למדידת glomerular L_pA / V_אניex-vivo. להשלים בתוך 3 שעות של הסרת הכליה.

5. חדירות מים glomerular (L_pA / V_אני)

הערה: glomerular L_pA / V_אני assay מאפשר שמחוץ במדידת החדירות של הפרט glomeruli ב לשחזור באופן מהיר. עלייה glomerular L_pA / V_אני מציין שיבוש GFB, אשר הוא סוגסטיבי של מחלת כליות.

1. להגדיר את glomerular L_pA / V_אני לבוש כפי שמתואר סלמון ואח'¹⁰. נא עיין באיור 1 עבור תרשים מפורט הגדרת.
2. להכין את הפתרונות הבאים: תמיסת רינגר יונקים עם 1% BSA (pH 7.4), תמיסת רינגר יונקים עם 8% BSA (pH 7.4). לחמם את שניהם ל- 37 מעלות צלזיוס.
3. משוך micropipettes מ זכוכית צינורות קפילר (צפיפות אופטית: 1.2 מ מ). ליצור 5-8 מיקרומטר צמצם עצה על ידי גזירה את micropipette תחת מיקרוסקופ.
4. להשתמש את glomerular L_pA / V_אני לבוש לתפוס glomeruli בודדים ללא פגע חופשיים של קפסולה של באומן ושברי הכרישים על גבי micropipette באמצעות שאיבה. סיכום מפורט של וזמינותו oncometric מצוי סלמון ואח'¹⁰. בקצרה, ברגע פקעית הוא נתפס ומאובטחים על micropipette היניקה, להתחיל בהקלטת וידאו פקעית מתחת למיקרוסקופ.
5. ראשית, equilibrate של פקעית בפתרון 1% BSA רינגר ב-30 s לפני המעבר של perifusate מרוכזת 8% BSA תמיסת רינגר 10 s. לאחר מכן לעבור את perifusate חזרה אל תמיסת רינגר BSA 1%, לעצור את ההקלטה.
6. לשטוף את פקעית, חזור על התהליך עבור 10-15 glomeruli לכל העכבר. להבטיח תעריפי זרימת perifusate הם זהים ולא על מהירות (10 מ ל/דקה) כדי לא לעוות את מבנה glomerular.
7. למדוד את קצב הראשונית של הצטמקות glomerular כדי לחשב את החדירות glomerular מים (L._p. A) מנורמל לאמצעי האחסון glomerular (V_אני). ניתן למצוא מידע מפורט לגבי הניתוח סלמון ואח'¹⁰.

6. המחזורית חומצה שיף (PAS) כתם

הערה: הכתם PAS ידגיש הממברנות במרתף של לולאות נימי glomerular, האפיתל צינורי. הוא מאפשר ויזואליזציה מפורטת של תאים glomerular, mesangial מטריקס ופוטנציאל הרחבה, שינויי פוטנציאל GBM (קרי, עיבוי ואי סדרים).

1. בסעיף קליפת הכליה פרפין-מוטבע, כדורגלן-קבוע באמצעות מיקרוטום עובי 5 מיקרומטר על גבי שקופיות מצופה פולי-L-ליזין. יבש ב 37 ° C עבור ה 1 ודא המקטע אינו מכיל כל הקפלים או חורים, אשר יכולה לעוות המורפולוגיה מתחת למיקרוסקופ.
2. Deparaffinize השקופיות על-ידי המקננת פעמיים ב קסילן (זהירות, מגרה; שימוש בארון fume) למשך 3 דקות, פעמיים ב 100% EtOH למשך 3 דקות, ולאחר מכן ב 95%, 70% ו- 50% EtOH למשך 3 דקות כל אחד, כל בטמפרטורת החדר. מימה מחדש את השקופיות dH₂O.
3. דגירה השקופיות בפתרון המחזורית חומצה (זהירות, מגרה; שימוש בארון fume) (1 g/dL) עבור 5 דקות ולאחר מכן לשטוף השקופיות מספר שינויים של dH₂O. להשתמש מיכל עם 100 מ ל dH₂O בטמפרטורת החדר.
   התראה: חומצה המחזורית פתרון: מגרה; להשתמש בארון fume
4. דגירה בשקופיות ריאגנט של שיף (Parasoaniline HCl 6 g/L ו נתרן metabisulfite 4% HCl 0.25 מול/ליטר) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות מפעיל ברז מים במשך 5 דקות.
5. Counterstain עם Hematoxylin 3 s לפני השטיפה ביסודיות שקופיות פועל מי ברז למשך 15 דקות.
   הערה: אופטימיזציה מסוימים עשויים להידרש כדי לקבוע את הזמן האופטימלי עבור Hematoxylin מכתים.
6. מייבשים השקופיות באמצעות ההפך של פרוטוקול deparaffinization בשלב 6.2. לסיים עם קסילן.
7. אוויר יבש שקופיות והר עם מדיה מבוססי קסילן הרכבה.
8. תמונה על מיקרוסקופ אור בהגדלה X 400 להעריך glomerular מבנים. להעריך את הדברים הבאים: עיבוי ואי סדרים של GBM, כיווץ של לולאות נימי, שהותירה רקמות, טרשת נפוצה, התפשטות הסלולר (אנדותל, podocyte, mesangial, או תאים דלקתיות שחדר את אניץ).
   הערה: עבור הערכה מקיפה של פתופסיולוגיה glomerular, נגעים בחלקים אחרים של הכליה צריך להיות הערכה, כגון בקוריאנית.

7. הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)

הערה: TEM מאפשר הבחינה של מומים מבניים אולטרה בכליה, כגון GBM, תהליכים רגל podocyte, ו fenestrations אנדותל, אשר אינם גלויים עם מיקרוסקופ אור. זה חשוב דגמים היכן כליות נזק לא כל-כך מבטאים את זה (כלומר, לא albuminuria, מומים מבניים עיקריים).

1. לקחת gluteraldehdye 2.5% - קבוע קוביות הכליה ותקן פוסט ב 1% אוסמיום ארבע-חמצני עבור 1 ח' שטיפת ב 50 מ ל 0.1 M cacodylate מאגר (pH 7.3) ולאחר מכן 50 מ של dH₂O (3 x 15 דקות משתנה).
   התראה: 2.5% גלוטראלדהיד: רעיל, sensitizer, מגרה; השתמש ב- fume cabinet. 0.1 cacodylate נתרן M: רעיל, שימוש בארון fume
2. מייבשים עם EtOH, להטביע שרף Araldite.
3. לחתוך קטעים ב- 50-100 ננומטר עובי ו כתם עם 3% uranyl (מימית) אצטט והפתרון ציטראט של ריינולדס עופרת.
4. קח את micrographs דיגיטלי על מספר אזורים פקעית-940 X, 1250 X, ו- 6200 X כדי לוודא podocytes, GEnCs, GBM ו מזנגיום ניתן לזהות.
5. השתמש ImageJ כדי לנתח glomeruli עיוור. הגדר את המידה עבור כל micrograph 6200 X על ידי ציור קו בין שתי נקודות מרחק ידוע, כגון סרגל. ללכת לניתוח, ולאחר מכן הגדר קנה מידה, שבו מוצגות את אורך הקו בפיקסלים. הקלד המרחק ידוע ויחידות מידה. השתמש הפרוטוקולים המפורטים להלן עבור המידה של כל פרמטר.
   הערה: ניתוח זה דורש בסביבות 1 יום לפי העכבר. לשימוש הולם עוצמה סטטיסטית, המדידות הממוצע מ glomeruli 3 מ- 3 עכברים.
   1. GBM, להוסיף רשת דיגיטלית קבועה (10 x 10) מעל micrograph 6200 X, למדוד את עובי GBM בנקודה שבה קווי הרשת לחצות GBM. מדוד קרום התא אנדותל הבזליים אל קרום התא תהליך של הרגל podocyte הבזליים בהשקה בניצב על קרום התא אנדותל באמצעות הכלי קו ישר. לקבוע את המידה כלומר עבור כל פקעית מ 10 מדידות.
   2. עבור המספר אשנוב אנדותל, למדוד את האורך של GBM נוכח micrograph 6200 X, לספור את מספר fenestrations אנדותל עבור אורך יחידה של GBM. קח ממוצע בין micrographs לפחות 4 לכל פקעית.
   3. עבור podocyte הרגל תהליך רוחב, להוסיף רשת דיגיטלית קבועה (10 x 10) מעל micrograph 6200 X. למדוד את הרוחב של התהליכים רגל podocyte לחצות את קווי הרשת. למדוד את הרוחב בחלק הרחב ביותר של תהליך רגל בו הוא נפגש עם GBM; ודא הקו בניצב הטנגנס של קרום הבסיס podocyte. לקבוע את המידה כלומר עבור כל פקעית מ 10 מדידות.
   4. Podocyte חתך רוחב, להוסיף רשת דיגיטלית קבועה (10 x 10) מעל micrograph 6200 X. למדוד את הרוחב של דיאפרגמות לחתוך podocyte לחצות את קווי הרשת. זוהי נקודת איפה התהליכים רגל הם הקרובים ביותר יחד, בחלק הרחב ביותר של כל תהליך רגל, מן podocyte ממברנה אל הממברנה. ודא המדידה בניצב הטנגנס של קרום הבסיס podocyte. לקבוע את המידה כלומר עבור כל פקעית מ 10 מדידות.
   5. עבור המספר של podocyte רגל תהליכים, למדוד את האורך של GBM נוכח micrograph 6200 X, לספור את מספר התהליכים רגל podocyte עבור אורך יחידה של GBM. קח ממוצע בין micrographs לפחות 4 לכל פקעית.
   6. עבור כיסוי שטח sub-podocyte, ראה שיטה מפורטת של ניל ואח. ¹⁴.
6. שימוש של micrographs X 940, לבחון glomeruli לנוכחות של מבנה לא תקין, פיקדונות, תסנין לפי העין.

8. immunofluorescence עבור Podocyte וסמנים אנדותל

הערה: Immunostaining מאפשר הדמיה של דפוסי ביטוי של חלבונים, כגון לולאות אנדותל נימי, אשר ניתן לכווץ את מחלת glomerular.

1. מקם את OCT-עובש המכיל הכליות קפואים ב-20 ° C כבר שעתיים לפני חלוקתה. ודא שהשטח לחתוך של הכליה ממוקמת בקפידה נגד לתחתית התבנית-OCT כדי לאפשר מקטעי רקמת orientated טוב.
2. שימוש של cryostat, ברקמות סעיף 5 מיקרומטר עובי על פולי-L-ליזין מצופה שקופיות.
   הערה: ודא ואין קיפולים או חורים בסעיף רקמות, אשר יכולה לעוות המורפולוגיה.
3. בעת הסרת מ cryostat, לתקן את שקופיות ב- 4% מחברים עבור 10 דקות לשטוף שקופיות 3 x 5 דקות במיכל עם 100 מ של dH₂O.
   התראה: 4% מחברים: מקבע, שימוש בארון fume
4. כדי למזער את כמות נוגדנים בשימוש, לצייר מקטעים עם עט הידרופובי. אל תתנו הסעיפים יבש.
5. דגירה בחסימה פתרון (BSA 3% ו- 5% סרום רגילה ב- 1 x PBS) לשעה בטמפרטורת החדר.
6. הסר את הפתרון חסימה עם העצמות, דגירה מקטעים עם נוגדן ראשוני (Nephrin, podocin או PECAM-1) מדולל 1:250 (BSA 3% ב- PBS 1 x). המקום שקופיות בתוך תא humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אם תא לח אינה זמינה, קלות להניח פס קטן של מצלמות-מיקרוסקופים מעל לשקופית מצופים נוגדן. יש להיזהר בעת הסרת למחרת כדי לא לשבש את המקטע.
7. רחץ שקופיות 3 x 5 דקות ב- 1 x PBS.
8. דגירה עם 1:1000 דילול המתאים נוגדנים משניים פלורסנט (BSA 3% ב- 1 x PBS) עבור 2 h בטמפרטורת החדר בחושך.
9. רחץ שקופיות 3 x 5 דקות ב- 1 x PBS. הר עם פלורסנט טעינת המדיה המכילה דאפי.
10. תמונות שקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה X 400 כדי להציג glomeruli. ודא שזה היא מתעוורת כדי למנוע הטיה.
11. השתמש ImageJ כדי לנתח את העוצמה מכתימים מנורמל לאזור glomerular, ואת התבנית של צביעת, קרי, מספר לולאות נימי מנורמל לאזור glomerular, באופן עיוור.

9. חלבון החילוץ החיוורים ומכתים המערבי

הערה: סופג המערבי מאפשר לנו להעריך את החלבונים ביטוי ידוע dysregulated של מחלת כליות. לדוגמה, ירידה בביטוי podocin ו- nephrin מצביע על אובדן podocyte.

1. תמצית חלבון לבין קליפת הכלייה sieved glomeruli; הפרוטוקול זהה עבור כל אחד, הנפח של פירוק מאגר מותאם עבור כמות הרקמה.
2. הפשרה כליות/glomeruli על הקרח לפני הוספת NP-40 פירוק מאגר מעכבי פרוטאז, פוספטאז המכיל (150 מ מ NaCl, 1% NP-40, 50 מ מ טריס pH 8). Homogenize לדוגמה עבור 30 s.
3. דגירה בדגימות homogenized על קרח למשך 30 דקות, vortexing במרווחי זמן קבועים.
4. Centrifuge את הדגימות ב g x 10,000 למשך 15 דקות ב 4 º C.
5. הסר את תגובת שיקוע לרכבת התחתית טריים על קרח.
   הערה: מצפה לשחזר כ- 1 מ ג חלבון ליום המדגם.
6. Denature את החלבונים באמצעות המאגר x Laemmli תקן 4. מרתיחים את התערובת ב 95-100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
7. להעריך את הביטוי של חלבונים סמן תא glomerular (Nephrin, Podocin, PECAM-1, וכו '.), זרחון וביטוי חלבונים ידוע/המשוערות כדי להשתנות ב glomeruli/הכליה של הדגם המחלה באמצעות ווסטרן סופג ( השיטה הרגילה; ורד פנחסוב ויאנג¹⁵).
   הערה: הפרוטוקול משתנה בהתאם גודל ואת שפע של החלבון עניין.

10. RNA החילוץ ואת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR)

הערה: mRNA ביטוי ניתוח מאפשרת לנו לקבוע איך הגנים מוסדרים, מחלת כליות, כגון שינויים ביטוי גנים שחבור חליפי.

1. בעוד קליפת הכלייה עדיין קפוא, ביסודיות לטחון ב- 3 מ"ל של פנול ריאגנט באמצעות שהעקב פצצות מרגמה. אם באמצעות תמציות glomerular, להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט פנול, homogenize לדוגמה עבור 30 s.
   התראה: ריאגנט TRIzol: מגרה; להשתמש בארון fume
2. לבצע משימת חילוץ RNA באמצעות השיטה המתוארת על-ידי Chomczynski ועוד Sacchi¹⁶.
   הערה: ערכות חילוץ RNA מסחריים זמינים כחלופה לשיטה זו.
3. להעריך את כמות ואיכות RNA שהושג באמצעות אחת השיטות השונות הזמינות. רנ א היא aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס בנקודה זו. להימנע חוזר להקפיא מפשיר.
   הערה: אם חדש לשיטה זו, בדוק את האיכות של RNA לפני שתמשיך לשלב הבא על-ידי הפעלת את הרנ א ב ג'ל agarose כדי להבטיח 28S ברור והלהקה ribosomal 18S. מצפה להתאושש בין 2-5 µg של RNA בשיטה זו.
4. DNase לטפל µg 1 של RNA (יצירת אמצעי אחסון עד 10 µL במים נטולי RNase בתוספת 1 µL של DNase µL 1 DNase המאגר) עבור 1 h-37 מעלות צלזיוס. לעצור את התגובה עם 1 µL של DNase להפסיק פתרון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
5. הוסף µL 0.5 oligo (dT), תחל אקראי. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
6. מיד להרוות בקרח במשך 5 דקות.
7. להוסיף את הפעולות הבאות; האנזים רוורס טרנסקריפטאז MMLV (400 U; החלף DEPC H₂O RT - שליטה לדוגמה), מאגר MMLV (1 x), מעכב מיקס (0.5 מ מ), ואת ribonuclease dNTP (40 U); להפוך µL עד 50 עם מים DEPC.
8. דגירה תערובת התגובה ב 37 ° C עבור h 1 ואחריו 95 ° C עבור 5 דקות כדי לבטל את האנזים.
   הערה: כדי להפיק תשואה גבוהה יותר של cDNA, דגירה ב 37 ° C עבור עד 3 שעות.
9. להעריך את כמות ואיכות cDNA באמצעות השיטות השונות הזמינות.
10. שימוש PCR כדי להעריך את דפוסי שחבור וביטוי של mRNA של גנים היא שממוצע dysregulated במודל glomerular המחלה. הפרוטוקול משתנה בהתאם הגן עניין.

תוצאות

שתן נאסף באמצעות כלובים מטבוליים פראי סוג (WT), inducible podocyte ספציפיים של VEGF מדהימה (קו VEGF-A), VEGF-A קו X Neph-VEGF₁₆₅b עכברים (VEGF-A KO עכברים המבטאים יתר על המידה את isoform b VEGF-A אנושי₁₆₅ב podocytes ב אופן המכונן). על מדידה של יחס השתן אלבומין קריאטינין שבועות 0, 4, 10 ו- 14 לאחר דוקסיציקלין אינדוקציה של VEGF-A קו, קו VEGF-A עכברים שפיתח albuminuria מתקדמת 10 שבועות לעומת WT littermate שולט. ניתן לראות את הערכים המוחלטים איור 2A, ו מנורמל לקו הבסיס של כל הערכים העכבר איור 2B. עם זאת, albuminuria, לא נצפו בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b (איור 2), המציין את VEGF-A₁₆₅b הוא מגן הדגם של albuminuria⁵.

Glomerular L_pAV_אני נמדד glomeruli בודדים sieved מ- WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b הכליות. דוגמה איך נתפסת פקעית הצטמקות נצפתה כאשר perifused עם 8% BSA מוצג איור 3 א. הצטמקות זה משמש לאחר מכן כדי לקבוע את glomerular L_pA / V_אני עבור כל פקעית (איור 3B). עכברים KO VEGF-A היה משמעותי מוגברת glomerular L_pA / V_אני בגיל 14 שבועות להציב אינדוקציה VEGF-קו בהשוואה WT שליטה glomeruli. למרות התחתון בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b, מוגברת glomerular L_pA / V_אני לא סוכלה ע י ביטוי יתר של VEGF-A₁₆₅b ב- 14 שבועות⁵.

צביעת PAS סעיפים קליפת הכלייה 14 שבועות לאחר אינדוקציה של VEGF-A קו שלא גילתה שום מומים מבניים glomerular בעכברים VEGF-A קו או VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b (איור 4A). עם זאת, לאחר ניתוח של האולטרה-מבנה glomerular ויה EM, עכברים VEGF-A קו היה שפותחה על רוחב GBM גדל ירד מספר fenestrae אנדותל, ירד SPS כיסוי, עלה הממוצע podocyte חתך רוחב (איור 4C-4F ). כף הרגל podocyte הממוצע לעבד רוחב ומספר חריצים נותר ללא שינוי (איור 3B ו- 3g). ביטוי יתר של VEGF-A₁₆₅b בעכברים VEGF-A KO מנעה את השינויים כדי GBM ולאחר חתך רוחב (איור 4C ו- 4F). עם זאת, VEGF-A₁₆₅b לא היתה השפעה על fenestrae שינו את המספר של SPS כיסוי (איור 4D ו- 4E)⁵.

RT-PCR שבוצעה ב- RNA מופק sieved glomeruli גילה כי האדם VEGF-₁₆₅לחצ mRNA קיים רק בעכברים VEGF-A KO X Neph-VEGF-A₁₆₅b (איור 5A). בעת חילוץ חלבון sieved glomeruli והערכה רמות חלבונים באמצעות סופג המערבי, ביטוי חלבונים glomerular של VEGFR-2 נמצאה הניתנות להפחתה בעכברים VEGF-A קו, אשר נמנעה על ידי ביטוי יתר של VEGF-A₁₆₅b ( איור 5B ו- 5 C)⁵.

איור 1. Diagrammatic הקים של המתקן glomerular חדירות (L_pא). (א) פקעית נתפס (ב') micropipette בתוך מחזיק באמצעות שאיבה, אשר היא להדק על הר ליציבות. (ג) microslide מלבני. (ד) 4 X מטרת מיקרוסקופ עם מצלמת וידאו. (ה) 1% פתרון BSA התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. (נ) 8% BSA פתרון התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. (G) מרחוק הקש על שורות המכילות perifusate שני לה להתנהגות, מה שמקנה exchange perifusate מהירה. המסלול (H) של perifusate לכיוון microslide, אשר לאחר מכן מתרחץ של פקעית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. השתן אלבומין קריאטינין יחס. (א) הערכים uACR שבועות 0, 4, 10 ו- 14 לאחר אינדוקציה של VEGF-A KO בעכברים b₁₆₅WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A. (ב') אותם ערכים uACR מנורמל לערך בסיסית (לשבוע 0) של כל עכבר בודדות. UACR גדל באופן משמעותי בעכברים VEGF-A KO שבועות 10 ו- 14 לעומת WT littermate שולט, אשר נמנעה בעכברים b₁₆₅VEGF-A X Neph-VEGF-A (* p < 0.05; אנובה דו-כיווני, תיקון להשוואה בין זוגות; n = 4-12 עכברים לכל נקודת זמן; קווי שגיאה: שגיאת התקן של הממוצע [SEM]). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3. מידת חדירות מים glomerular. (א) פקעית נתפס. את micropipette באמצעות שאיבה; perifusate הוא החליף מ- 1% BSA (Ai) 8% BSA (כל), התכווצות glomerular נצפית. (B) מדידות נלקח לפני ואחרי הבורר BSA 8% משמשים כדי לקבוע את glomerular L_pA / V_אני. (ג) עכברים VEGF-A KO לפתח של מוגברת glomerular L_pA / V_אני בגיל 14 שבועות להציב אינדוקציה של VEGF-A קו לעומת WT שולט. זה לא היה משמעותי מנעה בעכברים VEGF-A X Neph-VEGF-A, b₁₆₅(* p < 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 4-9 עכברים, glomeruli 15-30; קווי שגיאה: SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 4. ניתוח מבנה glomerular. (א) צביעת PAS של קליפת הכלייה לא מצביעים על חריגות מבנית ב glomeruli מ- WT, קו VEGF-A ו VEGF-A X Neph-VEGF-A₁₆₅b עכברים (Ai - iii). EM גילה מומים מבניים אולטרה ב glomeruli VEGF-A KO (Aiv - vi). (ב') FPW הממוצע לא השתנו בין קבוצות. (ג) ה GBM גדל glomeruli VEGF-A KO, אשר נמנעה על ידי VEGF-A₁₆₅ב' (ד) מספר fenestrae ירדו ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נותרה שהודעה על ידי VEGF-A₁₆₅ (E) נולד ב- SPS הכיסוי היתה ירידה ב VEGF-A KO glomeruli, אשר גם נשאר ללא שינוי על ידי VEGF-A₁₆₅ב' (נ) הממוצע חתך רוחב הוגדל ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נמנעה על ידי VEGF-A₁₆₅ב' (G) המספר שסע היה ללא שינוי בין שלוש הקבוצות (* p < 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 3 עכברים, 9 glomeruli; קווי שגיאה: SEM). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5. ביטוי mRNA וחלבון סמנים. (א) RT-PCR הראה כי הביטוי mRNA b₁₆₅VEGF-A האנושי היה רק ניכר glomeruli sieved מ- VEGF-A קו X Neph-VEGF-A₁₆₅b עכברים. (B) סופג המערבי ציין כי ביטוי חלבון VEGFR-2 היה למטה מוסדר ב VEGF-A KO glomeruli, אשר נמנעה ב VEGF-A KO X Neph-VEGF-A₁₆₅b glomeruli (* p < 0.05; דרך אחת ANOVA, Bonferroni תיקון להשוואה בין זוגות; n = 3 - 6 עכברים; קווי שגיאה: SEM). איור זה השתנה מ סטיבנס ואח⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר glomerular המחלה, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השלבים הקריטיים בכל שיטה לאפשר ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, כולל הערכה של החדירות של הכליות בכללותה (uACR ופלסמה קריאטינין מידות), החדירות של glomeruli בודדים (glomerular L_pA / V_אני), בדיקה של שינויים מבניים (PAS Trichrome כחול, EM), חלבון לוקליזציה (אם), וכן ביטוי גנים glomerular (RT-PCR ו סופג המערבי). שיטות אלה הם המפתח אישיותי של הפונקציה glomerular במודלים של העכבר של מחלת כליות.

כאשר מעריכים את החדירות של GFB, מחקרים רבים שבחרו להשתמש קונבנציונלית uACR או 24 שעות אלבומין הפרשה קצב אמצעי יעיל^17,18. למרות שיטות אלה מאפשרות הערכת החדירות GFB בכללותה, זה אינו מאפשר הערכת הפרט חדירות glomerular והגיוון בין glomeruli. מחקרים קודמים מצאו מדידה של glomerular L_pA / V_i להיות מדד רגיש יותר לשינויים GFB חדירות^5,9. אכן, בתוצאות נציג הפגינו בעיתון הזה, ב- 14 שבועות לכתוב אינדוקציה של קו VEGF-A, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A₁₆₅b עכברים יש של uACR נמוך באופן משמעותי בהשוואה ל- VEGF-A KO עכברים; אולם, תוצאה זו אינה משתקפת במלואה בתביעות glomerular L_pA / V_אני מדידות, איפה VEGF-A₁₆₅b לא משמעותית מנעו מגדילה GFB חדירות (איור 1 ואיור 2)⁵. זה מראה את החשיבות של שימוש מבחני מרובים כדי להעריך את החדירות הכליות וגם את החדירות של glomeruli בודדים. יתר על כן, glomerular L_pA / V_אני oncometric assay מרמז כי החדירות של הפרט glomeruli מן הכליה באותו יכול להשתנות במידה רבה, במיוחד מחלות מודלים^{5,10, 19}. מגבלה אחת כדי למדוד את glomerular L_pA / V_אני הוא כי זה ניתן לבצע אך ורק במובילים ניסיוני; לפיכך, מדידות uACR רגילה נדרשים לתת אינדיקציה מובילים ניסיוני.

בנוסף הערכת של פנוטיפ פונקציונלי, השיטה הנוכחי מעודד גם הערכה של פנוטיפ ultrastructural מבניים. ניתן לבצע זאת באמצעות מבחר של כתמים כגון PAS, trichrome, כתמי כסף; כל אחד כדי להעריך היבטים שונים של המורפולוגיה glomerular. במודלים חריפה של מחלת glomerular, שבדרך כלל המקרה במודלים של העכבר, הוא יכול להיות קשה לזהות חריגות מבנית הגדולות באמצעות הכתמים האלה אלא אם כן אתה פתולוג מיומן כליות. לכן, בביצוע EM הוא הציע כדי להעריך את ultrastructure של GFB, אשר מאפשר את המדידה כמותית של פרמטרים כגון GBM, אנדותל fenestrae גודל, מספר וכן המאפיינים podocyte. מדידות כאלה דורשים הכשרה מינימלית כדי לבצע ומאפשר החוקר לקבוע את-הסוגים/מבנה התא מושפע מודל המחלה. כך, בדוגמה המוצגת בתוצאות נציג, העכבר VEGF-A KO נמצאה להיות דוגמנית מתון של מחלת glomerular, אין מומים מבניים עיקריים היו נוכחים בעת צביעת PAS. עם זאת, ספציפית podocyte VEGF-A קו זירוז את שינויים GBM, podocytes, תאי אנדותל כשבוחנים את אולטרה-מבנה glomerular⁵. למרבה הצער, ההכנה של הכליה EM שמתואר בשיטת ההווה אינו מאפשר זיהוי של glycocalyx אנדותל, אשר ידוע גם להיות השפעות משמעותיות על החדירות של GFB¹⁹. כדי למדוד במדויק את העומק glycocalyx, הכליות צריך להיות perfuse-קבועה עם 2.5% גלוטראלדהיד עם 1% Alcian כחול glycocalyx אנדותל labelling, כפי שמתואר ואחOltean¹⁹.

פעם היה להעריך את פנוטיפ פונקציונלי ומבניים, וצריך להעריך את דפוסי ביטוי/הפעלה של גנים שונים מסלולים ואז בפרט glomeruli. הערכת אולטרה מבניים מוקדמת יכול לתת מידע על התא מעורב, המציין אם podocyte אנדותל ספציפיים או גנים/מסלולים צריך להיבדק glomerular/סוגי מבנים. לדוגמה, בתוצאות נציג של העכברים VEGF-A KO, ירידה במספר fenestrae אנדותל נצפתה (איור 3D); לכן, הביטוי glomerular חלבון של סמן אנדותל ידוע להיות מעורב מסלול VEGF-A נבחנה; VEGFR-2 (איור 4B)⁵. בנוסף הביטוי של חלבונים ב glomeruli, לוקליזציה שלהם גם להיות visualized באמצעות אם. במחקר על-ידי ג'אנג ואח²⁰, ביטוי ספציפי podocyte של GLUT1 אושרה podocytes על ידי אם שותף ההתאמה לשפות אחרות של GLUT1 מוגברת עם podocin.

לעומת שיטות אלטרנטיביות הציג בספרות כדי להעריך את הפונקציה glomerular, השימוש בשיטת המתוארות במאמר זה כדי להעריך את תפקוד הכליות במודלים של העכבר של מחלת glomerular מאפשר את פנוטיפ glomerular להערכה מלאה של היבטים מרובים. באמצעות שיטה זו, החוקר הוא מסוגל לקבוע את פנוטיפ הכליה של הדגם ולהעריך את המנגנון באשר למה מפתחת פנוטיפ. זה מידע חיוני על המנגנון של המחלה נדרש בעת בחינת אפיקים טיפולית פוטנציאל במודלים אלה. בשיטה זו ניתן בקלות ליישם בעתיד חקירות פונקציה glomerular הערכה של המחלה פנוטיפים ואת הרפוי פוטנציאליים.

לסיכום, פרוטוקול זה כלליים וישימה מתאר כליות מלא עבודה-up עבור העכבר מודלים של המחלה glomerular, הפעלת כמות עצומה של מידע לגבי הכליה ובפונקציה glomerular כדי לקבל עכבר אחת. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Metabolic Cages	Harvard Apparatus	52-6731
Tris buffered saline (10x)	Sigma-Aldrich	T5912-1L
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2058
Mouse Albumin ELISA Quantitation Set	Bethyl Laboratories	E90-134
TMB ELISA Substrate solution	ThermoFisher Scientific	34028
Sulphuric acid	Sigma-Aldrich	339741
SPECTRstar nano	BMG Labtech	SPECTRstar nano or equivalent
RNAlater stabilisation solution	ThermoFisher Scientific	AM7020
4-15% precast protein gel	BIORAD	4568084
4x Laaemmli Sample buffer	BIORAD	161-0747
Mini Trans-Blot cell	BIORAD	1703930
10x Tris running buffer	BIORAD	1610732
Coomassie Brilliant Blue Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Creatinine Companion	Exocell	1012 Strip Plate
Glutaraldehyde Solution	Sigma-Aldrich	G5882
Sodium Cacodylate	Sigma-Aldrich	C0250
10x Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	AM9625
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium Phosphate	Sigma-Aldrich	342483
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
EDTA Blood Collection tubes	BD	367835
23-25G Needle	BD	PMC0735
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
10 ml Glass Vial	Thomas Scientific	0914X10
Falcon 10 ml Polypropylene Tubes	ThermoFisher Scientific	10110101
0.5 ml Tubes	ThermoFisher Scientific	10681894
Disposable Tissue Molds	ThermoFisher Scientific	22-363-553
Mouse Surgical Disection Kit	ThermoFisher Scientific	13-005-204
Optimal Cutting Medium	ThermoFisher Scientific	23-730-571
4% Paraformaldehyde	ThermoFisher Scientific	AAJ19943K2
Glass Capillary Tubes	Harvard Apparatus	EC1 64-0770
Glomerular Permeability Rig	Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available	Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol
Stainless Steel Sieves	Cole-Parmer	WZ-59984
Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System	Sigma-Aldrich	395B-1KT
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Xylene	MerckMillipore	108298
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425-72EA
Mounting Medium	ThermoFisher Scientific	8030
Osmium tetroxide solution	Sigma-Aldrich	75632
Aradite Resin	Agar Scientific	CY212
Uranyl Acetate	Agar Scientific	AGR1260A
Lead Citrate	Agar Scientific	AGR1210
Cryostat	ThermoFisher Scientific	e.g. 957000H
Hydrophobic Pen	Abcam	ab2601
Nephrin (1243-1256) Antibody	Acris	BP5030
Anti-Podocin	Sigma-Aldrich	P0372-200UL
Anti-CD31	BD Biosciences	550274
Alexa Fluor Secondary Antibody	ThermoFisher Scientific	A32732
Vectashield Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
NP40 Cell Lysis Buffer	ThermoFisher Scientific	FNN0021
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	78437X4
10x Transfer Buffer	BIORAD	1610734
PVDF Membrane	ThermoFisher Scientific	LC2002
HRP-Conjugated Secondary Antibodies	Abcam	ab6721
ECF Substrate for Western Blotting	Fisher	10713387
TRIzol	ThermoFisher Scientific	15596018
Dnase I	New England Biolabs	M0303S
M-MLV Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M053S
Oligo dT	ThermoFisher Scientific	18418012
Random Primers	ThermoFisher Scientific	48190011
dNTP	ThermoFisher Scientific	18427088
Ribonuclease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	10777019
DEPC Water	ThermoFisher Scientific	AM9915G
Fluorescent Light Miscroscope	Leica Microsystems
Image J Analysis Software	Image J
PCR Thermocycler	ThermoFisher Scientific
TEM Microscope	Britannica