צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

Summary

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

Abstract

FM צבעים משמשים כדי ללמוד את מחזור שלפוחית סינפטית (SV). הגששים amphipathic אלה יש הידרופילית בראש וזנב הידרופובי, הפיכתם מסיסים במים עם היכולת להיכנס ולצאת ממברנה השומנים bilayers הפיכה. צבעי styryl אלה הם יחסית ללא-פלורסנט במדיום מימית, אבל הכניסה לתוך העלעל החיצוני של קרום פלזמה גורם > 40 X לודיג זריחה. ב הסינפסות עצביים, צבעי FM הם הפנימו במהלך SV אנדוציטוזה, אקסוציטוזה SV הנסחרות הן בתוך והן בין בריכות SV, ואשר פורסמו עם, מתן כלי רב עוצמה כדי להמחיש presynaptic שלבי עצבית. מודל גנטי העיקרי של glutamatergic סינפסה התפתחות ותפקוד היא דרוזופילה צומת עצב-שריר (NMJ), איפה FM לצבוע הדמיה שימש בהרחבה לכמת SV dynamics במגוון רחב של תנאים מוטציה. הטרמינל סינפטית NMJ הינו נגיש בקלות, עם מגוון יפה של גדול סינפטית עם העיתון ons אידיאלי עבור הדמיה יישומים. כאן, אנו משווים חדות משלוש דרכים לעורר את דרוזופילה NMJ לנהוג תלויי-פעילות FM1-43 צבע ספיגת/שחרור...: אמבט 1) יישום של גבוהה [K⁺] depolarize רקמות עצב-שריר, 2) יניקה עצבים מוטוריים אלקטרודה גירוי depolarize העצב presynaptic מסוף, ו 3) לפלח הטרנסגניים ביטוי של משתנים channelrhodopsin עבור שליטה גירוי האור, המרחבי של דפולריזציה. כל השיטות האלה יש יתרונות וחסרונות לחקר השפעות מוטציה גנטית על מחזור SV- דרוזופילה NMJ. נדון אלה יתרונות וחסרונות לסייע הבחירה של הגישה גירוי, יחד עם מתודולוגיות ספציפיות לכל אסטרטגיה. בנוסף הדמיה פלורסנט, FM צבע יכול להיות photoconverted לאותות צפיפות אלקטרונים visualized באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הילוכים (TEM) ללמוד SV מנגנונים מחזור ברמה ultrastructural. אנו מספקים את ההשוואות של קונאפוקלית ואלקטרון הדמיה של השיטות השונות של גירוי דרוזופילה NMJ, כמדריך הבחירה של פרדיגמות ניסיוני בעתיד.

Introduction

מאופיין להפליא דרוזופילה צומת עצב-שריר זחל (NMJ) glutamatergic סינפסה הדגם שימש ללמוד סינפסה היווצרות ותפקוד עם מגוון עצום של לפליטת גנטי¹. הטרמינל מוטור נוירון מורכב רב ענפים האקסון, כל אחד עם העיתון ons מוגדלת סינפטיים רבים. אלה varicosities מרווח (עד 5 מיקרומטר בקוטר) לכלול את כל המנגנון עצבית, כולל הסינפטיות glutamatergic אחיד (SVs; ~ 40 ננומטר בקוטר) שמורת cytosolic ובריכות בקלות releasable². שלפוחית אלה עוגנות קרום פלזמה presynaptic פיוז'ן אתר פעיל אזורי (AZs), שבו אקסוציטוזה שמתווכת שחרור נוירוטרנסמיטר גלוטמט עבור טרנס-סינפטית תקשורת. לאחר מכן, SVs מאוחזרות של קרום פלזמה דרך נשיקה-וברח מיחזור או בתיווך clathrin אנדוציטוזה (CME) מחזורים חוזרים ונשנים exo/אנדוציטוזה. דרוזופילה NMJ ונגיש בקלות מתאים היטב הן בידוד ואפיון מוטנטים מחזור SV. באמצעות מסכי גנטי קדימה, מוטציות הרומן הובילו זיהוי גנים חדשים קריטיים עבור מחזור SV³. יתר על כן, הפוך גישות גנטיות מתחיל עם הגנים ידוע כבר הובילו הבהרה של מנגנוני מחזור SV חדשים דרך התיאור זהיר של מוטציה רכיבה על אופניים פנוטיפים⁴. דרוזופילה NMJ אידיאלי כמעט כהכנה סינפטית ניסיוני ניקוד אנדוציטוזה SV מנגנונים אקסוציטוזה באמצעות שיטות שטיחות שלפוחית מסלול רכיבה על אופניים במהלך עצבית.

מגוון של סמנים פלורסנט לאפשר מעקב ויזואלי של שלפוחית במהלך רכיבה על אופניים dynamics, אבל הרב-גוניים ביותר הם תחליפי לצבוע FM אשר הוא קודם מסונתז על ידי מאו,. פ, ואח. ⁵. מבחינה מבנית, FM צבעים מכילים הידרופילית ראש וזנב lipophilic מחובר באמצעות טבעת ארומטית, עם אזור מרכזי היוועצות ספקטראליות. אלה styryl צבעי למחיצות הפיכה של ממברנות, לא 'משתנים' בין קרום פליירים, וכך גם אף פעם לא להכניס ציטוזול, ויש הרבה יותר פלורסנט בתוך ממברנות יותר מים⁵. הכניסה הפיך לתוך ליפידית גורמת עלייה 40-fold קרינה פלואורסצנטית⁶. ב הסינפסות עצביים, ניסויים תיוג לצבוע FM קלאסי מורכב רחצה ההכנה סינפטית עם לצבוע במהלך depolarizing גירוי לטעון לצבוע באמצעות SV אנדוציטוזה. צבע חיצוני ואז נשטף הרחק, מחזור SV נעצר בפתרון צלצול נטולת סידן לשיקוף הסינפסות טעון⁷. סיבוב שני של גירוי באמבט ללא צבע מעורר שחרור FM דרך אקסוציטוזה, תהליך זה יכול להיות מלווה מדידה הירידה עוצמת קרינה פלואורסצנטית. אוכלוסיות SV מן שלפוחית יחיד אל בריכות המכיל מאות שלפוחית יכול להיות מנוטרים באופן כמותי^6,7. צבעי FM שימשו לנתח תלויי-פעילות גיוס של בריכות SV נפרדים פונקציונלית, והשווה נשיקה-וברח לעומת CME רכיבה^8,9. השיטה שונתה כדי בנפרד assay עורר, ספונטנית, זעיר סינפטית מחזור פעילות (עם ציוד רגישה מאוד לזהות שינויים קטנים מאוד פלורסצנטיות ולהפחית את photobleaching)¹⁰. מבחני ניתן להרחיב את רמת ultrastructural על ידי photoconverting האות FM פלורסנט לתוך תווית צפיפות אלקטרונים עבור שידור מיקרוסקופ אלקטרונים^11,12,13,14 .

מבחינה היסטורית, רחצה ההכנות סינפטית בריכוז גבוה של אשלגן (ןלהל "גבוהה [K⁺]") הייתה השיטה של בחירה עבור depolarizing גירוי לזירוז SV רכיבה על אופניים; החל הצפרדע שימוש NMJ⁵, מחונן המוח מכרסמים נוירונים בהיפוקמפוס¹⁵, דרוזופילה glutamatergic NMJ דגם^16,17 הגישה [K⁺] גבוהה זו היא פשוטה, דורש אין ציוד מיוחד, ולא נגיש ולכן רוב מעבדות, אבל יש מגבלות עבור היישום והן פרשנות הנתונים. שיטה המתאימה יותר מבחינה פיזיולוגית היא להשתמש אלקטרודה היניקה גירוי חשמלי של עצב^4,5,12. גישה זו נוהג פוטנציאל הפעולה הפצת לגירוי ישיר של העצב presynaptic מסוף, ואת התוצאות ניתן להשוות ישירות אל מבחני אלקטרופיזיולוגיות עצבית פונקציה^{13,14, 15}, אבל דורש ציוד מיוחד, היא טכנית הרבה יותר מאתגר. עם כניסתו של optogenetics, השימוש של גירויים עצביים channelrhodopsin יש יתרונות נוספים, כולל שליטה הדוקה ייתכן ערוץ ביטוי באמצעות מערכת Gal4/UAS בינארי²⁰. גישה זו טכנית הרבה יותר קל מאשר שאיבה אלקטרודה לגירוי ואינו דורש לא יותר מאשר מקור אור LED זול מאוד. כאן, אנו מעסיקים הדמיה של FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) לעשות הן השוואות אלה שלוש שיטות שונות גירוי- דרוזופילה NMJ: high פשוטים [K⁺ ], מאתגר גישות channelrhodopsin חשמל וחדשים.

Protocol

1. זחל דבק לנתיחה

1. ביסודיות מערבבים 10 חלקים elastomer סיליקון הבסיס עם חלק 1 של סיליקון elastomer אשפרה הסוכן הערכה אלסטומר (טבלה של חומרים).
2. מעיל coverslips זכוכית דקה 22 x 22 מ מ עם elastomer, התרופה על פלטה חמה ב- 75 הלעפה תרוטרפמט למשך מספר שעות (עד כבר לא דביק למגע).
3. הצב coverslip זכוכית מצופים elastomer יחיד של החדרה plexi מחוייט זכוכית לנתיחה (איור 1, התחתון) לקראת הקרע זחל.
4. הכינו את פיפטות דבק של נימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות פולר microelectrode סטנדרטיים כדי להשיג את להתחדד הרצוי ואת עצה גודל.
5. בעדינות לשבור את הטיפ micropipette, וכניסה אל הקצה האחר, לצרף 2 מטרים של צינור פלסטיק גמיש (1/32" קוטר פנים, מזהה; 3/32" מחוץ קוטר, OD; 1/32" קיר; טבלה של חומרים) עם הפה הולם (P2 פיפטה tip).
6. למלא מיכל קטן (0.6 מ"ל גלאים הצינורית) עם נפח קטן (µL ~ 20) של דבק (טבלה של חומרים) לקראת הקרע זחל.
7. למלא את החדר עם תמיסת מלח (במ מ): 128 NaCl, 2 אשלגן כלורי, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, סוכרוז 70 ו חומצה 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic (HEPES) pH 7.2.
8. הוספת נוגדן peroxidase (HRP) נגד חזרת מצומדת כדי אלקסה עבור חיל הים 647 (anti-HRP:647; 1:10 שתדללו מניה 1 מ"ג/מ"ל) עבור תיוג NMJ את טרמינל presynaptic במהלך ניתוח^21,22.
9. שימוש במכחול בסדר (גודל 2), להסיר לחלל השלישי נודד של המבחנה מזון ומניחים על גבי הזכוכית מצופה elastomer כיסוי.
10. למלא את הטיפ micropipette זכוכית עם נפח קטן של דבק באמצעות לחץ אוויר שלילי שנוצר על ידי הפה עם קובץ מצורף (שלב 1.5).
11. מיקום זחל בצידו הגבי למעלה עם מלקחיים דבק לראש coverslip מצופים elastomer עם קטן טיפת דבק באמצעות לחץ אוויר חיובי על ידי הפה.
12. חזור על הליך זה בקצה האחורי של הזחל, מוודא כי החיה נמתחת מתוח בין הקבצים המצורפים דבק שני.
13. בעזרת מספריים (להבים 3 מ מ; טבלה של חומרים), עושים חתך אופקי (~ 1 מ מ) את ישבנה ואת חתך אנכי לאורך הקו האמצעי הגבי.
14. בעזרת מלקחיים בסדר (מס ' 5, טבלה של חומרים), בעדינות להסיר את קנה הנשימה הגבי, הבטן, הגוף השמן ובאיברים פנימיים אחרים המכסים את מערכת השרירים.
15. חזור על הפעולות הדבקה לכנפיים לגוף החומה 4, מוודא למתוח בעדינות את הקיר הגוף אופקית ואנכית.
16. להרים את חוט עצבי הגחון (VNC) באמצעות מלקחיים, לחתוך בזהירות את העצבים המוטוריים עם המספריים ולאחר מכן להסיר לחלוטין את VNC.
17. החלף את תמיסת המלח לנתיחה Ca^{2 +}-חינם תמיסת מלח (כמו מלוחים לנתיחה לעיל מבלי CaCl₂) להפסיק SV רכיבה על אופניים.

2. אפשרות 1: גבוהה [K⁺] צבע FM טעינה

1. מפתרון FM1-43 מניות (4 מ מ), להוסיף 1 µL 1 מ"ל של 90 מ מ פתרון אשלגן כלורי (גבוהה [K⁺] בתוך הקרע תמיסת מלח) ריכוז סופי של 4 מיקרומטר.
2. באמצעות פיפטה של, להחליף את Ca^{2 +}-תמיסת מלח חינם בבית הבליעה הדמיה עם הפתרון צבע [K⁺] FM גבוהה לעורר SV אנדוציטוזה לצבוע ספיגת.
3. מיד להתחיל טיימר דיגיטלי משך זמן שנקבע מראש הגבוה [K⁺] depolarizing גירוי תקופה (למשל., 5 דקות; איור 2).
4. כדי לוודא הכנה זחל בריא, שימו לב את התכווצויות חזקות של מערכת השרירים למשך כל תקופת דפולריזציה גבוהה [K⁺].
5. כאשר מסתיימת תקופת שעון עצר, להסיר הפתרון צבע [K⁺] FM גבוהה ובמהירות להחליף^{2 +}Ca-תמיסת מלח חינם להפסיק SV רכיבה על אופניים.
6. תשטוף ברצף מהיר עם Ca^{2 +}-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הפתרון צבע גבוהה [K⁺] FM מוסר לחלוטין.
7. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים^{2 +}-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.

3. הדמיה: מיקרוסקופיה קונפוקלית

1. השתמש מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם 40 X המטרה טבילה במים כדי התמונה NMJ לצבוע קרינה פלואורסצנטית (מיקרוסקופים אחרים ניתן להשתמש).
2. התמונה שריר NMJ 4 מקטעי בטן 2-4 (NMJs אחרים יכולים לדימות) לאסוף תמונות בעזרת תוכנה מתאימה (טבלה של חומרים).
3. השתמש הנה 633 ננומטר לייזר כדי לעורר HRP:647 (עם מסנן לעבור זמן > 635 nm), של ארגון 488 ננומטר לייזר כדי לרגש FM1-43 (עם bandpass מסנן 530-600 ננומטר).
4. מבצעית לקבוע רווח אופטימלי וההיסט עבור שני ערוצים.
   הערה: הגדרות אלה יישארו קבועים במהלך המשך הניסוי.
5. לקחת את Z-ערימה קונאפוקלית דרך כל NMJ שנבחרו מן הפסגה המסומן HRP לחלק התחתון של הטרמינל סינפטית.
6. שימו לב זהירה NMJ עם תמונה (קטע, לצד ושרירים) כדי להבטיח עודף NMJ באותו המדויק לאחר FM לצבוע פריקה.

4. גבוהה [K⁺] גירוי: FM דיי פריקה

1. להחליף Ca^{2 +}-תמיסת מלח חינם עם תמיסת המלח [K⁺] גבוהה (ללא צבען FM1-43) כדי נסיעה דפולריזציה, שחרור אקסוציטוזה וצבע SV.
2. מיד להתחיל טיימר דיגיטלי עבור משך תקופת גירוי גבוה [K⁺] שנקבע מראש (למשל., 2 דקות; איור 2).
3. כאשר מסתיימת תקופת שעון עצר, מיד להסיר את תמיסת המלח [K⁺] גבוהה ולהחליף עם Ca^{2 +}-תמיסת מלח חינם להפסיק SV רכיבה על אופניים.
4. תשטוף ברצף מהיר עם Ca^{2 +}-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח תמיסת המלח גבוהה [K⁺] מוסר לחלוטין.
5. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים^{2 +}-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
6. להיות בטוח תמונה של זריחה לצבוע FM1-43 ב NMJ זהה שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקלי

5. אפשרות 2: גירוי חשמלי FM לצבוע טעינה

1. הכן על פיפטה יניקה באמצעות את פולר microelectrode (טבלה של חומרים) כדי להשיג את להתחדד נדרש ואת עצה גודל.
2. אש-פולין הטיפ microelectrode עם מיקרו-פורג עד עצבים מוטוריים יחיד יכול להישאב עם צפוף.
3. תחליק פיפטה יניקה על המחזיק אלקטרודה micromanipulator, לצרף את צינור פלסטיק גמיש ארוך ומזרק.
4. הגדרת פרמטרים ממריץ (למשל., 15 V, תדירות 20 Hz, משך 20 ms, זמן של 5 דקות (איור 2) או 1 דקות (איור 3)).
5. להחליף את Ca^{2 +}-תמיסת מלח חינם על הכנת זחל עם מעל תמיסת FM1-43 (4 מיקרומטר; CaCl 1 מ₂) על האסדה אלקטרופיזיולוגיה.
6. לשים ההכנה על הבמה מיקרוסקופ ולגדל את הבמה עד זחל של פיפטה היניקה בפוקוס (40 X טבילה במי המטרה).
7. להתחנף לולאה של חתוך עצבים מוטוריים innervating את hemisegment שנבחר עם לחץ אוויר שליליים שנוצרו על-ידי המזרק אל האלקטרודה היניקה.
8. מבחן הפונקציה אלקטרודה יניקה עם פרץ קצר של גירוי תוך פיקוח באופן חזותי להתכווצות השריר ב hemisegment שנבחר.
9. לעורר את עצבים מוטוריים באמצעות הפרמטרים שנבחרו (שלב 5.4) לנהוג SV אנדוציטוזה ואת ספיגת לצבוע FM1-43 (איור 2).
10. תשטוף ברצף מהיר עם Ca^{2 +}-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הפתרון לצבוע FM1-43 מוסר לחלוטין.
11. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים^{2 +}-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית באמצעות פרוטוקול הדמיה קונאפוקלית מלמעלה.
12. שימו לב זהירה NMJ עם תמונה (קטע, צד, שרירים) כדי להבטיח גישה NMJ באותו המדויק לאחר פריקת לצבוע FM.

6. גירוי חשמלי: FM דיי פריקה

1. להחליף את Ca^{2 +}-חינם תמיסת מלח עם תמיסת מלח רגיל (ללא צבען FM1-43) ומניחים ההכנה חזרה לבמה לבוש אלקטרופיזיולוגיה.
2. קבע את הפרמטרים ממריץ לפריקת (למשל, 15 V, 20 Hz התדר, 20 ms משך זמן של 2 דקות (איור 2) או 20 s (איור 3)).
3. למצוץ את עצבים מוטוריים אותו לתוך האלקטרודה אותה כמתואר לעיל ולאחר מכן לעורר להפעלת SV אקסוציטוזה ושחרור לצבוע FM1-43.
4. תשטוף ברצף מהיר עם Ca^{2 +}-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הצבע החיצוני יוסר לחלוטין.
5. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים^{2 +}-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
6. להבטיח תמונה של זריחה לצבוע FM1-43 ב NMJ זהה שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקלי.

7. אפשרות 3: Channelrhodopsin גירוי FM לצבוע טעינה

1. העלאת לבטא ChR2 הזחלים על מזון המכיל את ChR2 גורם משותף כל טרנס רשתית (אתנול מומס ב; 100 מיקרומטר הריכוז הסופי).
2. מקום הכנת זחל תא פלקסיגלס על הבמה מיקרוסקופ לנתיחה מצויד עם יציאת המצלמה.
3. לצרף LED כחול (470 ננומטר; טבלה של חומרים) ממריץ לתכנות באמצעות כבל קואקסיאלי, למקם את ה-LED יציאת המצלמה.
4. ממקדים את הקרן אור LED כחול על גבי הפונקציה זחל ביתור שימוש בפונקציה זום מיקרוסקופים.
5. להחליף את Ca^{2 +}-תמיסת מלח חינם על הכנת זחל עם מעל תמיסת מלח FM1-43 (4 מיקרומטר; CaCl 1 מ₂) על הבמה optogenetic.
6. להגדיר את הפרמטרים LED באמצעות ממריץ את (למשל, 15 V, תדירות, משך 20 ms וזמן של 5 דקות (איור 2) 20 הרץ).
7. להתחיל את גירוי האור ולעקוב עם שעון עצר עבור משך הזמן שנקבע מראש של תקופת גירוי optogenetic (למשל, 5 דקות; איור 2).
8. כאשר הטיימר מפסיק, במהירות להסיר הפתרון לצבוע FM ולהחליף עם Ca^{2 +}-תמיסת מלח חינם כדי לעצור את ה-SV רכיבה על אופניים.
9. תשטוף ברצף מהיר עם Ca^{2 +}-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הפתרון לצבוע FM מוסר לחלוטין.
10. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים^{2 +}-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות פרוטוקול הדמיה מלמעלה.
11. שימו לב זהירה NMJ עם תמונה (קטע, צד, שרירים) כדי להבטיח גישה NMJ באותו המדויק לאחר פריקת לצבוע FM.

8. Channelrhodopsin גירוי: FM דיי פריקה

1. להחליף Ca^{2 +}-תמיסת מלח חינם עם תמיסת מלח רגיל (ללא צבען FM1-43) על הבמה מיקרוסקופ הקרע עם יציאת המצלמה LED התמקדו הזחל.
2. להגדיר את הפרמטרים ממריץ עבור פריקה (למשל, 15 V, תדירות, משך 20 ms וזמן של 2 דקות (איור 2) 20 הרץ).
3. להתחיל את גירוי האור ולעקוב עם שעון עצר עבור משך תקופת גירוי optogenetic שנקבע מראש (למשל, 2 דקות; איור 2).
4. כאשר מסתיימת תקופת שעון עצר, במהירות להסיר הפתרון לצבוע FM ולהחליף עם Ca^{2 +}-תמיסת מלח חינם כדי לעצור את ה-SV רכיבה על אופניים.
5. תשטוף ברצף מהיר עם Ca^{2 +}-חינם תמיסת מלח (5 x עבור 1 דקות) כדי להבטיח הצבע החיצוני יוסר לחלוטין.
6. לשמור על הכנת זחל ב Ca טריים^{2 +}-תמיסת מלח חינם עבור הדמיה מיידית עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
7. להבטיח תמונה של זריחה לצבוע FM1-43 ב NMJ זהה שצוין לעיל באמצעות אותן הגדרות קונפוקלי.

9. זריחה כמת

1. טען את התמונה ב- J תמונה (NIH קוד פתוח), ליצור הקרנה העוצמה המקסימלית על-ידי לחיצה על תמונה | ערימות | פרויקט Z.
2. באמצעות מלחמה-ערוץ HRP:647, עבור אל התמונה | התאם | סף והחלק סרגל הכלים העליון עד רק NMJ מודגשת.
3. באמצעות הכלי מטה, לחץ על NMJ. אם NMJ מקוטע, לחיצה ארוכה על לחצן מקש shift לחוץ ובחר כל החלקים.
4. לשנות את התמונה לערוץ צבע FM1-43 וללכת על נתח | למדוד כדי לקבל מדידת קרינה פלואורסצנטית.
5. חזור על צעדים 9.1-9.4 עבור התמונה "לפרוק" NMJ אותו (קטע מזוהה, לצד ושרירים).
6. כדי לקבל את אחוז צבע זה היה לפרוק, לקחת את היחס בין עוצמות קרינה פלואורסצנטית שהמכולה/לטעון.
   הערה: הליך זה יכול להיות שונה כדי לנתח זריחה על בסיס בוטון-לכל-בוטון באמצעות כלי הבחירה "אליפסה" או "חופשי" או. ניתן להפחית קרינה פלואורסצנטית רקע באמצעות דגימת קרינה פלואורסצנטית את השריר. ניתן להוסיף סוכני גם כדי להפחית את הרקע הזה.

תוצאות

איור 1 מציג את זרימת העבודה עבור פעילות תלוית FM לצבוע הדמיה פרוטוקול. הניסוי מתחיל תמיד עם הקרע דבק זחל זהה, ללא קשר גירוי לשיטת לאחר מכן. איור 1a הוא תיאור סכמטי של זחל גזור, מציג את חוט עצבי הגחון (VNC), מקרין העצבים ותבנית שריר hemisegmental חוזרות ו...

Discussion

גירוי גבוה [K⁺] מלוחים depolarizing הוא והכי מתוך שלושת האפשרויות עבור צבע FM תלויי-פעילות רכיבה על אופניים, אבל סביר להניח פיזיולוגיים לפחות²⁹. שיטה פשוטה זו depolarizes כל תא נגיש החיה כולו, אז אינו מאפשר לימודים מכוונת. ייתכן ניתן להחיל באופן מקומי גבוה תמיסת מלח [K⁺] עם micropipette, א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388	To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200	Thermolyne	HPA2235M	To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber	N/A	N/A	Handmade
Borosilicate Glass Capillaries	WPI	1B100F-4	To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-2000	To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	For mouth and suction pipette
P2 pipette tip	USA Scientific	1111-3700	For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap	Fisher Scientific	05-408-120	Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M	WPI	vetbond	Glue used for dissections
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P-217	Forsaline
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S5886	For saline
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	M35-500	For saline
Calcium Chloride Dihydrate	Millipore Sigma	C7902	For saline
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	For saline
HEPES	Millipore Sigma	H3375	For saline
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	To label neuronal membranes
Paintbrush	Winsor & Newton	94376864793	To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5	WPI	500233	Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)	WPI	14177	Used during dissection
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluorescent styryl dye
Digital Timer	VWR	62344-641	For timing FM dye load/unload
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope	Zeiss		For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0	Zeiss		Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser	Lasos		To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser	Lasos		To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge	WPI	MF200	To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip	BD	301625	To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)	Narishige	MMN-9	To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator	Grass	S48	To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope	Zeiss		Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective	Zeiss		Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal	Millipore Sigma	R2500	Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port	Zeiss	2000-C	Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Used for ChR activation
T-Cube LED Driver	ThorLabs	LEDD1B	To control the LED
LED Power Supply	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	To power the LED
Optical Power and Energy Meter	ThorLabs	PM100D	To measure LED intensity