בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

Summary

הבידול של adipocytes לבן ובייז של רקמת שומן אבות כלי הדם נושא פוטנציאל שיפור חילוף החומרים ההשמנה. נתאר פרוטוקולים של CD34 + CD31 + בידוד תאי אנדותל של שומן אנושי ואת הבאים במבחנה הרחבה, בידול לתוך לבן ובייז adipocytes. הם דנו מספר יישומים במורד הזרם.

Abstract

השמנת יתר מלווה של שיפוץ נרחב של רקמת שומן בעיקר דרך adipocyte היפרטרופיה. צמיחה adipocyte קיצוניים גורמת תגובה המסכן אינסולין, היפוקסיה המקומי של דלקת. על ידי המרצת את הבידול של adipocytes לבן פונקציונלי של אבות, היפרטרופיה הרדיקלית של האוכלוסייה adipocyte ניתנת למניעה, כתוצאה מכך, ניתן לשפר את הבריאות המטבולית של רקמת שומן יחד עם הפחתה של דלקת. כמו כן, על ידי גירוי של הבידול של חום בז/adipocytes, הוצאות האנרגיה של הגוף הכולל ניתן להגדיל, וכתוצאה מכך ירידה במשקל. גישה זו יכולה למנוע ההתפתחות של השמנת יתר morbidities שיתוף כגון סוכרת מסוג 2 ומחלות לב וכלי דם.

מאמר זה מתאר את הבידוד הרחבה, הבידול של adipocytes לבן ובייז של תת-קבוצה של רקמת שומן אנושי תאי אנדותל המבטאים במשותף את סמני CD34 ו- CD31. השיטה הוא זול יחסית ואינו מהגידולים. זה דורש גישה אנושית רקמת שומן ומתאים בתחנה תת עורית הדגימה. עבור פרוטוקול זה, רקמת שומן טריים דגימות מן הנבדקים חולנית [אינדקס מסת הגוף (BMI) > 35] נאספים במהלך הליכי ניתוח בריאטרי. שימוש של immunoseparation רציפים של השבר בכלי הדם סטרומה, מספיק תאים מיוצרים מ קטנה כמו 2-3 גרם של שומן. תאים אלה ניתן להרחיב בתרבות במשך 10-14 ימים, יכול להיות cryopreserved, שומרים על תכונותיהם adipogenic עם passaging עד מעבר 5-6. התאים מטופלים במשך 14 ימים עם קוקטייל באמצעות שילוב של אינסולין אנושי ואגוניסט-רוזיגליטזון את PPARγ adipogenic.

מתודולוגיה זו יכול לשמש להשגת הוכחת הרעיון ניסויים על המנגנונים המולקולריים לנהוג adipogenic תגובות בתאי האנדותל אדיפוז, או לסינון תרופות חדשות זה יכולה לשפר את adipogenic של תגובה מכוונת גם כלפי לבן או adipocyte חום בז/בידול. באמצעות ביופסיות תת-עורי קטן, מתודולוגיה זו ניתן לסנן נושאים שאינם-למגיב לניסויים קליניים שמטרתם לעורר adipocytes בז/חום ולבן לטיפול של השמנת יתר, שיתוף morbidities.

Introduction

לאחרונה מעידים כי הן בעכברים ובבני אדם, קבוצת משנה של תאים המתגוררים להערכת רקמת שומן יכול להיות מובחן גם^2,1,adipocytes לבן או חום^בז/3. פנוטיפ תאים כאלה היא נושא למחלוקת, עם ראיות התומכות תאי אנדותל, שריר חלק/pericyte או קשת של פנוטיפים ביניים^4,5,6,7. היקף פיתוח מתודולוגיה זו היה לבחון את הפוטנציאל adipogenic של CD34 + CD31 + תאי אנדותל מבודד מן המחסנים שומן שונה מבני מהשמנת יתר. מחקרים אחרים בספרות מתמקדים adipogenic הפוטנציאליים של השבר בכלי הדם סטרומה הכולל או של^8,92,אבות adipocyte הידוע. מאז הטכנולוגיה הקיימת כיום ניתן לייעד באופן ספציפי רקמת שומן בתאי אנדותל עבור משלוח סמים¹⁰, להבין את הפוטנציאל של תאים כאלה לעבור adipogenic אינדוקציה לכיוון adipocytes לבן או בז הוא חשוב טיפולים ממוקדים בעתיד.

קבוצות שונות דיווחו על השילוב של סמני CD34 ו- CD31 כתחליף בידוד תאי אנדותל של רקמת שומן אנושי^11,12,13. בדרך כלל, הבידוד מתבצעת באמצעות שני שלבים רציפים ומבחר חיובי באמצעות beads מגנטי. בדו ח זה, immunoseparation באמצעות CD34 + beads מגנטי בשילוב חרוזי פלסטיק CD31 היה מנוצל. מצאנו שיטה זו נעלה immunoseparation מגנטי רציפים ביחס לשימור מורפולוגיה אנדותל המרוצף טיפוסי. כמו כן, הצלחנו לייצר מספיק תאים הדרושים עבור אינדוקציה הרחבה, adipogenic החל מ קטנה כמו 1-2 גרם של שומן. ביופסיה מדגם קטן של שומן תת עורי מספיקה כדי לייצר את הכמות הנדרשת של תאים עבור יישומים במורד הזרם. היבט זה חשוב שעשוי להיות, במיוחד אם תשתמש בשיטה זו להקרנה על היענות אינדוקציה adipogenic של ניסויים.

בניגוד למערכות אחרות דיווחו בספרות, שיטה זו משתמשת רק שני מרכיבים אינדוקציה adipogenic CD34 + CD31 + תאים: אגוניסט PPARγ — רוזיגליטזון —, אינסולין אנושי. חשוב מכך, כמות האינסולין משמש נופל בטווח נורמלי/גבוהה של מחזורי אינסולין post-absorptive בני¹⁴. מידת ההיענות לאינסולין של ה תאי במבחנה, נמדד על ידי זרחון Akt, לא לתאם את יכולתם להגיב אינדוקציה קוקטייל. מעניין, באמצעות תנאים קוקטיילים ו ניסיוני זה אינדוקציה, שילוב של לבן, חום בז/תאים התקבלו כפי שנקבע בהתאם לגודלו, מספרים של השומנים תאיים טיפות, הביטוי של סמנים מולקולריים. פרוטוקול זה אינדוקציה פשוטה וחסכונית יחד עם הערכה כמותית של פנוטיפ של התאים למשיב (לבן לעומת בז) מאפשר הקרנה של סוכנים פוטנציאלי יכול לשנות את האיזון של בז הבדיל : לבן adipocytes.

שיטה זו מספקת גם בגישה translational להבנת המנגנון הבסיסי של adipogenesis של אבות אנדותל כלי הדם ברקמת שומן אנושי. באמצעות טכניקה ספציפית בידוד/בידול זו, החוקרים שניתן לחקור מסלולים שונים אחראים adipogenesis בקבוצת משנה של תאי אנדותל כלי הדם מן המחסנים שומן שונות אצל בני אדם רזה והשמנה.

Protocol

הוועדה המוסדית של לוח סקירה בבית הספר לרפואה במזרח וירג'יניה אישרה אוסף של דוגמאות רקמת שומן אנושי השתמשו במחקר ומחקר. הסכמה בכתב מושכלת נאסף מן המטופלים.

1. הכנת מאגרי מדיה, כלי נגינה

1. להכין פתרון Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 מ"מ נתרן כלורי, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ מ מגנזיום גופרתי, 0.4 מ מ אשלגן פוספט dibasic, גלוקוז בעובי 5.5 מ מ, 1 מ מ אדנוזין, לערבב אנטיביוטיקה/antimycotic 0.01% (50 µg/mL הפניצילין, 50 µg/mL סטרפטומיצין, 30 µg/mL של גנטמיצין, ng/mL 15 של שהוא גוסס) ו- 10 מ מ HEPES (ה-pH = 7.4). פתרון זה מוכן טרי כל זמן עיכול ואוסף רקמות.
2. להכין פתרון collagenase טריים: 1 מ"ג/מ"ל של collagenase, הקלד 1, KRBSS; לעשות 3 מ"ל/גרם של שומן. לחמם את הפתרון collagenase ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים לפני העיכול רקמות.
3. הכנת מאגר בידוד תאי CD34: 2% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1 מ מ EDTA סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
4. הכן Adipogenesis מדיה: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µg/mL של פניצילין/סטרפטומיצין, µL/mL 1.25 של אינסולין אנושי (µg 5/mL או מו 144/mL) ו- µL/mL 0.36 של 2.8 מ"מ רוזיגליטזון (1 מיקרומטר).
5. להכין 0.3% שמן אדום O (אורו) מניות פתרון (משקל/נפח) על ידי המסת 0.3 g של אורו לתוך 100 מ של אלכוהול איזופרופיל.

2. אדיפוז השבר בכלי הדם סטרומה בידוד

הערה: המחקר כללו עמית חתך הרוחב של שמנים בצורה חולנית סוג 2 סוכרת (T2D), שאינו חולה סוכרת הנושאים, בגילאי 18-65 שנים, שעברו ניתוח בריאטרי Sentara מטבולית, מרכז אובדן משקל של הניתוח (קבוצה הרפואי Sentara, נורפולק, וירג'יניה). לקבלת פטור כלל מחלה אוטואימונית כולל סוכרת סוג 1, מצבים הדורשים טיפול לדיכוי המערכת החיסונית כרונית, תרופות אנטי דלקתיות, thiazolinendiones, השימוש בטבק פעיל, זיהומים חריפה או כרונית או היסטוריה של ממאירות שטופלו תוך 12 החודשים האחרונים. T2D היה מוגדר של גלוקוז בצום של 126 מ"ג/ד"ל או גדול, של גלוקוז של 200 מ"ג/ד"ל או יותר לאחר בדיקת עמידות גלוקוז 2 h או את השימוש בתרופות antidiabetic.

1. לאסוף אדם עם פגיעה (OM) ואת רקמת השומן התת עורית (SC) (ב) ניסויים שעברו ניתוח בריאטרי.
2. שמור את אום ו- SC AT נפרד מבחנות שמכילות של האנק Buffered תמיסת מלח עם 50 µg/mL של פניצילין/סטרפטומיצין בטמפרטורת החדר מיד לאחר החילוץ רקמות.
3. בזהירות לנקות ולהסיר והחלק שהותירה נצרבו של הרקמה באמצעות מספריים ניגבה אתנול 70% ופינצטה כאשר המדגם מגיע במעבדה אחרי החילוץ רקמות.
4. שוקל את רקמת שומן, למחיצות זה לתוך 5 g (או פחות) aliquots לעיכול collagenase.
5. דק מינצ 5 גר' AT ב 5 מ של פתרון collagenase ב בקבוקון נצנוץ בטמפרטורת החדר, באמצעות שני זוגות מספריים.
6. להוסיף נוספים של 10 מ"ל של פתרון collagenase הרקמה טחון על סך 15 מ"ל.
7. לעכל את הדגימות עבור h 1, 37 ° C, באמבט מים ברעידות רציפה.
8. חותכים את הקצה מזרק 20 mL כדי להפוך קצה קהה.
9. גזור ריבוע 9 ס מ x 9 ס מ מ רשת מיקרומטר 250 ודחף אותו באמצע הדרך לתוך צינור חרוטי 50 מ ל באמצעות המזרק הקהה.
10. יוצקים את הדגימות לתוך מזרק הקהה 20 מ"ל ו מסנן דרך רשת ניילון מיקרומטר 250 לתוך הצינור חרוט 50 מ ל כדי להפריד בין adipocytes וסטרומה תאים לכלי הדם מרקמות מעוכל.
    הערה: אין להשתמש יותר מ 5 g של AT למחזור חרוט 50 מ ל, רשת השינוי לקבל צפופים עקב עודף חומר מעוכל שהותירה.
11. לשטוף את המבחנה נצנוץ עם 10 מ"ל של KRBBS, שפוך את זה דרך המסנן כדי לאסוף תאים שיורית.
12. דגירה הדגימות המסוננת עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: השלב זה חשוב לאפשר adipocytes כדי לצוף בחלק העליון של הצינור חלק מהתאים וסקולרית סטרומה להתיישב על החלק התחתון של הצינור.
13. לנצל מזרק 20 מ ל ו- 20 G x 6 במחט pipetting להסיר את שכבת סטרומה השבר בכלי הדם. ולהעביר אותו ל צינור חרוטי נקי 50 מ.
14. להוסיף 10 מ של KRBBS ולאפשר את הדוגמאות כדי לשבת על הספסל במשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
15. חזור על שלבים 2.12 – 2.14 פעמיים.
    הערה: השלבים יבטיח כי אין שום זיהום של תאי סטרומה כלי דם עם adipocytes צף.
16. למנוע שברים וסקולרית סטרומה שני מחסני על הקרח לשם עיבוד נוסף, כפי שמתואר את השלבים שלהלן.
    הערה: אל תשאירו את התאים על קרח לשעה יותר כמו זה עשוי להשפיע על הכדאיות תא. Adipocytes יכול להיות קפוא בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך או משמש טרי לניסויים.

3. בידוד תאי אנדותל רקמת שומן

1. ספין שברים וסקולרית סטרומה (SVF) ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
2. הסר את הדגימות לצנטריפוגה ולאחר יוצקים בזהירות את תגובת שיקוע; שמור בגדר המכילות את התאים SVF.
3. Resuspend בעדינות את כדורי תא ב 5 מ של PBS.
   הערה: אם יותר מ- 5 גר' דיפו AT היה מעובד aliquots מרובים (ראה שלב 2.4), מאגר כדורי תא ביחד.
4. ספין הדגימות ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
5. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תאי 1 מ"ל ל- PBS, ולספור את התאים.
   הערה: כאן, מונה אוטומטי תא הניתן שימש לספירת תאים. הכדאיות תא היה מתקבל על ידי ערבוב µL 12 תא השעיה עם 12 µL של פתרון יודיד כתום/propidium (AO/PI) acridine (ראה טבלה של חומרים). המספר הממוצע של תאים לגרם של AT עבור כל דיפו: (א) דיפו אום: 1.69 x ± 4.51 x 10 10^{5 4}; (ב) SC דיפו: 1.24 x⁵ 10 ± 6.45 x 10⁴. הכדאיות של התאים שניכם מחסני היה > 90%.
6. גלולה הדגימות ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
   הערה: פרוטוקול בחירת CD34 immunomagnetic (ראה טבלה של חומרים) הותאמה עבור שלבי 3.7-3.15.
7. Resuspend בגדר ב µL 100 CD34 בידוד המאגר.
   הערה: ספירת התאים הכולל לדרוש אמצעי האחסון re-השעיה הבאים: (א) < 2 x 10⁷ תאים: resuspend בגדר ב 100 µL; (ב) 2 x 10⁸–5 x 10⁸ תאים: resuspend בגדר ב 1 מ"ל. שלבים 3.9-3.16, הכרכים של ריאגנטים פעם היו מוקטן עבור < 2 x 10⁷ תאים.
8. להוסיף 10 µL של CD34 קוקטייל, דגירה המדגם למשך 15 דקות, בטמפרטורת החדר.
9. מוסיפים 5 µL של beads מגנטי, דגירה המדגם למשך 10 דקות, בטמפרטורת החדר.
10. להוסיף 2.5 מ ל CD34 בידוד מאגר כל מדגם ולמקם את הדגימות לתוך המגנט, למשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר.
11. היפוך המגנט עבור 5 s כדי יוצקים את המאגר בידוד.
12. הסר את הדגימות של המגנט, חזור על השלבים 4 x 3.10 ו- 3.11.
13. הסר את הצינורית של המגנט ולהוסיף 2 מ"ל CD34 בידוד המאגר.
14. גלולה התאים ב x 500 g למשך 5 דקות, ב 4 º C.
15. Resuspend תא כדורי ב 1 מ"ל CD34 בידוד מאגר ולספור את התאים.
    הערה: כאן, הוא המספר הממוצע של תאים לגרם של AT: (א) דיפו אום: 4.75 x ± 3.36 x 10 10^{4 4}; (ב) SC דיפו: 1.06 x⁴ 10 ± 9.53 x 10³. פרוטוקול immunobead פלסטיק CD31 הותאמה עבור שלבים 3.16 –  3.34 (ראה טבלה של חומרים).
16. גלולה תאים ב x 500 g למשך 5 דקות, resuspend בגדר µL 250 של מאגר B, µL 250 שטיפת המאגר.
17. Resuspend ביסודיות את החרוזים CD31 על ידי vortexing ברכבת התחתית.
18. הוסף 20 µL של CD31 חרוזים.
    הערה: עקב בתא סכום שנחשב > עונה 1 פרק 10⁶, אמצעי האחסון המידה לפי הקלט של היצרן.
19. דגירה הדגימה עם נדנדה למשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר.
20. לצרף מסננת צינור חרוטי סטרילי 50 מ.
    הערה: הפתח גדול יותר של מסננת חייב להיות על העליונה.
21. לפני ההפרדה תא, להוסיף 1 מ"ל שטיפת המאגר כדי equilibrate את מסננת. החל את התערובת שנוצר תחת צעד 3.16. מסננת.
22. לשטוף את מסננת עם 5 מ של שטיפת מאגר בתנועה סיבובית על הנפח הכולל של 20 מ. לצרף במחבר צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל וסגור את נעל-סכינים סטריליים.
23. לצרף את מסננת המחבר. להוסיף 1 מ"ל של שטיפת מאגר לאורך החומה של מסננת. להוסיף 1 מ"ל מופעל מאגר D לאורך החומה של מסננת. מערבולת המדגם בעדינות, דגירה זה 10 דקות, בטמפרטורת החדר.
24. להוסיף 1 מ"ל שטיפת המאגר. להפריד את התאים החרוזים על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 x.
    הערה: למנוע יצירת בועות אוויר.
25. . לפתוח את המנעול-סכינים סטריליים ולאפשר את התאים מנותקת לזרום לתוך הצינור חרוט 50 מ. לשטוף את מסננת 10 x עם 1 מ"ל של מאגר לשטוף בכל פעם.
26. למחוק את המחבר ואת מסננת, centrifuge את הדגימות ב x 300 גרם במשך 10 דקות, ב 4 º C. Resuspend בגדר תא ב- 2 מ של מדיה EGM-2 מלאה לתרבות.
    הערה: המספר הממוצע של תאים לגרם של AT בנקודה זו היא: (א) דיפו אום: 5.92 x ± 4.27 x 10 10^{3 3}; (ב) SC דיפו: 4.12 x³ 10 ± 2.1 x 10³. הכדאיות של תאים בשני מחסני היה מעל 90%.

4. אינדוקציה של Adipogenesis בתאי האנדותל מבודד

1. לגדל תאי 6-ובכן שטופלו תרביות רקמה צלחות עם מדיה מלאה EGM-2 ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ מיכלים. החלף את המדיה כל 3-4 ימים עד התאים מגיעים למפגש 80-90%.
   הערה: הכפלת האוכלוסייה היא בין 2-3 ימים.
2. להרחיב את התאים על ידי ציפוי אותם על צלחות פטרי 100 מ מ, לפצל את התאים פעם 1:3. בשלב זה, התאים הם על מעבר 2.
3. ספירת התאים באמצעות תא אוטומטי מונה (ראה טבלה של חומרים).
4. תאי זרע כ 100 – 200,000 לוחות 6-ובכן הבטחת בארות כפולים לכל דיפו ותרבות אותם מוחלט מדיה EGM-2 במשך יומיים.
5. האחות את כל התקשורת צמיחה ולהחליף אותו עם 2 מ של DMEM/F12 עם 5% FBS ו- µg/mL 50 של פניצילין/סטרפטומיצין עבור הפקד תאים ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של מדיה Adipogenesis (ראה שלב 1.4) עבור התאים טיפול.
6. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified חממה של₂ CO 13 יום, החלפת המדיה המתאימים כל 3-4 ימים.
   הערה: תאים יתחילו לצבור שומנים לאחר 4 ימים של טיפול.
7. לנהל את אורו, הנילוס אדום מכתים לפי שיטות שפורסמו^15–17.
8. כדי לבודד תאים לחילוץ RNA, התקשורת להסיר לוחות השראה 6-ובכן, לשטוף אותו עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
9. להוסיף 350 µL של guanidium thiocyanate-פנול-כלורופורם פתרון (ראה טבלה של חומרים) כל טוב, דגירה זה בטמפרטורת החדר למשך 5 – 10 דקות.
10. לגרד את התאים מהצלחת באמצעות מגרד תא ולהעביר את התאים צינור microcentrifuge 1.5 mL.
    הערה: הדגימות ניתן לאחסן במקפיא-80 ° C עבור החילוץ-RNA ועיבוד נוסף במועד מאוחר יותר.
11. תמצית ה-mRNA מדגימות באמצעות הוצאה RNA מותאם פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים).
12. לבצע תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) כדי להעריך בביטוי הגן באמצעות את הגששים הבאים: אדיפונקטין, UCP-1 ו- CIDEA (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: כאן, RT-PCR פרוצדורות בוצעו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי הבאים: דנטורציה (95 ° C; 15 s), חישול, והסיומת (60 ° C; 1 דקות) מחזורים 40. הדגימות לידי ביטוי גנים עם ערכים C_T > 35 נחשבו בלתי מורגשת.

תוצאות

פרוטוקול שלנו שואפת לספק גישה במבחנה כדי לקבוע את הפוטנציאל adipogenic של CD34 + CD31 + כלי דם תאים מחסני שונים של רקמת שומן אנושי. תרשים זרימה מפושטת מוצג איור 1A. הצעד הראשון באמצעות מבחר חיובית של CD34 לבטא תאים תוצאות > 95% CD34 + תאים באוכלוסייה של תאים מבודדים טרי ...

Discussion

המוקד של מאמר זה נועד לספק מתודולוגיה עבור בידוד, הרחבה adipogenic אינדוקציה של CD34 + CD31 + תאי אנדותל של מחסני מהבטן, תת עורית של רקמת שומן אנושי.

מתודולוגיות דווחו על בידוד תאי אנדותל של מיטות נימי הדם השונים של מכרסמים או בני אדם המערבות טכניקות בעיקר באמצעות נוגדנים CD31 או fluorescently ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484