העברת סטיאוטטי המאמצת של תאים חיסוניים ציטוטוקסיות במודלים מאתר של האדם Orthotopic גליובלסטומה Xenografts

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק הוכחה-של-קונספט הכדאיות והן את היעילות antitumor של המועבר intrabrain immunotherapies הסלולר.

Abstract

גליובלסטומה (GBM), סרטן המוח הראשית בתדירות גבוהה ביותר אגרסיבי אצל מבוגרים, מזוהה בדרך כלל עם פרוגנוזה גרועה, טיפולים יעילים נדיר הוצעו במהלך העשור האחרון. בין המועמדים מבטיחה עבור תכנון אסטרטגיות טיפוליות מקוריות, immunotherapies הסלולר סומנו כמטרות לחסל פולשני ביותר, כימותרפיה-radioresistant תאים סרטניים, סביר מעורב התדרדרות מהירה, חמורה של סרטן זה. לפיכך, administration(s) של effectors תא החיסון GBM-תגובתי allogeneic, כמו לימפוציטים Vϒ9Vδ2 T האנושי, בסביבת הגידול מייצג הזדמנות ייחודית לספק יעיל, המרוכזת סוכני טיפולית ישירות לתוך אתר של גידולים ממאירים במוח. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול על ההכנה ועל המינהל stereotaxic של לימפוציטים אנושיים allogeneic בעכברים immunodeficient נושאת גידולים במוח העיקרי אנושי orthotopic. מחקר זה מספק של פרה הוכחה הרעיון הכדאיות והן את היעילות antitumor של אלה immunotherapies הסלולר המסתמכים על זריקות סטיאוטטי של לימפוציטים אנושיים allogeneic בתוך intrabrain הגידול מיטות.

Introduction

GBM (מי כיתה אסטרוציטומה הרביעי), הוא סרטן המוח הראשית בתדירות גבוהה ואגרסיבי ביותר אצל מבוגרים. למרות טיפולים אגרסיביים המשלבות ניתוח וכימותרפיה -רדיו, GBM נשאר משויך מאוד פרוגנוזה (חציון ההישרדות של 14.6 חודשים ו 2-בן-התמותה > 73%)¹. זה עדויות כי יש מעט התקדמות טיפולית יעילה מאומתים מעל העשור האחרון². בין המועמדים על עיצוב האתר של יעיל יותר אסטרטגיות טיפוליות^3,4,5, immunotherapies⁶ נידונות כעת לאתר ולחסל גידול פולשני ו רדיו/כימותרפיה-עמידים מאוד תאים, חשד על תרומתם מפתח גידול מהיר ולא קטלנית relapse⁷. אימונולוגי פוטנציאלים שונים היו מזוהה, המוצע עבור immunotherapies, מעורבים טבעי או αβ ששונו או לימפוציטים מסוג T ϒδ כגון GBM ספציפיים גידול אנטיגנים או מולקולות מפגינות^{8,9, 10}. האפשרות לנהל שנבחרו effectors תא החיסון GBM-תגובתי מייצג הזדמנות ייחודית לספק כמויות מוגברות של לימפוציטים ישירות לתוך האתר של ממאירות שיורית. כדי לתמוך באסטרטגיה זו, לאחרונה הראינו כי מודלים בהתבסס על עכברים immunodeficient נושא xenografts orthotopic ראשי GBM האנושי בנאמנות מסכם את הדברים על התפתחות גידולים במוח ב- GBM חולים^9,11. יתר על כן, מודלים אלה שימשו כדי להדגים את היעילות antitumor חזקה של לימפוציטים הועבר adoptively Vϒ9Vδ2T allogeneic אנושי.

פרוטוקול זה מתאר את השלבים ניסיוני קריטי להשגת סטיאוטטי immunotherapies של גידולים במוח, כגון GBM, המבוססת על העברת המאמצת של לימפוציטים מסוג T allogeneic. המאמר מציג: (i) ההגברה של טיפולית allogeneic המערכת החיסונית T לימפוציטים, כמו לימפוציטים אנושיים Vϒ9Vδ2T; (ii) הכנת אלה T לימפוציטים להזרקה; (iii) ההליך עבור ניהול סטיאוטטי בתוך המוח, ליד הגידול. מאמר זה גם מספק תובנה אופן הפעולה של אלה effectors הסלולר לאחר ההזרקה סטיאוטטי.

הגישה הטיפולית המובאת כאן מבוסס על ההזרקה של 20 x 10⁶ אפקטור תאים לכל מנה עבור העכבר immunodeficient נושאות כל המוח. שלב ההרחבה הראשונית במבחנה נדרש לייצר כמויות גדולות של תאים חיסוניים. לכן, לא ספציפית תא הרחבות מבוצעות באמצעות phytohemagglutinin (PHA-L) וכן מוקרן allogeneic מזין תאים: תאים תאי הדם ההיקפית (PBMCs) מן התורמים בריא ותא טרנספורמציה-אפשטיין בר וירוס EBV B-lymphoblastoid קווים (BLCLs), הנגזר PBMCs על-ידי זיהום במבחנה המכילה EBV בתרבות supernatant משורת תאים מרמוסט B95-8, בנוכחות 1 µg/mL וציקלוספורין-א

תאים חיסוניים אפקטור GBM-תגובתי בהשוואה ונבחר במבחנה מבחני⁹. תאים אלה אפקטור מופעלים, הוגדל באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, על פי הטבע שלהם (למשל, אדם Vγ9Vδ2 T לימפוציטים⁹ או וירוס אנטי-הרפס אנושית αβ T לימפוציטים¹²) עם טוהר המינימלי של > 80%, כמו באופן שגרתי נבדק על ידי ניתוח cytometric. ההליך הרחבה תא שיפורטו להלן חל על קבוצות משנה לימפוציטים אנושיים שונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הליך מעורבים בעלי חיים הנושאים הבאים בוצעה בהתאם להנחיות מוסדיים (הסכם #00186.02; ועדת האתיקה האזורי של פיי דה לה לואר [צרפת]). PBMCs האנושי הם בודדו אותנו מהמתרחש הדם שנאספו מתורמים בריאים מושכלת (Etablissement פרנקאיס du שרו נאנט, צרפת). כל הצעדים מבוצעים בתנאים סטריליים.

1. שאינם ספציפיים התרחבות ציטוטוקסיות T לימפוציטים

1. להכין, להאיר מזין תאים ב- 35 Gy. על הגירוי של 2 x 10⁵ - 4 x 10⁵ תאים אפקטור, להכין 10 x 10⁶ PBMCs BLCLs⁶ עונה 1 פרק 10 מתורמים שלושה ייחודי, בריא.
2. Resuspend מזין תאים והן תאים אפקטור 15 מ"ל של RPMI בתוספת 10% לא פעיל חום FCS, 2 מ מגלוטמין, פניצילין (100 IU/mL), ואת סטרפטומיצין (0.1 µg/mL), il-2 רקומביננטי 300 IU/mL.
3. להוסיף PHA-L-ריכוז הסופי של µg 1/mL, לערבב היטב והפצה µL 150 של התליה תא לכל טוב ב 96-ובכן להטלטל U צלחות.
4. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO₂ באווירה humidified.
5. מדי יום לבדוק את הצלחת עד תא גדול מתגבש בצורת הבארות תרבות (~ יום 7).
6. העבר את התאים לתוך בקבוקון תרבות-עונה 1 פרק 10⁶ תאים למ"ל במדיום תרבות טריים.
7. לקבוע את מספר התאים הכולל על ידי ספירת (2 x שבוע) ולתחזק אותם-עונה 1 פרק 10⁶ תאים למ"ל במדיום תרבות טריים.
   הערה: תאים חיסוניים אפקטור אמור להיות מוכן עבור המינהל טיפולית במצב מנוחה (בדרך כלל 3 שבועות לאחר הגירוי הראשוני הגברה). הטוהר, את תגובתיות של תאים אלה אפקטור צריך להיבדק לפני ויוו זריקות (למשל, עם מבחני במבחנה ).

2. שטרם-נותחו אפקטור תאים הכנה

1. לאחר בדיקת ספירת אפקטור, לאסוף את התאים אפקטור בשפופרת 50-mL על ידי צנטריפוגה (300 x g למשך 5 דקות).
   הערה: כדי לפצות על אובדן, להכין את עודף של תאים (למשל, 50 x 10⁶).
2. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend התאים ב-15 מיליליטר וסטרילי PBS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 300 גרם כדי לבצע את השטיפה.
3. ובזהירות לחלוטין להסיר את תגובת שיקוע, ואז resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.
4. העבר את התאים resuspended microtube 1.5-mL עבור צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות.
5. ובזהירות לחלוטין להסיר את תגובת שיקוע על-ידי pipetting לאט.
6. Resuspend בגדר תא ב- µL 8 ל- PBS סטרילי לכל העכבר.
   הערה: זהו צעד קריטי.
7. למדוד את עוצמת הקול של התליה תא על-ידי שימוש של micropipette. אם יש צורך, מוסיפים PBS סטרילי (20 x 10⁶ תאים µL 15 ל- PBS למנה) ומערבבים היטב.
8. לבדוק, באמצעות micropipette, כי אמצעי האחסון הסופי לכל העכבר הוא בין 15 ל-20 μL (imperatively µL < 20).
9. לשמור את התאים על הקרח עד סטיאוטטי הזרקה.
   הערה: לא נבדקו יותר מ 3-h timepoints.

3. הזרקת סטיאוטטי

1. הגדרת ציוד
   1. להרכיב, לכייל מסגרת קטנה סטיאוטטי בעלי חיים על פי הוראות היצרן על מנת להבטיח את הדיוק של זריקות תוך-גולגולתי (למשל, מזרק, לנפח הרצוי בגודל קצב הזרקת).
      הערה: קצב איטי אינפוזיה מומלץ (קרי, 2-3 µL/min).
   2. התקן את החומר תחת מיקרוביאלי ביטחון cabinet (MSC) כדי לשמור על העקרות של המכשירים וכדי להגן על העכברים מפני זיהומים.
      הערה: במקום "גושי איזותרמי" באמבט מים בטמפרטורה 37 º C מערכת זו מגבילה להיפותרמיה של עכברים במהלך הניתוח. חימום רפידות, אשר נחוצים לטיפול procedural, יש להשתמש במהלך ה-ניטור טמפרטורה רציפה.
2. הכנת בעלי חיים שטרם-נותחו
   1. עזים ומתנגד עכבר עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (10 mg/mL), חריגות השירותים הווטרינריים (0.1 מ"ג/מ"ל) ב- µL 10/גרם של משקל הגוף של העכבר.
   2. לבצע בדיקת קמצוץ הבוהן כדי להבטיח הרדמה מלאה של שיכוך כאבים של החיה.
      הערה: כל תנועה היא אינדיקציה עמוק ללא כאבים, ו, במקרה כזה, עוד כמה דקות נדרשים לפני הפעולה.
   3. ברגע העכבר כראוי מרדימים, להשתמש במספריים כדי להסיר את הפרווה באתר כירורגית (בין שתי האוזניים, עד האף).
3. תא שטרם-נותחו הכנה
   1. בזהירות resuspend התאים עם פיפטה (מספר פעמים) לפני כל זריקה למניעת תא כלשהו הצליעה.
   2. בזהירות למשוך נפח התאים הדרושים ההשעיה (15-20 µL) microsyringe 22-G כדי למנוע את השאיפה של בועות.
      הערה: שלב העמסה תא אל microsyringe זה חשוב לצמצם סטיות מוזרק בכמויות. מחדש תאים עבור כל זריקה בודדים בין הליכים כדי למנוע כל תא clumping וכדי להבטיח מספר זוגי של ניהול תאים אפקטור במדגם.
   3. אז, במקום את המזרק לתוך המשאבה מזרק מותאם.
4. טיפול פרוצדורלי
   1. לחטא באתר כירורגית עם מטליות ספוג בתמיסה povidone יוד 5% לפחות 3 x.
   2. הצב משחה אופטלמולוגיות סיכה בעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות יש הקרנית.
   3. מיקום העכבר anesthetized על המסגרת סטיאוטטי, על בלוק איזותרמי חמים מכוסה בניילון סטרילי כדי לשמור על הטמפרטורה של העכבר במהלך הניתוח ולהגביל את התמותה.
      הערה: אף נשרי ושיניים של העכבר כראוי שנמצאת מעל הבר השן, כדי להבטיח זרימת הנשימה נאותה במהלך ההליך.
   4. ברגע כשהעכבר ממוקם מעל הבר השן, להדק את הסורגים באוזן בחוזקה תחת האוזניים של העכבר כדי לשתק את הראש.
      הערה: להיות זהירים כדי לא לגרום נזק את עור התוף או לסכן את הנשימה.
   5. עושים חתך בעור הפנים של קו האמצע 1-2 ס מ עם מספריים סטרילי לאורך החלק העליון של הגולגולת של והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה לחשוף את הגולגולת.
   6. זיהוי הצומת של הווריד, הילתית התפרים (Bregma) כדי לשמש ציוני בלוקאליזציה סטיאוטטי לפני הזריקה (המוצג באיור1).
   7. מניחים את microsyringe מעל נקודה זו.
   8. להעביר את microsyringe הימנית 2 מ"מ ו- 0.5 מ מ קדמי של Bregma.
   9. משתמש של microdrill, לעשות חור קטן בתוך הגולגולת עם מקדחה סטרילי בנקודות הציון קבועה מראש. יש להיזהר נותרו שטחי על מנת למנוע כל פגיעה של המוח.
      הערה: ב פרוטוקול זה, תאים חיסוניים הוזרקו בתוך גידול הוקמה (שבוע לאחר הזרקת תאי הגידול). העור צריך להיות נפתח מחדש (צלקת) ההזרקה מתבצעת באותן קואורדינטות משמש את ההשתלה תא הגידול (החור הוא בדרך כלל עדיין נוכחים עד כדי 2 שבועות לאחר ההזרקה). קואורדינטות נבחרו עבור הזרקת תאי הגידול ו אפקטור ב המוח parenchyma^13,14.
5. הזרקה של תאי מערכת החיסון אפקטור
   1. הכנס את microsyringe לתוך החור קדח ובזהירות, שזזות באיטיות, קדימה מחט 3 מ מ למטה בתוך השכבה הקשה של המוח, ואחר לאחור 0.5 מ מ לעומק הסופי של 2.5 מ מ לפני הזרקת תאי אפקטור.
   2. הפעלת את הזריקה תא אפקטור ב- 2-3 µL/דקה ונטר העכברים לאורך זמן ההזרקה.
   3. לאחר הזריקה תושלם, לשלוף את המחט עבור רק 1 מ מ ולשמור את microsyringe במקום במשך דקה נוספת לפני לאט פורש לחלוטין את microsyringe, כדי למנוע כל זליגות אתר העירוי.
      הערה: בעקבות ההסרה של החיה מהמכשיר סטיאוטטי נקו מיד ציוד הזרקה ניסויים עתידיים.
6. הטיפול לאחר הניתוח ומעקב של העכבר
   1. להסיר את החיה מן המסגרת סטיאוטטי מיד להחיל povidone יוד 5% פתרון באזור הניתוח, לסגור את העור עם תפירה המתאים.
   2. החל לידוקאין 2% ג'ל ישירות על הפצע, לנהל 0.15 µg/g של הבופרנורפין על-ידי זריקה תת עורית עבור procedural שיכוך כאבים.
   3. המקום בחזרה העכבר anesthetized לכלוב שלו מעל כרית החימום מוגדר 37 ° C כדי לשמור על טמפרטורת גוף של העכבר המתאים וכדי למנוע היפותרמיה בכל.
      הערה: דיור נפרדת אין צורך.
   4. לפקח על העכבר עד זה הוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה, להעביר אותו חדר דיור.
      הערה: נכון להיום, פרוטוקול זה ישנה תמיכה כמו כמה סיבוכים בלתי צפויות התרחשו (< 5% של עכברים מוזרק).
   5. מדי יום לפקח על העכברים, להרדימם כאשר סימנים בריאות הפוחתת מובחנות (למשל, תנוחת שפופות, ניידות, השתטחות או ירידה במשקל הגוף משמעותית [≥ 15%]).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מחקר זה מתאר את האסטרטגיה של העברות המאמצת של תאים אפקטור מערכת החיסון התאית בתוך המוח של עכברים נושא הגידול, בהתבסס על זריקות סטיאוטטי שבוצעו ישירות בתוך המיטה הגידול.

כדי למזער כל סיכון של פגיעה מוחית המשויך אמצעי הזרקה גדולים, התליה תא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

העברה המאמצת של נבחרת מקורית או תאים מהונדסים אפקטור המערכת החיסונית מייצג גישה מבטיחה לטפל ביעילות גידולים, כגון סרטן המוח infiltrative, מטפלת הגבלת reactivities נגד תאים שאינם טרנספורמציה^{15, 16,17,18}. עם זאת, מערכת העצבים המרכזית, המ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBMCs			from 3 different healthy donors
BLCLs			from 3 different donors
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)	Gibco	31870-025
FCS	Dutscher	S1810-500
L-glutamine	Gibco	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
IL-2	Novartis	proleukin
PHA-L	Sigma	L4144
Stereotaxic frame	Stoelting Co.	51600
Mouse adaptator for stereotaxic frame	Stoelting Co.	51624
microsyringe pump injector	WPI	UMP3-4
NanoFil Syringe	WPI	NF34BV-2
NSG mice	Charles River	NSGSSFE07S
Ketamine	Merial	Imalgène 1000
Xylazine	Bayer	Rompur 2%
Scissors	WPI	201758
Forceps	WPI	501215
OmniDrill 115/230V	WPI	503598
Vicryl 4-0	Ethicon	VCP397H
Xylocaine	Astrazeneca	3634461