תכופות לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים להערכה של הפרשת הורמון מחלמן פועמת

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול דגימה דם הזנב-טיפ לאיסוף הדגימה תכופים בעכברים ערככם. שיטה זו שימושית עבור להערכת דפוסי הפרשת הורמון מחלמן פועמת, יכול להיות מותאם ניתוח גורמים אחרים במחזור.

Abstract

במערכות רבות האנדוקרינית, במחזור הורמונים או גורמים לא מתפרסמים באופן רציף, אך מופרשים כמו דופק דיסקרטית בתגובה גורם releasing. נקודה אחת דגימה אמצעים מתאימים להבין באופן מלא את המשמעות הביולוגית של התבנית הפרשה של הורמונים פועמת בתנאים רגילים הפיזיולוגיות או במהלך תנאי dysregulation. הורמון מחלמן (LH) מסונתז על ידי תאים gonadotrope יותרת המוח הקדמי והוא מופרש בצורה תבניתית פועמת המחייב אוסף תכופים של דגימות דם להערכת הדופק. זה לא היה אפשרי בעכברים עד לאחרונה, עקב התפתחות assay LH רגישות גבוהה, התקדמות טכניקה עבור תכופים בנפח נמוך המדגם אוסף, תיאר בתחילה על ידי סטיין ועמיתיו. ¹ כאן נתאר פרוטוקול עבור אוסף דגימת דם היקפיים תכופים של עכברים עם הסתגלות טיפול מספיק כדי לזהות פועמת הפרשת LH. בפרוטוקול הנוכחי מפרט תקופת הסתגלות מורחב המאפשר הערכה של פולסים חזקה ומתמשכת של LH שעות מרובות. פרוטוקול זה, קצה הזנב מקוצצת, דם נאסף מן הזנב באמצעות פיפטה של כף יד. עבור הערכה של LH פועמת בעכברים gonadectomized, טורי הדגימות שנאספו כל 5-6 דקות עבור 90-180 דקות חשוב, האוסף של דם ומדידה של פולסים חזקים של LH יכול להתבצע בעכברים ער, להתנהג בחופשיות, לתת טיפול הולם הסתגלות, מאמץ כדי למזער את גורמי איכות הסביבה. הסתגלות מספיק יכולה להיות מושגת תוך 4-5 שבועות לפני איסוף דם. פרוטוקול זה מדגיש ההתקדמות המתודולוגיה כדי להבטיח אוסף דגימות דם מלא עבור הערכת דפוסי הפרשת LH פועמת במשך שעות רבות בתוך העכבר, במודל בעלי חיים רב עוצמה לחקר נוירואנדוקרינים.

Introduction

תפקוד בלוטת המין אצל יונקים הוא תלוי גונדוטרופין הפרשת הורמון מחלמן (LH), הורמוני, מבלוטת יותרת המוח. Gonadotropins המופרשים בדפוס או פועמת או גל בתגובה היפותלמי הפרשת הורמון releasing – גונדוטרופין (GnRH). סינתזה של הפרשת LH ו- FSH מוסדרים באמצעות פעולה אנדוקרינית, paracrine ו- autocrine מתוך מגוון של מולקולות כולל GnRH היפותלמי, האשכים הורמונים סטרואידים, מערכת activin-inhibin-follistatin, כמו גם מספר עצום של מצבים פיזיולוגיים כולל איזון מתח ואנרגיה. ²

הדפוס פועמת של LH בדם נובע הפרשות די פתאומי של LH לדם ההיקפי, ואחריו כ מעריכי חיסול. חשוב על תכונות של הדפוס כוללות את התדירות של כל הפרשה LH את משרעת של התגובה LH, אשר שניהם מוכתבים, בחלקו, על ידי שחרורו של GnRH. בשל הקושי באיסוף הדם פורטל ההיפותלמוס, יותרת המוח למדידת GnRH פועמת, דגימה של מדידה של LH משמש כמדד לקבלת GnRH רגולציה של הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים. לכן, מידע קריטי מקודד בתדר ו משרעת של LH פולסים, אשר לא ניתן לקבוע מתוך מדגם בודד.

ניתוח של הפרשת LH פועמת היסטורית הוגבלה ל היונקים הגדולים (בני אדם, יונקים ו כבשים) עקב שלהם נפח הדם גדול וסובלנות עבור איסוף דגימת דם תכופים. בחולדות, דגימה דם תכופים היה מוגבל חולדה, מושגת באמצעות שכינתה קטטר פרפור. ^{3 , 4} עלות נמוכה יחסית וזמינות של גנטי (למשל cre-לקס, CRISPR) ולבצע מניפולציות מורכבות מעגל עצבי (למשל optogenetics, chemogenetics) עכברים אורגניזם מודל יפה; עם זאת, הפרי של דגימות דם תכופים וניתוח עוקבות של LH ריכוזים עד לאחרונה, הוכח חמקמק. מטלה זו היה חלוץ ידי סטיין ועמיתים לעבודה. ¹ מאז אז, מספר מעבדות החלו לנצל דגימה דם תכופים ואת מבחני לאולטרה רגישות LH כדי להעריך את הפרשת LH פועמת במגוון של פרדיגמות ניסיוני. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} יצוין כי המרדף אחר שיטה מעשית של איסוף דגימות דם מרובים מעכברים כבר מתקיים כבר שנים לפחות 40¹⁰ עם ליטושים מרובים שנעשתה בדרך. ^{11 , 12}

הערכת דפוסי הדופק LH (כלומר תדר ו משרעת) מייצג עידון הגדולות בפיקוח גונדוטרופין הבזליים הפרשת במודל בעלי חיים זה גנטית צייתן. באופן מסורתי, LH ריכוזים בעכברים היו נחושים בדגימת דם בודדת. חולשה אחת הדוגמאות נקודה אחת היא ערכת נתונים משתנה מאוד בגלל ריכוזים LH הם יציבים באופן טבעי במהלך לכל פעימה. חולשה נוספת היא כי מדידות מבודד מטבעו לפסוח על מידע חיוני מועברת על ידי דפוסי הפרשת LH דופק. לפיכך, שיטה לאיסוף דגימות דם תכופים ב להתנהג בחופשיות, עכברים ערככם (למעט טיפול עדין במהלך דגימה) לספק מידע משופרת ולהוכיח שימושי מעבדות רבות חוקרים הורמון פועמת רגולציה.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האוסף של בתדירות גבוהה (כל 6 דקות) דם דגימות ער, ערככם עכברים. חשוב לציין, אנו כוללים טיפול הסתגלות פרוטוקול המאפשר עבור זיהוי חזקה ומתמשכת של הפרשת LH פועמת בדגימות דם שנאסף מעל ניתן לקבוע את משך הזמן בו מראש, שלאחר הערכת אתגר חריפה, כמו התגובה ללחץ פסיכו-סוציאלי של קיבעון ואיפוק. וזמינותו יעיל עבור LH ריכוזים של דגימות דם שתיארנו קודם לכן; ¹ שפרוטוקול זה מתמקדת שיטה לאיסוף דגימות הדם למדידה הדופק LH.

Protocol

השיטה המתוארת כאן הוא מסכים עם הנחיות שימוש ו נבחרת מוסדות של בעלי חיים בריאות, קיבלו אישור על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו.

1. הסתגלות לטיפול

1. הליך הטיפול
   1. מקום העכבר הכלובים אבטחה הקבינט. הסר את העכבר הראשון הכלוב ואת המקום על משטח מתאים (למשל מכסה כלוב נקי) בתוך ארון אבטחה.
   2. בעדינות לרסן את העכבר על משטח העבודה על-ידי החזקת בבסיס הזנב עם לאצבע, של יד אחת. לאחר מכן, בחוזקה קו השטח הגחון של הזנב, מהבסיס ועד קצה הזנב, עם לאצבע, האגודל של היד השנייה. חזור על פעולה זו הוספת קו 6 פעמים (כלומר 1 מוגדרת) ולהחזיר את העכבר לכלוב שלו.
   3. חכה 6 דקות וחזור על שלב 1.1.2.
      הערה: בסך הכל, שלב 1.1.2 תחזור על עצמה 4 פעמים לכל העכבר (כלומר 4 קבוצות של קווים 6), כך כל עכבר יקבל סך של משיכות הזנב 24 על כל יום של טיפול.
2. התדירות של טיפול יומי
   1. מ-5 עד שבועיים לפני יום איסוף דם המתוכנן, להתמודד עם עכברים כפי שמתואר בשלב 1.1, חמישה ימים בשבוע (עכברים לא מטופלים ביום שבת או ראשון עד השבועיים האחרונים של הסתגלות).
   2. אם טיפול ניסיוני במהלך תקופת הדגימה יכלול כל טיפול נוספים (למשל scruffing או הזרקת בקרום הבטן), ואקלום העכברים פעילות זו טיפול בכל מפגש טיפול.
      הערה: עבור הסתגלות לשגרות הזרקה, השתמש מחט קהות לבצע זריקה המזויפים.
   3. במהלך השבועיים לפני יום איסוף דם המתוכנן, להתמודד עם עכברים כמתואר ב- 1.1, שבעה ימים בשבוע.
   4. לפחות שבועיים לפני יום איסוף דם המתוכנן, בית עכברים בזוגות כדי למזער שיבושים לעכברים במהלך הדגימה.

2. הכנת צינורות איסוף דם

1. הכנת מאגר assay העדינה של LH בבקבוק זכוכית: אלבומין שור 0.2% ל- 0.05% Tween-20 ב- PBS [0.2 גרם אשלגן כלורי, 8 g NaCl, g 1.44 נה₂HPO₄ (נטול מים), 0.24 g ח'₂PO₄, מים הנדסה גנטית 1 ליטר, pH 7.4, מסנן אוטוקלב] , לאחסן ב 4 º C. ¹
   הערה: נפח של מאגר assay העדינה של LH להיות מוכן יכול להיות מחושב בהתבסס על מספר דוגמאות ואת אמצעי האחסון עבור דגימה כמצוין להלן (2.2 & דיונים)
2. להכין צינורות איסוף דם (0.6 מ"ל microcentrifuge צינורות). תווית צינורות, מאגר aliquot assay (57 µL מאגר למחזור; הערה, אמצעי אחסון זה עשוי להשתנות בהתאם נפח הדם שנאספו או היחס של הדם אל המאגר הרצוי). צינורות יכול להיות מוכן ימים לפני דגימה, לאחסן ב 4 º C.

3. איסוף דם

1. הכנת דם אוסף חומרים.
   1. להכין הקבינט אבטחה לשימוש ולארגן את החומרים הבאים בשכונה או על עגלה בקרבת מקום: פיפטה טיפים פיפטה (ערכת 3 µL או נפח איסוף הדם הרצויה), 10 µL, לבזבז סל טיפים בשימוש פיפטה, טיימר, התדפיס עם מספרים בעלי חיים, דוגמת מספרים ( עבור הערות בנוגע לסוגיות מדגם או בעלי חיים), קרח בדלי עם צינורות איסוף דם, מספריים, גזה קטנים (2 "x 2").
      הערה: "לספור עד" פונקציה על טיימר מעבדה שימושי. כי אין לו התראה נשמעים עלול להפריע העכברים
   2. השתמש בסמן קבוע כדי לסמן את הזנב של כל עכבר (ליד הבסיס) כדי לסייע בזיהוי מהיר של העכבר הנכון במהלך הדגימה.
2. מסיכה של הכנת זנב ואיסוף הדם מראש.
   1. ב- 45 דקות לפני תחילת איסוף דם, להסיר את העכבר הראשון מהכלוב ומניחים על משטח מתאים (מכסה כלוב נקי עובד היטב) בתוך אבטחה הקבינט.
   2. להשתמש במספריים חדות, סטרילי כדי להסיר 1-2 מ מ של קצה זנב העכבר, בעקבות הכנת אספטי (קרי לשפשף עם betadine ואלכוהול).
      הערה: זה יכול להתבצע בבעלי ער באיפוק עדין או תחת הרדמה איזופלוריין.  בנוסף, שיכוך כאבים עשויים להינתן בעקבות המלצות IACUC המקומי.
   3. בזהירות ללטף את הזנב של העכבר כפי שתואר לעיל (1.1.2; 1-2 קווים מספיקים בדרך כלל) עד ה-droplet של דם צורות בקצה הזנב.
   4. השתמש פיפטה עם טיפ נקי כדי לאסוף 3 µL של דם מקצה הזנב ולהשליך את הטיפ פיפטה עם דם.
   5. לפני שחזר העכבר לכלוב שלו, לוודא כי זרימת הדם הפסיק. במידת הצורך, החל לחץ עדין עם גזה סטרילית.
   6. חזור על שלבים 3.2.1 - 3.2.5 עבור כל העכברים. ניתן לאסוף דגימות דם עוקבות מאת בחוזקה ללטף את הזנב של העכבר עד droplet של צורות דם בקצה הזנב.
      הערה: אם droplet דם אינו הטופס לאחר משיחות המשרד, הזנב יכול להיות נכנס עם כרית גזה ספוגה תמיסת מלח. קרישי דם הם נוטים יותר טופס במהלך דגימה בתדירות נמוכה יותר (קרי > במרווחי זמן של 15 דקות). לאחר שקריש מנוקה מן הווריד, הדגימה תוכל להמשיך.
   7. להמשיך לאסוף 3 µL של דם בכל עכבר כמתואר לעיל כל 6 דקות למשך כ- 45 דקות במהלך תקופה זו הכנה איסוף דם מראש. למחוק את הטיפ דם, פיפטה.
3. לקיחת דמים
   1. לאסוף 3 µL של דם מקצה הזנב כמתואר לעיל. קח זהירות כדי להבטיח כי לקיחת דגימה 3 µL כולו לתוך קצה פיפטה (ללא בועות או מצעים זיהום). הוצא את דגימת הדם לתוך המאגר assay בשפופרת עם תוויות. לערבב על ידי היפוך ולחזור ברכבת התחתית לקרח.
   2. לפני שחזר העכבר בכלוב, להבטיח זרימת הדם הפסיק. במידת הצורך, החל לחץ עדין עם גזה סטרילית.
   3. חזור על הצעדים 3.3.1 - 3.3.2 עבור כל עכבר, כל 6 דקות, משך הדגימה מראש. לפקח על כל בעל חיים סימנים של מצוקה (למשל סגור חלקית העפעפיים, תפקיד הכפוף [אינה נגרמת על ידי טיפול אחר] או חוסר תגובה לטיפול) ולסיים את הדגימה, במידת הצורך.
      הערה: מצוקה התנהגותית או לסיבוכים אחרים הדורשים סיום של הדגימה מתרחשות לעתים רחוקות מאוד במעבדה שלנו.
   4. אם בעלי חיים אינם מורדמים בעקבות לקיחת דמים, להבטיח זרימת הדם מהקצה הזנב הפסיק לגמרי. לנגב דם שנשפך מהחלק הפנימי של כל חיה בכלוב (או שינוי הכלובים) ולחזור חיות הכלובים אל המדף דיור.

4. לטעום עיבוד וניתוח

1. לאחסן דגימות דם ב-20 ° C עד הניתוח.
   הערה: LH הוא לבדיקה בדגימות דם מדולל במאגר assay; אין הפרדה של sera או פלזמה נדרשת לפני אחסון או ניתוח.
2. Assay דגימות דם מאת אליסה העדינה כמו שתואר לעיל ערכים¹ וח ב- ng/mL של דם מלא בעקבות תיקון עבור דילול של אמצעי האחסון מדגם במאגר וזמינותו.
3. לזהות LH פולסים בערכת הנתונים. לחשב ולהשוות הדופק הממוצע משרעת תדירות דופק (או מרווח בין הדופק) בהתאם לערכת הנתונים.
   הערה: קריטריונים שפורסמו^13,14 תוכניות,^15,16 לגילוי פולסים LH הינם זמינים.

תוצאות

נציג LH הדופק דפוסים של עכברים 4 מוצגים באיור 1 (נתונים הודפס מחדש של יאנג. et al., 2017). LH נמדדה בדגימות דם בתדירות גבוהה כדי לקבוע את התגובה מהווה אתגר כהתקפת פסיכו-סוציאלי. עכברים C57/Bl6 הנשי למבוגרים היו ovariectomized, טיפל כמפורט בפרוטוקול זה עבור איסוף דם תכופי?...

Discussion

כאן נתאר פרוטוקול עבור איסוף דם תכופים של דגימות דם כל זנב-טיפ להערכת הפרשת LH פועמת בעכברים. פרוטוקול זה מאפשר איסוף דגימות לגילוי של שינויים חריפה פועמת הפרשת LH בעקבות חשיפה דחק פסיכו-סוציאלי, והוא מותאם היטב עבור הערכה של LH פולסים מתחת אחרים מניפולציות אקוטי או כרוני.

הטיפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosaftey cabinet	Lab Products Inc	L/F-B
Bovine serum albumin	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (anhydrous)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Ultrapure water	Millipore		Purified and filtered water
Broome Rodent Restraint Device	Harvard Apparatus	52-0460	Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001