אין ויוו Photolabeling של תאים במעי הגס כדי להעריך את פוטנציאל הנדידה של תאים Hematopoietic בעכברים Neonatal

Summary

הפרוטוקול המתואר כאן משתמשת בגישה photolabeling בעכברים היילוד במיוחד לזהות תאים חיסוניים להגר מן המעי הגס לאתרים במיוחד מעיים. אסטרטגיה זו יהיה מועיל ללמוד אינטראקציות מארח-microbiome בחיים מוקדם.

Abstract

קהילות חיידקי המעית נקבעו בשלב מוקדם בחיים ולהשפיע על התפתחות תאי המערכת החיסונית ותפקוד. Microbiota neonatal חשופה להשפעות חיצוניות רבות, כולל שימוש אנטיביוטיקה, דיאטה, אשר משפיעה על הרגישות אוטואימוניות ומחלות דלקתיות. הפרעות כגון דלקת המעי המחלה (מחלת המעי הדלקתי) מאופיינים על ידי המאסיבית של תאים חיסוניים למעיים. עם זאת, תאים חיסוניים מותנה microbiota אולי בנוסף להגר מחוץ למעיים. להשפיע על תגובות חיסוניות באתרי אקסטרה מעיים. לפיכך, יש צורך לזהות ולאפיין תאים עשויים להעביר מסרים חיידקים מהמעיים לאתרים דיסטלי. כאן, אנו מתארים שיטה תווית תאים במעי הגס של עכברים היילוד ויוו המאפשרת את הזיהוי שלהם באתרי אקסטרה מעיים לאחר ההעברה.

Introduction

מערכת העיכול יונקים בנמלים מאות מינים של חיידקים הקיימים במערכת יחסים סימביוטיים עם מארח¹. תאים חיסוניים נוכח הסביבה המקומית שבה התרחשה לאכוף שוחר שלום עם החיידקים האלה ולהקים מחסום הגנה מפני פלישות הפתוגן. לפיכך, דו-כיוונית אינטראקציות בין תאים חיסוניים את microbiota הם קריטיים להקים קהילה commensal אשר מחנך את מערכת החיסון של הפונדקאי ומגדיר את סף תגובתיות מערכת החיסון פתוגנים. שינויים בשירותים מיקרוביאלי, או dysbiosis, להפריע את המערכת החיסונית הומאוסטזיס ואת perturb מעגלים רגולטוריות לרסן דלקות מעיים המוביל בתיווך החיסון למחלות כמו סוכרת מסוג 1, מחלת המעי הדלקתי^2,3 .

תקופת מיד לאחר הלידה הוא חלון התפתחותי ייחודי שבמהלכו הקהילות מיקרוביאלית מעיים להתחיל להקים בו זמנית את מערכת החיסון מבשילה⁴. Microbiota לאחר הלידה אינה יציבה, עם משמרות הרכב הקהילה המתרחשים באופן טבעי, לעתים קרובות⁵. תאים חיסוניים המקיימים אינטראקציה עם microbiota שוכנים שני אנטומי מקומות נפרדים במעי - את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי⁶. סוגים רבים של תאים חיסוניים נמצאים המעי, כולל לימפוציטים (כגון תאי T, תאים B ומולדת בתאי הלימפה) כמו גם התאים מיאלואידית (הכוללות תאים דנדריטים, ומונוציטים ו מקרופאגים). תאים אלה, ידוע גם בתאי hematopoietic, לבצע מספר רב של פונקציות לשמר את מחסום המעי ולשמור הומאוסטזיס.

בנוסף פונקציות התקינה שלהם באתרים מעיים, תאי המערכת החיסונית של רירית עשוי גם להעביר מסרים מיקרוביאלי לאתרים מעיים במיוחד כדי לווסת את החסינות מערכתית-^7,-^8,-⁹. זהו אזור גידול מחקר מעניין והוא מדגיש את הצורך שיטות לזהות תאים חיסוניים נודדים מתוך הרקמות מעיים על מנת לחקור את תפקידם. פרוטוקול דיווח כאן מנצל דגם העכבר זמינים מסחרית שבה החלבון הניאון photoconvertible הוא מנוצל לתאים תווית. פאם^טוחנות עכברים מביעים ubiquitously של חלבון פלואורסצנטי ירוק Dendra2 זה בלתי הפיך נכנס למצב פלואורסצנטי אדום על הפעלה על ידי אולטרה סגול (UV) אור¹⁰. באמצעות הצינורית אופטיים סיבים כדי לספק אור 405 ננומטר לתוך המעי הגס של עכברים היילוד, נדגים כי ניתן למצוא תאים hematopoietic photoconverted, אשר מקורו או transited דרך המעי הגס הטחול.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו עם האישור של ובציות על טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים הכללי במסצ'וסטס.

התראה: פרוטוקול זה כרוכה בשימוש של class 3b לייזר (LG3). משקפי בטיחות לייזר LG3 תמיד חייב לשמש בעת הפעלת הלייזר הזה. חייב להיות במעקב הנחיות בטיחות והדרכה המתאימים כדי למנוע את הסיכון לפציעות.

1. עיצוב והרכבה של לייזר

1. לחבר את דיודות פולטות אור (LED) (405 ננומטר, 19.3 mW, אמא 1400, מצמידים סיבים) LED הנהג באמצעות הכבל המחבר של 4 פינים M8 המגיע מחובר ה-LED. בזהירות להדק את הבורג כדי להדק את הקשר.
2. לפני חיבור כבל תיקון ה optogenetics ה-LED, להחזיק את המחבר פתיחה של ה-LED עד האור כדי להבטיח שם הביתור לא נראה לעין. תנשוף על החור כדי למנוע כל הפרעה במידת הצורך, הכנס את כבל תיקון optogenetics לתוך הפתח.
3. לחבר את הצינורית סיבים אופטיים הכבל תיקון optogenetics על-ידי הוספת את הצינורית אחד מהקצוות של השרוול המחבר. לצרף את הקצה השני של השרוול מחבר כבל תיקון.  מספיק ללחוץ כדי לאבטח את הקשר אך הקפד לא לכופף או לפרוץ את סיב אופטי הצינורית.
   הערה: הצינורית סיב אופטי סיבים שביר הוא מכוסה את המכסה המגן בכל פעם הלייזר אינו בשימוש.
4. הגדר את הנהג LED למצב (CW) רציף wave עם הידית התאמה רציפה-0 והגבול הנוכחי מוגדר כ- 1.2 א

2. Photoconversion של תאים במעי הגס

הערה: זכר ונקבה עכברים נחשפו intracolonic 405 ננומטר אור 1-2 ימים לאחר הלידה שלהם, הוקרבו לפני שבוע 1 של גיל.

1. לאבטח ממיקום כהה עם גישה לשקע חשמל. הנהג LED מתחברים לשקע.
   הערה: הליך זה מבוצע באור לבן מינימלית כמו חשיפה ממושכת של העכברים תאורת עלול לגרום photoconversion לא רצויים של תאים. אור אדום משמש כחלופה.
   התראה: השלב הבא כרוכה בשימוש של חיה הרדמה. הממשל של ההרדמה מתבצעת בשכונה Class II או באמצעות מערכת הניקוי המתאים אחרת. שאיפת ההרדמה עלול לגרום סחרחורת, נמנום או אפילו חוסר הכרה.
2. עזים ומתנגד העכבר על ידי חשיפה לאיזופלוריין 4-5% 100% O2 בתיבת אינדוקציה. לאמת עומק נאותה של הרדמה על ידי בחוזקה צובט כפה האחוריות (ללא תגובה). לשמור על הרדמה באמצעות קונוס האף כ 2% איזופלוריין. למנוע חשיפה המטפל איזופלוריין על ידי שימוש של המנוע המתאים או התקן הניקוי הרדמה.
3. מיקום העכבר anesthetized לחשיפה intracolonic באמצעות 1 יד על עורפה האחורי של העכבר בעדינות עם האגודל והאצבע. . תהפוך את העכבר כדי לחשוף את הבטן שחרר את אחיזת אם העכבר מתחיל. לאבד את צבעו ורוד או אם קצב הנשימות שלה מתחיל להאט. אבטח את הזנב של העכבר בין כביש הטבעת של האצבעות.
4. עם היד השנייה, להסיר את המכסה המגן הצינורית. תוך שמירה על ציר הארוך של הצינורית במקביל קו האמצע של העכבר, הכנס בעדינות את הצינורית סיבים אופטיים דרך פי הטבעת לתוך המעי הגס כך כל 5 מ מ של סיבים אופטיים הם בתוך העכבר.
   הערה: הליך זה מתבצע לאט ובזהירות, לא כדי לנקב את הקיר חוקן. דקה נענוע ומתפתל של הצינורית עזרי קידום לתוך המעי הגס.
5. דון את משקפי בטיחות ולהגדיל את הלייזר הנוכחי לערך המרבי (כל הדרך עם כיוון השעון). לאשר הנוכחות של אור UV על ידי הסתכלות על הבטן שקוף של העכבר.
   הערה: משקפי בטיחות לייזר LG3 באופן דרמטי להפחית הניראות. יש לסייע עמית (ללבוש ציוד מגן) עוטה את משקפי המגן, הפעלת הלייזר.
6. לחשוף את המעי הגס כדי אור לייזר עבור סכום כולל של 2 דק להחלפה הצינורית כ- 1 מ מ לכל 30 s כדי למקסם את האזור luminal חשוף לאור. בסוף 2 דקות, כבה את הלייזר.
7. אט-אט להסיר את הצינורית של העכבר. לאחר התאוששות מהרדמה בכלוב חמים ריק, להחזיר את העכבר לכלוב הביתה.

3. בידוד של לימפוציטים מעיים

1. להכנת 1 ליטר של ההאנק פתרון מאוזן מלח/עגל סרום (HBSS/CS) המאגר, 200 מ ל רצועת אפיתל המאגר, 500 מ"ל של שטיפת מדיה ו- 200 מ ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)-ללא שטיפת המדיה.
   הערה: אמצעי האחסון ריאגנט מחושבות עבור גודל דגימה של 9.
   1. להפוך את המאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS) על-ידי הוספת 50 מ של CS עד 950 מ"ל של HBSS. אחסן אותו בקרח.
   2. הכנת המאגר רצועת אפיתל [HBSS CS 5% 1 מ dithiothreitol (DTT); 5 מ מ EDTA; 15 מ מ- 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazine-1-ethanesulfonic-חומצה (HEPES) (pH 7.2-7.5)] על-ידי הוספת 10 מ"ל של CS, 200 µL של 1 מ' DTT, 2 מ של EDTA 0.5 M ו- 3 מ של 1 מ' HEPES מאגר 185 מ של HBSS. מקום המאגר רצועת אפיתל באמבט מים 37 º C.
   3. להפוך את המדיה לשטוף (HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA) על-ידי הוספת 5 מ ל CS 1 מ"ל של 0.5 M EDTA 494 מ של HBSS. אחסן אותו בטמפרטורת החדר.
   4. להכין ללא EDTA שטיפת המדיה (15 מ מ HEPES; HBSS; 1% CS) על-ידי הוספת 2 מ"ל של CS ו- 3 מ"ל של 1 מ' HEPES 195 מ של HBSS. אחסן אותו בטמפרטורת החדר.
   5. להפוך את מאגר FACS [1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) (ה-pH = 7.2); CS 2%] על-ידי הוספת 10 מ"ל של CS 490 מ של PBS. אחסן אותו בקרח.
2. להכין את המאכל אוסף רקמה על-ידי הצבת מסננת תא מיקרומטר 70 בתוך לצלחת תרבות 60 x 10 מ מ. להוסיף 10 מ ל מאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; מאגר CS 5% שבוצעו בשלב 3.1.1 ומאוחסנים על קרח) לצלחת ומניחים אותו על הקרח.
3. המתת חסד את העכבר באמצעות מנת יתר של איזופלוריין בשאיפה באמצעות ניקוי המתאים של הרדמה (כ 3 דקות חשיפה > איזופלוריין 4% באוויר חדר או ב- 100% O₂). לאחר הפסקת לכאורה של נשימה, רפלקס תנועה, לוודא העדר כאב עמוק על-ידי בחוזקה צובט כפה האחוריות (באמצעות מלקחיים מומלץ). ודא המתת החסד באמצעות עריפת ראש באמצעות זוג מספריים כירורגיים או תער חדש.
   הערה: נקע בצוואר הרחם לא מומלץ בשלב זה עקב גודל גיל של החיה. שיטות אלה תואמים ההנחיות AVMA 2013 על המתת חסד ואושרו על-ידי IACUC MGH.
4. הקציר המעי הגס באמצעות מלקחיים נקי ומספריים כדי לפתוח את הבטן. משקפים את המעיים לצד 1 של הבטן של העכבר כדי לחשוף את המעי הגס. להסיר את כל המעי הגס על ידי הראשון transecting זה רק הדיסטלי (לכיוון פי הטבעת) כדי המעי. לאחר מכן, בזמן אוחז בחוזקה המעי הגס עם מלקחיים, להשתמש במספריים לחתוך דרך השופכה אל החלחולת. חותכים את המעי הגס כמו קרוב לפי הטבעת ככל האפשר. הקציר הטחול לאחר הסרת המעי הגס (ראה שלבים 4.1-4.2 להלן).
   הערה: בזמן פרוטוקול photoconversion רק מטרות ~ 25% של המעי הגס של היילוד (5 מ מ הצינורית סיבים אופטיים), המעי הגס כולו האיסוף כדי לסייע בבידוד התא.
5. ניקוי המעי הגס באמצעות מלקחיים כדי לדחוף את תוכן המעי הגס, על גבי מגבת נייר יבש. Homogenize הרקמה באמצעות סכיני קוצצים המעי הגס לתוך עיסה על השער של צלחת תרבות ואז להעביר את הדבק הזה מסננת תאים בצלוחית הפטרי.
6. להוסיף פס מגנטי זמן מערבבים נקי 8 מ"מ ל מסננת ולמקם את המנה על צלחת 9-מיקום פגים. להגדיר את מהירות בר מגנטי מערבבים עד 800 סל ד, דגירה את התאים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את המאגר וחזור בכביסה באמצעות 10 מ"ל של HBSS/CS (את HBSS; מאגר CS 5% שבוצעו בשלב 3.1.1 ומאוחסנים על הקרח). לבטל את המאגר במשרד בסוף לשטוף.
7. מביצועם בתאי אפיתל על-ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר prewarmed רצועת אפיתל (HBSS את CS 5% 1 מ"מ DTT; 5 מ מ EDTA; 15 מ מ HEPES [pH 7.2-7.5] מאגר שבוצעו בשלב 3.1.2 ומאוחסנים באמבט מים 37 ° C) כדי מסננת התא ומערבבים במהירות של 800 סל ד למשך 30 דקות ב- 3 החממה 7 ° C. בסוף הדגירה, להעביר את המאגר המועשר השבר אפיתל אל צינור נקי 15 מ"ל.
   הערה: אפיתל ותאים המשויך (תאי אפיתל המעי ו לימפוציטים אפיתל המעי) משתחררים לתוך המאגר, בעוד התאים שלמה פרופריה. מוסקולריס להישאר על מסננת התא במהלך שלב זה¹¹.
   1. Centrifuge מועשר מעיים אפיתל השבר (IELs)-700 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר FACS. לאחסן אותו על הקרח לשימוש בשלב 3.15.
8. לשטוף את השבר פרופריה. מוסקולריס בתוך מסננת התא 2 x עם HBSS/מדעי המחשב. כדי לעשות זאת, להוסיף 10 מ של פתרון HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS מאגר שבוצע בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מסננת תא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד במשך 5 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.
9. לשטוף את הדגימה 2 x בתקשורת לשטוף. להוסיף 10 מ של שטיפת המדיה (HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA מאגר שבוצעו בשלב 3.1.3 ומאוחסנים בטמפרטורת החדר) מסננת תא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד למשך 15 דקות חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.
   1. לאחר השימוש בתקשורת לשטוף, לאחסן אותו על הקרח לשימוש בשלב 3.14.
10. לשטוף את הדגימה 2 x עם HBSS/מדעי המחשב להוסיף 10 מ ל מאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS מאגר שבוצעו בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מסננת תא ולבחוש אותו ב 800 סל"ד למשך 5 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.
11. דגירה הרקמה במאגר שטיפה נטולי EDTA. להוסיף 10 מ ל מאגר שטיפה נטולי EDTA (HBSS; 1% CS; 15 מ מ HEPES מאגר שבוצעו בשלב 3.1.4 ומאוחסנים בטמפרטורת החדר) מסננת תא, דגירה את הצלחת. בשביל 10 דקות בטמפרטורת החדר, ללא ערבוב. לבטל את המאגר בסופו של שלב זה.
12. לשטוף את הדגימה 2 x עם HBSS/מדעי המחשב ולהכין את הפתרון אנזים. להוסיף 10 מ של HBSS/CS (HBSS; 5% CS מאגר שבוצעו בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מאגר כדי מסננת התא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד 10 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.
    1. להכין את הפתרון אנזים (ללא EDTA לשטוף מאגר; 0.1 מ"ג/מ"ל DNase אני; collagenase 167 מ"ג/מ"ל) בתקופת שטיפת שני: להוסיף 9 מ ג של DNase ו- 15 מ ג של collagenase lyophilized עד 90 מ"ל של EDTA ללא לשטוף את מאגר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.
13. לעכל את השבר פרופריה. מוסקולריס הכלול מסננת התא כדי להשיג פרופריה. מוסקולריס לימפוציטים (LPLs). להוסיף 10 מ של הפתרון אנזים (EDTA ללא שטיפת מאגר; 0.1 מ"ג/מ"ל DNase אני; 167 מ"ג/מ"ל collagenase מאגר שבוצעו בשלב 3.12.1, בטמפרטורת החדר) על מסננת התא ולבחוש אותו ב- 800 סל ד למשך 45 דקות בחממה 37 ° C.
    הערה: LPLs משתחררים אל הפתרון לאחר עיכול אנזימטי.
    1. לאסוף את הפתרון אנזים המכילות את התאים ולסנן אותו דרך מסננת תא חדש לתוך צינור חרוטי 50 מ.
14. הוסף 20 מ של כביסה קרה מדיה (את HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA מאגר תוצרת בשלב 3.1.3 ומאוחסן על הקרח בשלב 3.9.1) לתאים מסוננים כדי לחסום את פעילות collagenase בפתרון אנזים. Centrifuge את הצינור ב 700 g x עבור 6 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה LPLs ב 1 מ"ל של מאגר FACS.
15. לשלב את אישור IEL (מתוך שלב 3.7.1) ושברים LPL (מתוך שלב 3.14) ו תכתים אותם עם פלורסנט מצומדת נוגדנים לניתוח cytometric זרימה (ראה שלב 5).
    הערה: שברים אישור IEL ו- LPL ייתכן מוכתם בנפרד אם מידע תא רצוי.

4. בידוד של לימפוציטים מן הטחול

1. הכינו את הצינור איסוף על-ידי הוספת µL 500 FACS מאגר לתוך צינור microcentrifuge. לאחסן אותו על הקרח.
2. לאחר הסרת המעי הגס (שלב 3.4), למסוק את הטחול כולו ולמקם אותו בצינור אוסף. אחסן את הרקמה על קרח.
3. באמצעות מהמגן של רקמות חשמלי, homogenize הטחול צינור microcentrifuge עבור 1 מינימלית צנטריפוגה המדגם-g x 300 [צנטריפוגה מיקרו] עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע.
4. לבצע את פירוק תאי הדם האדומים על ידי resuspending לדוגמה ב- 500 µL אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) פירוק מאגר ליזום מוות של תאים על-ידי פירוק osmotic. לאפשר את הדגימה דגירה 1-2 דקות בטמפרטורת החדר, ואז resuspend אותו ב- µL 725 FACS המאגר.
5. Centrifuge המדגם-g x 300 [צנטריפוגה מיקרו] עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ב 500 µL מאגר FACS ולסנן אותו דרך מסננת תא 40 µm לתוך צינור microcentrifuge. להעביר את הדגימה כל צינור microcentrifuge, את הכתם עם פלורסנט מצומדת נוגדנים לניתוח cytometric זרימה (ראה שלב 5).

5. זיהוי של Dendra-r⁺ תאים באמצעות Flow Cytometry

1. Centrifuge הדגימות LPL/אישור IEL וה טחול ב g 300 x [צנטריפוגה מיקרו] למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע.
2. Resuspend כדורי ב- 100 µL של נוגדן מכתים מיקס. להכין נוגדן מכתים לערבב על-ידי הוספת 1 µL של נוגדן anti-CD45 מצומדת fluorescently µL 100 FACS מאגר עבור דגימה.
   הערה: חשוב titrate נוגדנים המשמש את cytometry זרימה לפני הניסוי כדי לקבוע ריכוז אופטימלי בו מחייב רוויה מתרחשת.
3. דגירה בדגימות במשך 35 דקות על קרח (במיקום כהה).
4. Resuspend את הדגימות ב- 300 µL מאגר FACS, centrifuge אותם ב g 300 x [צנטריפוגה מיקרו] למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את הדגימות בשנת 325 µL מאגר FACS. לנתח את הדוגמאות על cytometer זרימה.

תוצאות

כבל סיבים אופטיים שימש כדי לספק אור 405 ננומטר לתוך נקודתיים של עכברים^טוחנות PhAM 2 - בן יום. בניסויים הקודמים, חשיפה של 30 נקבע לתת photoconversion מקסימלי של המעי הגס תאים עם cytotoxicity מינימלי (איור 1א'). לכן, רציפים-30 s חשיפות של חלקים שונים של המעי הגס בוצע?...

Discussion

זיהוי ואפיון של תאים אינטראקציה עם והם מושפעים את microbiota במעי הגס הם חשובים, צריך להקל על ההבנה של איך מועבר מידע microenvironment הרירית לשאר חלקי הגוף. שיטה אחת ללמוד נדידת תאים הקשורים הבטן דורש את הבידוד של תאים הקשורים בטן ואחריו העברה המאמצת לתוך עכברים הנמען כדי לקבוע דפוסי רקמה-יונת שלהן לת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser
Light Emitting Diode (LED)	THORLABS	M405FP1	CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1
LED driver	THORLABS	LEDD1B	Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Optogenetics patch cable	THORLABS	M87L01	1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Fiber optic cannula	Doric lenses	MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45	5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
Power supply	THORLABS	KPS101	Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
LG3 laser safety goggles	THORLABS	LG3	Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
Red light	Electron Microscopy Sciences	74327-10	15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences
Intestinal cell isolation
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.  https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSS	Gibco	14025076	Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076
Calf Serum	Hyclone AZM	197696
EDTA	Invitrogen	15575020	0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
DTT	Sigma	10197777001	CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US
HEPES	Gibco	15630080	1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
Petri dish	Corning	353004	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
70 micron cell strainer	Falcon	352350	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Micro magnetic stir bar	Fisherbrand	1451364	Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
Magnetic stir plate	Corning Laboratory Stirrers	440826	https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
Collagenase	Roche	5401020001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase I	Sigma	10104159001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US
1X PBS	Gibco	20012-027	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
Pipet aid	Thermo Scientific	14387165	https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
10 mL serological pipet	Falcon	357530	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
25 mL serological pipet	Falcon	357515	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
15 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339651	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
50 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339653	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Single cell suspension
Eppendorf tubes	Seal-Rite	1615-5500	Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
Tissue homogenizer	Kimble	K7495400000	Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Homogenizer tips	Kimble	7495210590	Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
40 micron cell strainer	Falcon	08-771-1	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Antibodies
BV786 anti-mouse CD45	BD	564225	Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Live/Dead	Invitrogen	L34962	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Other
Razor blades	VWR	55411-050	Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades