JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה (TIRFM) באמצעות מצע DNA λ ששונה site-specifically נקודה קוונטית הנקרא חלבון.

Abstract

מיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית תרם תרומות גדול בניתוח במנגנונים של תהליכים ביולוגיים מורכבים ברמת מולקולה בודדת. מולקולה בודדת מבחני ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א, ישנם שני גורמים חשובים עבור שיקול: המצע DNA עם אורך מספיק עבור תיוג חלבון גשש פלורסנט מתאימים ופיקוח קל. 48.5 kb λ DNA הוא מועמד טוב המצע הדנ א. נקודות קוונטיות (Qdots), כמחלקה של הגששים פלורסנט, מאפשרים התבוננות ותיק (דקות עד שעות) ו ייבוא תמונות באיכות גבוהה. בנייר זה, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון-דנ א ברמת מולקולה בודדת, הכוללת הכנת λ ששונה site-specifically DNA, תיוג חלבון המטרה עם מצופים streptavidin Qdots. עבור הוכחת הרעיון, נוכל לבחור אורק (זיהוי מקור מורכבים) בניצני שמרים כמו חלבון עניין והמחש ביחסיו עם ארס (רצף באופן עצמאי שכפול) באמצעות TIRFM. לעומת אחרים הגששים פלורסנט, Qdots יש יתרונות ברורים במחקרים מולקולה בודדת בשל עמידותו גבוהה נגד photobleaching, אך ראוי לציין כי מאפיין זה מגביל את היישום שלה במבחני כמותית.

Introduction

אינטראקציות בין חלבונים ודנ א חיוניים רבים תהליכים ביולוגיים מורכבים, כגון שכפול ה-DNA, DNA לתקן שעתוק. למרות גישות קונבנציונליות יש לשפוך אור על המאפיינים של תהליכים אלה, מנגנונים מרכזיים רבים עדיין אינם ברורים. לאחרונה, עם טכניקות מולקולה בודדת המתפתחת, חלקם של המנגנונים היו כשהיא ממוענת1,2,3.

היישום של מולקולה בודדת פלורסצנטיות מיקרוסקופ על להמחיש בעיקר אינטראקציות חלבון-DNA בזמן אמת תלויה ההתפתחות של זיהוי קרינה פלואורסצנטית וזונדים פלורסנט. עבור מחקר מולקולה בודדת, חשוב לה תווית החלבון עניין גשש פלורסנט מתאים מאחר ומערכות גילוי פלורסצנטיות הם בעיקר זמינים מסחרית.

פלורסנט חלבונים משמשים בביולוגיה מולקולרית. עם זאת, הבהירות פלורסנט נמוך ויציבות נגד photobleaching להגביל את היישום שלה במבחני מולקולה בודדת רבים. נקודות קוונטיות (Qdots) הם זעיר פולט-אור חלקיקים4. בשל תכונותיהם אופטי ייחודי, Qdots בהירים 10 - 20 פעמים, מספר אלפי פעמים יציב יותר מאשר בשימוש נרחב אורגניים צובעת5. יתר על כן, Qdots יש גדולים סטוקס shift (ההפרש בין המיקום של פסגות עירור, פליטה)5. לכן, ניתן להשתמש Qdots תצפית ותיק (דקות עד שעות), רכישת תמונות עם יחס אות לרעש גבוה, בזמן שהם לא יכול להיות מנוצל על מבחני כמותית.

עד כה, ישנן שתי גישות לתייג את חלבון המטרה עם Qdots site-specifically: תיוג בסיועם של7,6,Qdot מצומדת ראשית או משנית של נוגדנים8; או תיוג היעד החלבון עם Qdots ישירות, אשר מבוססת על האינטראקציה חזקה בין ביוטין ו streptavidin9,10,11,12,13. מצופים Streptavidin Qdots זמינים מסחרית. במחקר האחרון שלנו, site-specifically biotinylated חלבונים בניצני שמרים עם יעילות גבוהה היו מטוהרת על-ידי co-ביטוי של בירה וחלבונים מתויג אבי in vivo10. על ידי16,1715,14,מבחני יחיד מולקולה הפעולות הבאות ואופטימיזציה, ראינו את האינטראקציות בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ודנ א-באמצעות רמת מולקולה בודדת TIRFM10.

כאן, אנו בוחרים את ניצני שמרים מקור זיהוי מורכבים (ORC), אשר ניתן באופן ספציפי לזהות, לאגד הרצף באופן עצמאי שכפול (ARS), כמו שלנו חלבון עניין. הפרוטוקול הבא מציג הליך שלב אחר שלב של ויזואליזציה האינטראקציה של התווית על-ידי Qdot אורק עם ארס של שימוש TIRFM. הכנת המצע דנ א שונה site-specifically, biotinylation את ה-DNA, הניקוי coverslip functionalization, את מכלול תאי זרימה ואת ההדמיה מולקולה בודדת מתוארים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת המצע DNA λ-ARS317

  1. ה-DNA המצע בנייה ואריזה
    1. לעכל λ יליד הדנ א באמצעות Xhoאני האנזים; להגביר את קטע DNA 543 בן שלוש bp כיוון ARS317 של ה-DNA גנומי של ניצני שמרים באמצעות תחל המכיל 20 bp הומולוגי רצף של במעלה הזרם, במורד הזרם של Xhoאני האנזים באתר למדא הדנ א. להוסיף 100 ננוגרם של Xhoעיכלתי λ DNA ו-10 נג ה-DNA קטע כדי 10 µL של מערכת התגובה רקומבינציה הומולוגית, דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. כדי לארוז את ה-DNA λ רקומבינציה, להוסיף 25 µL של למדא תמציות אריזה לתוך המוצר רקומבינציה, דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר מכן, להוסיף µL 25 נוספים של למדא תמציות אריזה לתוך הצינור התגובה. להמשיך דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
    3. להוסיף 500 µL מאגר דילול סטרילי (10 מ מ טריס-HCl (pH 8.3), 100 מ מ NaCl, 10 מ מ MgCl2) לתוך מערכת התגובה ומערבבים בעדינות על-ידי הפעלת הצינור למטה מספר פעמים. להוסיף 25 µL של כלורופורם, לערבב בעדינות, לאחסן ב 4 º C.
    4. להוסיף 100 µL של phage ארוז 100 µL של חיידקים LE392MP (תרבותי-0.8 - 1.0 באמצעות מדיום LB הוספה עם 10 מ מ MgSO4) לתוך צינור חדש. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
    5. להוסיף 200 µL תערובת phage-חיידק לתוך אגר oftop 4 מ"ל (LB בינוני + 0.7% אגר + 10 מ מ MgSO4, מקורר עד 48 ° C). לערבב באופן מיידי על-ידי הפעלת הצינור הפוך מספר פעמים, יוצקים אותו לתוך צלחת מראש ומחוממת (37 מעלות צלזיוס) ליברות.
    6. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לבין מסך הפלקיו λ-ARS317 באמצעות PCR וסדר.
  2. ה-DNA טיהור המצע מ11,lysates הנוזלי18
    1. בוחר הפלאק אחד לתוך µL 200 של ddH סטרילי2O עם 10 מ מ MgCl2 ו- 10 ננומטר CaCl2. מערבבים עם 200 µL של חיידקים LE392MP (בתרבית לילה במדיום ליברות), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    2. להוסיף את התערובת phage-חיידק 100 מ של NZCYM (10 גרם/ליטר NZ-אמין, 5 g/L שמרים לחלץ, 5 g/L NaCl, 1 g/L Casamino Hydrolysate, ואת 2 g/L MgSO4·7H2O) בינוני ותרבות 7 h ב- 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 250 µL של כלורופורם לתוך התרבות ומנערים עוד 10 דקות.
    3. העברת התרבות לתוך בקבוקון 200 מ. הוסף 5.8 גר' NaCl (הריכוז הסופי של 1 מ'), מערבבים כדי להמיס בעבודת יד, דגירה על קרח למשך 30 דקות.
    4. צנטריפוגה ב g x 12,000 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את שאריות תאים. לאסוף את תגובת שיקוע לתוך בקבוקון 200 מ"ל ולהוסיף 10% יתד8000 (m/V). מערבבים לפרק על ידי מכשיר מלהיב מגנטי ו דגירה על קרח במשך 30 דקות או יותר.
    5. צנטריפוגה ב g x 12,000 10 דקות ב 4 ° C, כדי לזרז את bacteriophage. הסר את תגובת שיקוע.
    6. Resuspend את התמיסה ב 2 מ"ל phage דילול המאגר. להעביר אותו לתוך צינור 15 מ"ל ולהוסיף 10 µL של RNase (הריכוז הסופי הוא µg 20/mL) µL 40 של DNase (הריכוז הסופי הוא µg 5/mL). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    7. להוסיף 2 מ"ל של 0.3 M טריס-HCl (pH 9.0), EDTA 100 מ מ + 1.25% מרחביות, µL 15 proteinase K (הריכוז הסופי הוא 10 µg/mL). דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    8. להוסיף 2 מ"ל של אשלגן טרום מקורר אצטט (3 מ', pH 4.8), דגירה הצינור על קרח למשך 10 דקות.
    9. צנטריפוגה ב 8000 g x 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את החומרים לא מסיסים.
    10. להוסיף x 0.7, כמות אלכוהול איזופרופיל לתוך תגובת שיקוע. לערבב על-ידי הפעלת הצינור הפוך מספר פעמים ולאחר תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    11. צנטריפוגה ב 8000 g x 10 דקות ב RT, כדי לזרז את הדנ א. הסר את תגובת שיקוע.
    12. לשטוף את ה-DNA, ברגע עם 70% אתנול על ידי צנטריפוגה-g 8,000 x עבור 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע.
    13. Elute ה-DNA באמצעות µL 500 טה מאגר (טריס-HCl, EDTA 1 מ מ, 10 מ מ pH 8.0) בעדינות, ולהעביר את ה-DNA לתוך צינור 1.5 מ.
    14. לחלץ את ה-DNA פעמיים באמצעות פנול: כלורופורם על ידי צנטריפוגה ב 8000 g למשך 10 דקות.
    15. לזרז עם 0.7 x נפח אלכוהול איזופרופיל. מערבבים לפנות הצינור הפוך למטה בעדינות, צנטריפוגה ב g 8,000 x 10 דקות.
    16. לשטוף פעם עם 70% אתנול, resuspend ב µL 200 של טה. למדוד את ריכוז הדנ א, ולאחסן ב-20 ° C ב- 12.5 µg aliquots.

2. λ-ARS317 דנ א Biotinylation

  1. כדי phosphorylate biotinylated oligonucleotides (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-ביוטין-3') משלימים לקצה השמאלי של ילידי λ ה-DNA, להוסיף 1 µL (100 מיקרומטר) של oligonucleotides, µL 7.5 של ddH2O, 1 µL של 10 x ליגאז מאגר 0.5 µL של T4 PNK. דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  2. Λ-ARS317 phosphorylate, להוסיף µg 12.5 של λ-ARS317, 3 µL של 10 x ליגאז מאגר, µL 1 של T4 PNK, ו- ddH2O לנפח הכולל של µL 30. דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  3. כדי anneal oligonucleotides עם λ-ARS317, להוסיף 0.5 µL של phosphorylated oligonucleotides, µL 195 ddH2O, µL 25 × 10 ליגאז מאגר לתוך הצינור λ phosphorylated-ARS317. לערבב בעדינות על ידי מתהפך לגמרי את הצינור, דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להפוך את בלוק חימום, ולתת המגניבים הדגימה כדי מתחת 33 ° C בבלוק.
  4. כדי מאתרים ומפסיקים את oligonucleotides עם λ-ARS317, להוסיף 1 µL של T4 DNA ליגאז ו µL 0.63 של ATP (200 מ מ). לערבב בעדינות על ידי מתהפך לגמרי את הצינור, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 h או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
    הערה: כדי להימנע נפרדים הדנ א, כל השלבים ערבוב צריכה להיעשות על ידי בעדינות מתהפך ברכבת התחתית, במקום במעורבב באמצעות פיפטות.

3. Coverslip וניקוי Functionalization

  1. Coverslip ניקוי
    1. מקום 20 coverslips לתוך צנצנות צביעת 4 (5 coverslips/צנצנת), sonicate במשך 30 דקות אתנול, ולשטוף את coverslips עם הנדסה גנטית H2O 3 פעמים.
    2. Sonicate במשך 30 דקות עם 1 מ' אשלגן הידרוקסידי (KOH), ולשטוף את coverslips עם הנדסה גנטית H2O 3 פעמים. חזור על אתנול וביו -KOH sonication פעם אחת.
    3. Sonicate עם אצטון במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף עם הנדסה גנטית H2O היטב (לפחות 3 פעמים).
      הערה: אצטון יש להסיר ביסודיות על ידי שטיפה בעזרת הנדסה גנטית H2O, כי זה עלול לגרום לפיצוץ כאשר הממס האורגני (כגון אצטון) מעורבב עם הפתרון פיראניה בטעות14.
    4. למקם את coverslips לתוך פיראניה פתרון (3:1 תערובת של H2אז4 ו- 30% H2O2) דגירה ב 95 ° C עבור 1 h.
      הערה: פתרון פיראניה הוא אנרגטי מאוד, סחף, לכן השתמש בזהירות. בעת הכנת פיראניה פתרון, להוסיף 50 מ של2O H2 תחילה לתוך גביע זכוכית 500 מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 150 מ ל H2אז4 לאט לתוך הספל.
    5. לשטוף את coverslips עם הנדסה גנטית H2O 5 פעמים. לאחר מכן לשטוף את כל coverslip עם הנדסה גנטית H2O ביסודיות באמצעות 3 ספלים מלאים הנדסה גנטית H2O, לייבש את coverslip באמצעות נייר מקצה coverslip. למקם את coverslip לתוך הצנצנת מכתימים ויבש את coverslip ביסודיות בתנור 110 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      1. לשטוף את coverslip עם מתנול ומניחים את הצנצנת מכתימים לתוך התנור 110 ° C שוב להתייבש היטב את coverslip.
        הערה: ייבוש ביסודיות את coverslip הוא מאוד חשוב, מכיוון APTES יש הרבה מבנים משטח אפשרי ברגע שזה בנוכחות מים19.
  2. Coverslip functionalization
    1. להוסיף 70 מ של פתרון silane (93% מתנול, 5% אצטית, ו- 2% APTES) לתוך כל צנצנת, לדפוק את הכובע ולהזמין את הצנצנת בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    2. שטוף ויבש על coverslips כפי שמתואר בשלב 3.1.5, אלא לייבש את coverslips ביסודיות באמצעות גז חנקן במקום הצבת אותם בתנור.
    3. יתמוסס 150 מ ג של mPEG (מתוקסי-פוליאתילן גליקול) ו- 6 מ ג של ביוטין-יתד (ביוטין-פוליאתילן גליקול) 1 מ"ל של 0.1 M מתוצרת טרייה NaHCO3 (pH 8.2) ביסודיות. צנטריפוגה ואז בגיל 17, g 000 x עבור 1 דקות להסיר יתדות קשי תמס.
      הערה: NaHCO טריים3 הוא מוכן; יש צורך להתאים את החומציות.
    4. מקם את coverslips silanized בתיבות והניח שני coverslips קטן על שני הקצוות של coverslips silanized. פיפטה 100 µL של פג פתרון על מרכז coverslip silanized, מקום אחר silanized coverslip על גבי.
    5. הוסף כמה הנדסה גנטית H2O בתיבה כדי לשמור את זה לח, דגירה על coverslips עם פג פתרון לפחות 3 שעות בחושך. הדגירה לילה יכול לעבוד גם כן.
    6. להפריד את זוגות coverslip תמשיך את פני השטח functionalized, לשטוף את coverslips באמצעות הנדסה גנטית H2O בהרחבה ו לייבש אותם עם גז חנקן.
    7. סמן את הצד functionalized של coverslips באחת הפינות באמצעות עט מרקר, שמור על הצד functionalized כלפי מעלה, מקם אותם בתוך קופסאות, לאחסן את הקופסאות desiccator ואקום במשך חודש.
    8. כדי לאחסן את coverslips למשך זמן ארוך יותר, מקום אחד coverslip לתוך צינור 50 מ ל קדח עם חור אחד על הכובע שלו, ואז לשים את הצינור לתוך שקית ניילון, לסגור את השקית בעזרת חותם ה ואקום. בדרך זו, coverslips שניתן לאחסן ב-20 ° C כ- 3 חודשים.

4. זרימה תא הרכבה

  1. חותכים ערוץ 15 מ"מ × 2 מ"מ במרכז של פיסת נייר-דבק כפול (30 מ"מ × 12 מ"מ) באמצעות כבטלן.
  2. לקלף הצד נייר של הקלטת דו-צדדית והדבק אותו בשקופית זכוכית עם שני חורים. לחץ כדי להסיר בועות אוויר. על סמך הניסיון שלנו, קל להסיר בועות אוויר על ידי פילינג בצד נייר מאשר הצד פלסטיק של הקלטת דו-צדדית.
  3. חתך של coverslip functionalized (60 מ"מ × 24 מ"מ) לתוך ארבע חתיכות (30 מ"מ × 12 מ"מ) באמצעות כוס יהלום שקצהו הסופר, ולהסיר את הלכלוך באמצעות גז חנקן. זכור לשמור את functionalized בצד פנים למעלה.
  4. לקלף את הצד פלסטיק של הקלטת דו-צידית, הדבקת השקופית-coverslip functionalized. לחץ בעדינות כדי להסיר בועות אוויר בין coverslip את הקלטת. הסרת בועות אוויר ביסודיות יכול להגן על התא זרימה דולף בזמן מאגרי נשאבו לתוכה.
  5. הכנס כניסת ו עודפים צינורות לתוך חורים קטנים וגדולים, בהתאמה. לתקן את הצנרת באמצעות אפוקסי.
  6. משאבה µL 20 של streptavidin (0.2 מ"ג/מ"ל) לתא זרימה באמצעות מזרק באופן ידני, דגירה-RT למשך 10 דקות. ואז לשאוב מאגר חסימה10 לתא זרימה כדי להחליף את streptavidin, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.

5. הדמיה מולקולה בודדת

  1. להשיג את היישור מוקד של אדום, מרחיקת אדום עם A5 בשקופית פלורסצנטיות מיקרוסקופ בדיקת #1 על ידי עירור בו זמנית באמצעות 532 ננומטר לייזר ו- 640 ננומטר לייזר. לייצר תמונות גל כפול עם פיצול אופטיקה (ראה טבלה של חומרים).
  2. מניחים את התא זרימה על המיקרוסקופ וחבר שלה אבובים עודפים חיבור לצנרת יותר עם קפיץ 10 מ"ל להתקין משאבת אינפוזיה אוטומטיות/גמילה לתכנות.
    הערה: שאיבה מאגרי לתוך התא זרימה המוזכרים להלן אמצעי מהאמנה מאגרי לאורך צינור כניסת התא זרימה המזרק.
  3. משאבה מאגר חסימה ב- µL 500/דקה לתוך התא זרימה כדי להוציא אוויר במהירות ולהבטיח כי המאגר בתא זרימה זו אינה חסומה. לאחר מכן לשאוב את המאגר חסימה ב- µL 200/דקה לתוך התא זרימה, הפוך לאורך צינור עודפים כדי להסיר בועות אוויר לאורך צינור כניסת והתא זרימה ביסודיות.
    הערה: כל מאגרי שאוב לתוך התא זרימה צריך להיות degassed, desiccator ואקום לפחות 15 דקות לפני השימוש.
  4. להוסיף 0.5 µL של ה-DNA λ-ARS317 biotinylated µL 80 מאגר חסימה, לנפח את זה לתוך התא הזרימה ב- µL 25/דקה למשך 2 דקות. ואז שטפי DNA λ-ARS317 באמצעות µL 200 מאגר חוסמת בקצב של µL 50/min.
  5. משאבה µL 200 של איגוד מאגר10 בקצב של 50 µL/דקה כדי להסיר את המאגר חסימה בתא זרימה.
  6. הוספת 0.2 µL של מצופים streptavidin Qdot705 (1 מיקרומטר) ו- 0.2 µL של biotinylated אורק (1.2 מיקרומטר) לתוך צינור, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. ואז להוסיף 20 µL של איגוד מאגר לתוך הצינור, ומניחים אותו על קרח. הריכוז הסופי של אורק-Qdot705 הוא כ-10 ננומטר.
  7. להוסיף 2 µL של אורק-Qdot705 (10 ננומטר), µL 1 של DTT (100 מ מ), µL 1 של ATP (200 מ מ) לתוך µL 96 איגוד המאגר. הריכוז הסופי של אורק-Qdot705 הוא 0.2 ננומטר.
  8. משאבה µL 20 של nM 0.2 אורק-Qdot705 בקצב של 10 µL/דקה לתוך התא זרימה. לשטוף החוצה של אורק-Qdot מוגזמת705 באמצעות µL 200 איגוד מאגר בקצב של µL 100/min. ואז המשאבה מאגר מחייב עם 30 nM SYTOX תפוז לתוך התא זרימה כתם DNA סובסטרטים בקצב של µL 100/min.
  9. לרגש את האות705 אורק-Qdot, SYTOX כתום צבעונית דנ א אות באמצעות 405 ננומטר לייזר ו- 532 ננומטר לייזר, בהתאמה. לצפות את האותות בו זמנית עם 100 תזרים µL/דקה באמצעות מסנן bandpass Quad-band (FF01-446/510/581/703-25) והקלט את התמונות על ידי EM-CCD עם ms 100 לכל מסגרת. לאסוף 20 אוספי תמונות מתחומים שונים.

6. ניתוח נתונים

  1. חיתוך תמונות באמצעות התוכנה פיג'י עם תוסף חדש, שהוא שונה על-ידי עצמנו בהתבסס על התוסף התמונה (OI_cut_RGBmerge) שפותח על ידי במעבדה ד ר רון העמקים באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו.
    1. לחתוך ערימה של תמונות (512 × 512 פיקסלים) לתוך שתי ערימות של תמונות (256 × 256 פיקסלים). אחד הוא 532 ננומטר לייזר תוצאה מרגשת, והשני הוא 405 ננומטר לייזר תוצאה מרגשת.
  2. תהליך 61 תמונות רציפים באמצעות פרויקט פיג'י-תמונות-ערימות-Z (בעוצמה ממוצעת).
  3. למדוד אורך הדנ א (DNAL) ואת המרחק מאתר של אורק-Qdot מחייב705 (Lאורק) על ה-DNA של הדי קשורה סוף באופן ידני.
  4. לחשב את התוצאה של Lאורק/Lהדנ א באמצעות excel, לנתח את הנתונים באמצעות שיטת האתחול מאת R, ולאחר מכן ליצור ההיסטוגרמה ובכושר הפצות לפי עקומת גאוס.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot אורק את ארס, ואנחנו נבנה לראשונה את המצע DNA λ-ARS317. קטע DNA המכיל ARS317 היה משולב לתוך Xhoאני אתר (33.5 kb) של ה-DNA λ מקורי על-ידי רקומבינציה הומולוגית (איור 1 א'). המוצר רקומבינציה נארזה באמצעות תמציות ותרבותית החלקיקי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבחון את האינטראקציה בין החלבון התווית על-ידי Qdot ה-DNA λ site-specifically ששונתה באמצעות TIRFM בתא-זרימה. הצעדים הנדרשים כוללים שינוי בייעודי לאתר של DNA המצע, דנ א biotinylation, coverslip ניקוי functionalization, זרימה-תא הכנה ואני הדמיה מולקולה בודדת. ישנן שתי נקודות מפתח יש לציין. ראשית, כל ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ד ר חסן Yardimci, Dr.Sevim Yardimci של פרנסיס קריק המכון סוג לעזור בניסויים מולקולה בודדת, ד ר דניאל Duzdevich מהמעבדה של ד ר אריק ג גרין של אוניברסיטת קולומביה, ד ר שמש Yujie באוניברסיטת פקין, ד ר צ'ן Chunlai של באוניברסיטת צינג לדיון שימושי. מחקר זה נתמך על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין 31371264, 31401059, צוות החדשנות הבינתחומי CAS ואחווה את ניוטון מתקדם (NA140085) של החברה המלכותית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNANew England BiolabsN3011Store 25 μL aliquots at -20 ºC.
XhoI enzymeThermo Fisher ScientificFD0694
Quick-fusion cloning kitBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Packaging Extracts		EpicentreMP5110Bacterial strain LE392MP
is included in this package.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10013092Any brand is acceptable.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/AAny brand is acceptable.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical worksN/AAny brand is acceptable.
NZ-amineAmrescoJ853-250G
Casamino acidsSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Magnetic stirring apparatusIKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf tubeEppendorf3012215115 mL, sterile, bulk, 500pcs
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
Biotinylated primersThermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)New England BiolabsM0202
CoverslipThermo Fisher Scientific22266882
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009259
Potassium hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetoneThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80120891sulfuric acid
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd1001121830% Hydrogen peroxide
MethanolSigma-Aldrich322415-2L
Acetic acidSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(methoxy-polyethylene glycol)		LysanmPEG-SVA-5000
biotin-PEG
(biotin-polyethylene glycol)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Vacuum desiccatorTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Vacuum sealerMAGIC SEALWP300
Diamond-tipped glass scribeELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
Glass slideSail Brand7101
Inlet tubingSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.
Outlet tubingSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.
Double-sided tapeSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpoxyLEAFTOP9005five minutes epoxy
StreptavidinSigma-AldrichS4762
Fluorescence MicroscopeOlympusIX71
Infusion/withdrawal
programmable pump		Harvard apparatus70-4504
532 nm laserCoherentSapphire-532-50
640 nm laserCoherentOBIS-640-100
EMCCD CameraAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
splitting optics		Hamamatsu photonics K.K.A12801-01
TIRF illumination systemOlympusIX2-RFAEVA2
60×TIRF objectiveOlympusAPON60XOTIRF
Quad-edge laser dichroic
beamsplitter		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Quad-band bandpass filterSemrockFF01-446/510/
581/703-25
Dichroic beamsplitterSemrockFF649-Di01-25x36
Emission filterChroma Technology CorpET585/65m
Emission filterChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConjugateThermo Fisher ScientificQ10163MPStore at 4 ºC, do not freeze.
ATPAmresco0220-25GPrepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC.
DTTAmrescoM109-5GPrepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC.

References

  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  3. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  4. Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
  5. Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
  6. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62(2014).
  7. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
  8. Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
  9. Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
  10. Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).
  11. Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
  12. Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
  13. Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
  14. Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  15. Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
  16. Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
  17. Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
  18. Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
  19. Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
  20. Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137DNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved