Caenorhabditis נפה:, מכשיר low-tech ו מתודולוגיה לצורך מיון אורגניזמים רב תאיים קטנים

Summary

בפרוטוקול הנוכחי כולל מתודולוגיה מיון וניקוי של אוכלוסיות תואם גיל Caenorhabditis elegans. הוא משתמש פשוטה, זולה, והכלי בהזמנה אישית יעילה להשגת ניסיוני אוכלוסיה גדולה של נמטודות למחקר.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא אורגניזם מודל ומבוססת נעשה שימוש במגוון של מחקר ביו-רפואי בסיסי. בתוך קהילת המחקר נמטודות, יש צורך דרך במחיר נוח ויעיל לשמור על אוכלוסיות גדולות, מתאימים לגיל של C. elegans. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה מכנית מיון וניקוי C. elegans. המטרה שלנו היא לספק תהליך חסכוני, יעיל, מהיר ופשוט לקבל בעלי חיים הגדלים אחיד, שלבי החיים לשימוש שלהם בניסויים. כלי זה, מסננת Caenorhabditis , משתמש במערכת המכסה לפי הזמנה זה חוטים אל צינורות מעבדה חרוט נפוצות וממיין C. elegans בהתאם לגודל הגוף. אנחנו גם להוכיח כי המסננת Caenorhabditis ביעילות העברת חיות של תרבות אחת צלחת מתן אפשרות נוספת עבור מיון מהיר, סנכרון וניקוי מבלי להשפיע על סמנים של בריאות, כולל תנועתיות, מתח-inducible ג'ין כתבים. כלי נגיש, חדשני זה הוא אפשרות מהיר, יעיל, ומלחיץ לשמירה על אוכלוסיות C. elegans .

Introduction

התולעת נמטודות Caenorhabditis elegans, הוא אורגניזם מודל premier. בנוסף הטבע ישיר ומבוקר של הטיפוח-תרגול במעבדה, הגנום כולו שלהם הוא ברצף¹ , גורל כל תא התפתחותית ידוע². בשל תכונות אלה, C. elegans הוא אורגניזם מודל נפוץ מחקרים גנטיים. עם זאת, יחד עם תכונות מועילות אלה באים כמה אתגרים לחוקרים. בשל מזמנם דור מהירה, C. elegans אוכלוסיות יכול לרוץ במהירות האוכל ו/או מעורב אוכלוסיות עם דורות מרובים, בשלבים התפתחותיים להציג בו-זמנית. לפיכך, ניסויים שבוצעו במדיה צמיחה נמטודות מוצק (NGM) דורשים חוקרים להעביר פיזית חיות ללוחות טרי, לפני מכלה מקור המזון חיידקי ולפתח הזחלים חדש. זה יכול להיות מייגע כמו העברת תכופים של החיות נחוצה כדי למנוע האוכלוסיות ניסיוני החל להיות מעורב עם הצאצאים דורות. ובכל זאת, ניסויים דורשים שני מספרים גדולים של בעלי חיים ושל נקודות זמן ממושך (למשל, מיצוי DNA או RNA בבגרות). זה תרכובות האתגרים של שמירה על אוכלוסיה מסונכרן באופן מדויק והעברת מספרים גדולים של בעלי חיים.

שיטות של העברת C. elegans תרבותי על NGM איסוף או לרחוץ את החיות צלחת על צלחת; כימי בטיפול החיות (למשל, עם fluorodeoxyuridine מעכב שכפול ה-DNA או FUDR); או באמצעות cytometry זרימה כדי למיין חיות לוחיות רב טוב. איסוף כרוכה בשימוש כלי יד, עשה עם חוט דק פלטינה או עפעף, להעביר באופן ידני אדם או בעלי חיים מרובים^3,4. בשיטה זו הוא מדויק אבל דורש מיומנות והן זמן והוא מגבלה על מחקרים שכללו מספר גדול של בעלי חיים. איסוף מאי גם, להיות פיזית מזיק ומלחיץ החיות במינים יחידים פוטנציאל לכמויות לא טבעי ולא עקבית של הפרעה וכוח. כביסה כרוך שטיפה לצלחת תרבות עם פתרון מאגר העברת הפתרון עם בעלי החיים דרך זכוכית פסטר פיפטה צלחת תרבות חדשה. שיטה זו מהירה ויעילה אך אינה מדויקת כמו דורות מרובים, בשלבים התפתחותיים של בעלי חיים מועברים בצובר. טיפולים כימיים, כגון FUDR, יכול להיות מומס בתקשורת culturing כדי למנוע את הייצור של הצאצאים באמצעות חסימת כל שכפול ה-DNA, וכך, פיתוח ייצור וביצה תא רבייה. בעוד יעיל, בשיטה זו יש להחיל לאחר ההבשלה התפתחותית עד כדי לא לשבש את תהליכי התפתחותי נורמלי, וזה אומר שעדיין יש דרישה להעביר את החיות לפני שלה מינהל³. שיטה זו גם השפעות מרובות הסלולר מסלולי איתות, וכתוצאה מכך מורגשת ההשפעה על החיות כשהם מזדקנים (למשל, סיומת תוחלת החיים או פרוטוסטאזיס שינו) בהתאם המתח של C. elegans בשימוש^{5, 6,7,8,9,10}. שיטות cytometry זרימה אוטומטית למיין, להעביר בודדים C. elegans לוח רב טוב אחד עוד¹¹. בעוד ששיטה זו הוא מאוד אפקטיבי ויעיל, ציוד cytometry זרימה הוא יקר and נגישים לחוקרים רבים. אלטרנטיבה העברת בעלי חיים היא להשתמש מוטציה בדגמי טמפרטורה רגיש, כגון fer-15 ו- פמ-1, אשר הופכים סטרילי עם התאמת הטמפרטורה¹². בזמן השימוש חיות מועיל במצבים מסוימים, זנים מסוימים אלו גדלים לאט יותר פראי-סוג חיות והן מסתמכות על הגנום השונה, המגישה כנציגים המסכן לתולעים הזדקנות או בריאה. בנוסף, ההסתמכות על שינוי טמפרטורה לזירוז עקרות שתוצאת גם בהיעדר סביבה סטטי, שינויי טמפרטורה הוכחו ברצון להשפיע על ג'ין ביטויים^{13,14, 15}. קבוצות מחקר בעבר פורסמו טכניקות המתאר את השימוש רשת שינוי כדי לסנן C. elegans לפי גודל¹⁶. עם זאת, היינו מסוגלים למצוא עבודה קודמות בדיקה עבור כל שינוי תוצאות בריאותיות הכוללת שעשויים להיות מזוהה עם השימוש של מסננים כאלה.

לפיכך, יש צורך בתוך קהילת המחקר C. elegans שיטה במחיר נוח, יעיל, מהיר, ו מדויק עבור העברת מספרים גדולים של בעלי חיים בין תרבות צלחות. פיתחנו כלי של שיפור, נגיש של ציוד (בשם המסננת Caenorhabditis ), פרוטוקול המשויך עבור שלה ייצור ותפעול העונים על הצרכים של קהילת המחקר C. elegans . במסמך זה, אנחנו חולקים את העיצוב של מסננת Caenorhabditis והשיטות לשימושו, נדגים את השימוש בו לא משפיע על בריאות נפוצות או כל אחד מסמני מתח כאשר לעומת איסוף ידני רגיל וטיפול עם הנפוצות, פוריות-הגבלת FUDR כימי.

Protocol

1. Caenorhabditis מסננת בנייה ושימוש

1. פרוטוקול בנייה
   1. רוכשים 2 מכסים משפופרות חרוט 50 מ ל (איור 1 א').
   2. להסיר את האזור מרכז בתוך השפה הפנימית של הכיסוי (כאשר צפו התחתון, איור 1B) באמצעות מבער בונזן, מכשיר בדיקה מתכת חמה או במלחם או דרך המקדחה.
      הערה: שימוש בחום כדי לחתוך את מכסה פלסטיק עדיפה על להב כי יש פחות סיכון של פציעה.
   3. לנקות לשייף את הקצוות לחתוך, להתעלות על פני השטח עם קובץ מעוקל או של רוטרי טחינת כלי (למשל, Dremel). ראה איור 1C.
   4. חותכים את מעגל monofilament רשת השינוי עד לקוטר המתאים (איור 1D). בשביל זה, לאתר את מכסה על גבי גיליון monofilament רשת ניילון וחותכים בתוך קו שצויר.
   5. חותכים חריצים/חתכים המשטח העליון של הכיסוי כדי לשפר את הידבקות של הכיסוי שני דבק מוחל על הפלסטיק (איור 1E).
   6. לנקות את המכסים עם אתנול ולתת להן להתייבש.
   7. דבק cyanoacrylate חלות על המשטח העליון של שני העפעפיים, שמירה על הקצה החיצוני.
      הערה: דבק קטן עובר דרך ארוכה.
   8. שכב monofilament רשת השינוי, על פי טבלה 1, על המכסה מודבק אחד (איור 1F). המקום השני המכסה הפוך על גבי רשת השינוי; מכסים שני חייב להיות מקסימום שלהם יחד. לחץ בחוזקה יחד (איור 1 ג'י). ודא רשת השינוי מתוח.
      הערה: כאמצעי בטיחות, שימוש פינצטה כדי למקם את רשת השינוי העפעפיים.
   9. לאחר השכבה הראשונית של הדבק התייבש, להחיל טבעת של דבק מגע דבק מסביב הפער החיצוני בין עפעפיו. להיות נדיב כמו זה מוסיף שלמות ומונעת כל פילינג בנפרד או דולף.
   10. תווית את המסנן עם רשת שינוי גודל הנקבוביות monofilament רשת השינוי.
       הערה: כאן, אנו משתמשים בשני גדלים נקבובית רשת — 20 מיקרומטר ו 50 מיקרומטר.
2. השתמש בפרוטוקול
   1. טרום רטוב המסננת.
      1. Pipette של תמיסת מלח, כגון M9 [5 g של NaCl, 6 גרם של נה₂HPO₄, דור 3 של ח'₂PO₄, 1 L של הנדסה גנטית H₂O ו- 1 מ"ל של MgSO₄ (1 מ')]¹⁷, דרך מרכז המסננת עד טפסים droplet , וידחוס ולאחר נוטפת את המרכז של מסנן התחתון (איור 2 א). באופן אופציונלי, החל נטולת מגבון (כגוןKimwipe) לתחתית לצורה או להפיץ droplet לחות על רשת השינוי.
      2. מניחים המסננת מעל צינור חרוטי 50 מ. לתייג את הצינור כמו 'צינור פסולת' (איור 2B).
   2. רחץ אוכלוסיה של C. elegans את צלחת אגר.
      1. לשטוף את הצלחת עם המאגר M9 ומניחים המדיום המכיל תולעת על למעלה של monofilament רשת השינוי 1 מ"ל במועד (איור 2C). הקפד לפעול במרכז של רשת השינוי. לשטוף את כל התולעים מהצלחת.
         הערה: בדרך כלל, 3 מ"ל של M9 לצלחת 60 מ מ מספיקה.
      2. כדי למזער את מספר תולעים שקוע pipetting, להשתמש כוס פסטר פיפטה כדי להזיז את התולעים רלוונטי ו על המרכז רשת (החזרה לפי הצורך).
      3. יש לשטוף את המסנן עם המאגר M9 מלמעלה. שוב, ודא פועלים במרכז של רשת השינוי ולשטוף את כל התולעים באזור זה. רחץ פעמים רבות ככל שנדרש על מנת להבטיח כי כל חיידקים, תולעים קטנות עבר דרך רשת השינוי.
   3. הקציר החיות מתאימים לגודל של המסננת.
      1. לצרף צינור חרוטי 50 מ ל העליון של המסננת, עם תולעים בוגרות מהשלב 1.2.2.3 מול הפנימי של הצינור אוסף חדש (איור דו-ממדי).
      2. הסר את הצינור הראשון (צינור פסולת) והיפוך במהירות מעל מסננת את צינור חדש כדי למנוע העברת ה-droplet (2E איור).
         הערה: אם עקרות אינה נחוצה, להשתמש נטולת מגבון (כגוןKimwipe) wick נוזל התחתון של רשת השינוי לפני היפוך.
      3. יש לשטוף את רשת השינוי עם M9 לתוך הצינור 50 מ ל חדש מן החדש על הסיפון (2F איור). שוב, פועלים במרכז רשת ולתחזק droplet על החלק התחתון של הרשת.
      4. לאפשר את התולעים להתפשר או לסובב אותם בעדינות למטה (למשל, < 16 x g) עבור 1 דקות (2G איור).
      5. וארוקן את בופר מ בגדר של תולעים, אידיאלי למטה > 0.5 מ"ל, או להסיר כל הנוזל ככל האפשר מבלי להפריע בגדר.
      6. Pipette התולעים באמצעות כוס פסטר פיפטה על גבי צלחת NGM ולתת להן להתייבש. מרחב טיפות מרובות בחוץ על צלחת חדשה אז הם להתייבש מהר יותר (איור 2 H).
   4. ניקוי המסננת.
      1. לשטוף המסננת ביסודיות ובעדינות עם אתנול וביו -אוסמוזה הפוכה מים. . תן לזה להתייבש.
      2. אחסן אותו במיכל נקי לשימוש בעתיד לא מוגדר.
      3. תבטל את זה, כאשר רשת השינוי מתפתח מראה 'סאג'.

2. אימות של Caenorhabditis ניפוי שיטת המיון

1. תחזוקה כללית
   1. עבור כל הניסויים, תרבות תולעים תולעים נימיות צמיחה מדיה סטנדרטי¹⁷ (L 1 של NGM מורכב מ 2.5 גר' peptone, 17 גרם אגר, דור 3 של NaCl, 975 מ ל מים מזוקק פעמיים, 1 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ל של CaCl 1 מ'₂ 1 מ"ל של 1 מ' MgSO₄, 25 מ של 1 מ' KHPO₄ו- 0.5 מ של סטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל) ב 25 º C.
2. מינהל טיפול ניסיוני
   1. להשוות את הטיפול שלוש הקבוצות: פיק, fluorodeoxyuridine (FUDR) ו Caenorhabditis מסננת.
      1. עבור קבוצת טיפול FUDR, להוסיף 100 מ"ג/מ"ל FUDR המדיה NGM ריכוז סופי של 100 μM כדי למנוע כל הפקה רומא, וכן להעביר את התולעים בכל יום צלחת NGM טריים כדי למנוע דלדול מזון.
      2. עבור הקבוצה לבחור, לבחור ולהעביר את התולעים באופן ידני באמצעות לולאה פלטינה.
      3. עבור קבוצת הטיפול Caenorhabditis מסננת, בצע צעד 1.2, pipette את התולעים על גבי צלחת NGM.
3. Caenorhabditis מסננת אחוז התשואה
   1. כדי לכמת את המסננת עד כמה יעיל זה-מיון C. elegans, לגדל חיות N2 גיל-סינכרונית ליום 1 של הבגרות 25 ° c (קרי, 48 שעות לאחר הנחת הביצה) ולאחר מכן להעביר אותם על-ידי בחירת אותם ללוחות NGM טריים (בהיקף של N = 50 או N = 100 בעלי חיים לכל טרה קבוצת atment).
   2. אחרי 24 שעות של התאוששות, העברת האוכלוסייה ללוחות NGM חדש עם המסננת Caenorhabditis בעקבות האמור לעיל פרוטוקול (ראה שלב 1.2), לספור את מספר בעלי החיים הועברו בהצלחה.
   3. לחשב את התשואה באחוזים כיחס של מספר בעלי חיים מועברים בהשוואה שהמספר הראשון בתחילת ההעברה מוכפלים ב- 100 (%).
4. מבחני Healthspan
   הערה: ציון הפרמטרים healthspan של הכיתה תנועתיות, קצב משאבת לועי, ו הקדמי והן התגובה המגע העדין האחורי בימים 2, 4, 6 ו- 8 של בגרות לבעלי גיל-מסונכרנות N2 ומתוחזק על 25 מעלות צלזיוס.
   1. תנועתיות מעקב
      1. להקצות תנועתיות שהתבססו על מערכת מבוסס-מחלקה (כיתות A, B ו- C) בעקבות שיטות חרנדון. et al. ¹⁸. להשוות את ההשפעות של שלוש קבוצות ניסיוני באמצעות מודל סטטיסטיקה לוגיסטיים הסודר בתוכנת ניתוח סטטיסטי.
         הערה: מדרגה ראשונה לאנשים להעביר באופן ספונטני בתבנית רגילה, sinusoidal. Class B לנוע בתנועות במידה ניכרת הלא-sinusoidal ויחידים עשויים לדרוש לדרבן ולעודד את התנועה. Class C יחידים להזיז הראש שלהם ו/או זנב בתגובה לדרבן, אך אינם מסוגלים לנוע על פני אגר.
   2. קצב משאבת לועי
      1. לספור מטחנת תנועת הנורה החיה לועי מסוף חזותית תחת stereomicroscope על 600 X הגדלה הסופי עבור 1 דקות.
      2. לערוך ניתוח סטטיסטי עם אנובה בכיוון אחד עם α = 0.05 ובדיקות Bonferroni פוסט עם α = 0.05.
   3. לגעת התגובה
      1. להקליט לתגובה המגע העדין ולהשוות בין קבוצות הטיפול שלוש. לבצע את מבחני המבוסס על שיטות מתוארת על ידי Calixto. et al. ¹⁹.
      2. הרשומה הקדמי ואת ישבנה לגעת התגובה על ידי ללטף בעדינות מכוש עפעף בניצב הזנב או בראש (5 x, מתחלפים בראש וזנב) של בעלי החיים.
      3. ציון כל תנועה בכיוון ההפוך של הקו באורך של 1 נקודה בסולם של 0 עד 5 עבור הקדמי והן התגובה האחורי.
      4. עריכת ניתוח סטטיסטי עם אנובה בכיוון אחד עם α = 0.05 ובדיקות Bonferroni פוסט עם α = 0.05.
5. פוריות assay
   1. כדי לקבוע את השימוש של המסננת Caenorhabditis ההשפעה על רבייה, לגדל חיות N2 גיל-סינכרונית ליום 2 של הבגרות ב 25 º C.
   2. h 60 לאחר ביצה שכב, להעביר חיות לוחיות הרישוי NGM עם מעדר פלטינה או מסננת Caenorhabditis ולתת להם 4 שעות להתאושש (לייבש את הצלחות sieved למשך 20-30 דקות).
   3. לאחר התאוששות, בנפרד צלחת החיות באמצעות עפעף לבחור NGM צלחות, לתת להם 24 שעות להטיל ביצים, ולהסיר את החיות. לאפשר הוא צאצא שהלוח לפתח בתנאים רגילים 25 ° c עבור עוד 24 שעות ביממה.
      הערה: מכוש עפעף היא עפעף האנושי מאובטחות לסוף פיפטה פסטר עם לק ולא מעוקר עם אתנול.
   4. לספור את מספר יחידים בדור F1 קיימא. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן T של α = 0.05.
      הערה: הצאצאים קיימא נחשבים ביצים בהצלחה לבקוע, מתחילים את הפיתוח שלהם דרך מחזורי הזחל קבוע.
6. מבחני התגובה מתח כתב פלורסנט
   1. לבצע שלושה מבחני כתב פלורסנט נפוץ כדי לזהות סמנים פוטנציאלי של מתח: התקה הדף היומי-16::GFP לתוך הגרעינים של תאים ב- זן [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]²⁰; ביטוי hsp-16.2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]²¹; ביטוי השתילות-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]²².
   2. עבור כל assay, תרבות בעלי חיים גיל-סינכרונית מקבוצות הטיפול שלוש ב- 20 ° C ולבחון אותם בכל יום 3 של בגרות: להשתמש בפקד שלילי (על בסיס יומי, העברת קבוצת בעלי חיים באופן ידני עם מעדר פלטינה), פקד חיובי (על בסיס יומי העברת קבוצת בעלי חיים באופן ידני עם מעדר פלטינה פלוס של הלחץ הוקמה), ואת המסננת Caenorhabditis (להעביר את החיות דרך המסננת, לאפשר להם לשחזר למשך 30 דקות על NGM לפני הדמיה).
   3. ב וזמינותו הדף היומי-16::GFP, חום לחשמל החיות בקרה חיובית של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הדמיה²⁰. עבור hsp-16.2 וזמינותו, חום לזעזע את החיות בקרה חיובית במשך 90 דקות, 20 h לפני הדמיה²¹. עבור וזמינותו השתילות-3, מטפלים החיות בקרה חיובית עם 100 מ מ paraquat במשך 4 שעות לפני הדמיה²².
   4. לקצור את התולעים מיד עם דוקרן עפעף והר אותם coverslip עם μL 1 של 36% poloxamer 407 חומרים פעילי שטח פתרון על מנת לשתק את התולעים.
   5. כריך תולעים נטען עם coverslip אחרת. הר על coverslips שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילה, התמונה התולעים באמצעות של 8 X הגדלה במיקרוסקופ פלורסנט הפוכה (עבור רמת ההגדלה הכוללת של 80 X) וחשיפה מתמדת עם מסנן FITC.
   6. כדי לזהות את כל ההבדלים בין הקבוצות שלוש וזמינותו הדף היומי-16::GFP, לסווג את החיות בהתבסס על המיקום של הכתב הדף היומי-16::GFP (גרעינית אם הכתב translocated את הגרעינים, cytosolic אם הכתב נמצא ציטוזול, ואם ביניים הכתבת ממוקם הגרעינים והן ציטוזול).
   7. להשוות את התוצאות תוך שימוש מודל סטטיסטי סידורי הלוגיסטיקה בתוכנת ניתוח סטטיסטי. Hsp-16.2 ומבחני את הביטוי השתילות-3, להשתמש חד-כיווני אנובה עם α = 0.05 ובדיקות של Tukey פוסט הוק עם α = 0.05 כדי להשוות את קרינה פלואורסצנטית הכולל של אזור הראש.

תוצאות

המסננת Caenorhabditis מורכב 2 מזרקי וואקום, אבטחת אזור של ניילון ארוגים monofilament רשת שינוי קטן יותר מקוטר גוף העידן ההתפתחותי הרצוי, השתמשו כדי לחלץ אוכלוסיות בשידור חי של אורגניזמים בטכניקה פשוטה כביסה. זה מייחסת צינורות תקן חרוטיים ומשתמש המסך רשת שינוי כדי למיין באופן מכנ...

Discussion

במסמך זה, הצגנו את העיצוב ואת השימוש של המסננת Caenorhabditis נגיש, יעיל ככלי מיון ולשמירה על C. elegans. כלי זה יש מספר יתרונות לבחירת חיות בודדות, שטיפת אוכלוסיות, טיפולים כימיים (למשל, FUDR) ושיטות יקר יותר מחיות הפרדת באופן ידני. קודם כל, Caenorhabditis ניפוי ביעילות ובמהירות (פחות מ- 20 דקו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safety glasses	Uline	S-21076
Protective heat resistant glove	Grainger	Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube	Falcon	14-432-22
Synthetic Nylon mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd	NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue	Scotch Super Glue Liquid	SAD114
Pliers	Vampliers	VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file	Lowe's	Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR	Sigma	F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)	Sigma	S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)	BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)	BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Paraquat dichloride hydrate	Sigma	36541
Inverted fluorescence microscope	Olympus	FSX100