הזיהוי של פרומונים ים עגולי הפה באמצעות מונחה Bioassay Fractionation

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד ולאפיין את המבנה, חוש הריח, והכוחות תגובה התנהגותית של תרכובות פרומון בשם של הים lampreys.

Abstract

Fractionation מונחה bioassay היא גישת איטרטיבי העושה את התוצאות של bioassays פיזיולוגיים והתנהגותיים להנחות את בידוד וזיהוי של תרכובת פרומון פעיל. שיטה זו הובילה אפיון אותות כימיים מוצלחת שהפונקציה כמו פרומונים במגוון רחב של מיני בעלי חיים. Lampreys ים מסתמכים על חוש הריח לזיהוי פרומונים המתווכות תגובות התנהגותיות או פיזיולוגיים. אנו משתמשים בידע הזה לביולוגיה דגים להניח פונקציות של פרומונים בשם להנחות את בידוד וזיהוי מרכיבים פעילים פרומון. כרומטוגרפיה משמש כדי לחלץ, לרכז, ולהפריד בין תרכובות מהמים ממוזגים. הקלטות אלקטרו-olfactogram (EOG) נערכים כדי לקבוע אילו שברים להפיק תגובות חוש הריח. מבחני התנהגות שני-בחירה מבוך משמשות לאחר מכן לקבוע אם כל אחד השברים מדיף גם פעילים בהתנהגותו, זירוז העדפה. שיטות ספקטרוסקופיות spectrometric לספק את משקל מולקולרי ואת המידע המבני כדי לסייע עם מבנה הבהרה. Bioactivity של תרכובות טהור הוא אישר עם EOG, מבחני התנהגות. התגובות ההתנהגות שנצפתה במבוך בסופו של דבר לאמת באווירה שדה כדי לאשר את תפקידם בסביבה טבעית זרם. אלה bioassays לשחק תפקיד כפול 1) להנחות את התהליך fractionation, 2) לאשר ולהגדיר עוד יותר את bioactivity של רכיבים מבודדים. כאן, אנחנו מדווחים התוצאות נציג של מזהה פרומון ים עגולי הפה המדגימים את התועלת של הגישה מונחה bioassay fractionation. הזיהוי של פרומונים עגולי הפה ים חשוב במיוחד כי אפנון של מערכת התקשורת שלו פרומון הוא בין האפשרויות נחשב לשלוט הצלופח ים פולשנית של האגמים הגדולים רודכב. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות לאפיין את התקשורת הכימית במגוון רחב של taxa, לשפוך אור על waterborne. אקולוגיה כימית.

Introduction

פרומונים הם אותות כימיים מסוימים שפורסמו על ידי יחידים שמסייע להם באיתור מקורות המזון, זיהוי טורפים, מתווכים אינטראקציות חברתיות של בני מינו¹. פרומון בתקשורת חרקים כבר למד היטב²; עם זאת, זיהוי כימי והתפקוד הביולוגי של פרומונים חוליות ימיים לא נחקרו בהרחבה. ניתן להחיל זהות וידע תפקוד הפרומונים שוחרר כדי להקל על ההתאוששות של מינים מאוימים^3,4 או בקרת מזיקים מינים^5,6. היישום של טכניקות אלה מחייבת את בידוד ואפיון של רכיבי ביואקטיביות פרומון.

זיהוי פרומון הוא ענף הכימיה מוצר טבעי. התקדמות במחקר פרומון הוגבלה חלקית בשל אופיו של מולקולות פרומון עצמם. פרומונים הן לעיתים קרובות לא יציב, המשוחררים בכמויות קטנות, רק כמה טכניקות דגימה קיימת כדי לזהות כמויות זעירות של נדיפות^7,8 או תרכובות מסיסים במים⁹. גישות לזיהוי פרומונים כוללים 1) הקרנה יישוב של תרכובות ידועות, גליקומיקס 2) ו- fractionation 3) bioassay מונחה. הקרנה יישוב תרכובות ידועות בדיקות תוצרי חילוף החומרים זמינים מסחרית של תהליכים פיזיולוגיים המשוערות לתפקד כמו פרומונים. גישה זו היא הגבלת כי החוקרים בודק רק תרכובות ידוע וזמין. עם זאת, זה הביא זיהוי מוצלח של הורמוני מין אצל דגי זהב שהפונקציה כמו פרומונים^10,11,12. גליקומיקס היא גישה זיהוי פרומון השני המבדיל מוצרים מטבולית פוטנציאלי של מולקולה קטנה בתוך המערכת הביולוגית¹³. השוואה של פרופילים מטבולית של שתי קבוצות (כלומר, פעיל נגד תמצית לא פעילים) מאפשר זיהוי פרופיל מטבולי הפוטנציאלי מ אשר מטבוליט מטוהרים, הובהר המבנה, ואת bioactivity הוא אישר¹⁴. אפקטים מוספים או סינרגטי של ניסוחים מורכבים של תערובות מסוים נוטים יותר להיות מזוהה עם גליקומיקס מכיוון מטבוליטים נחשבים ביחד ולא כסדרה של שברים¹³. ובכל זאת, המימוש של מטבולומיקס מסתמך על הזמינות של הפניות סינתטי כי הנתונים המתקבלים לא להקל על הבהרה של מבנים חדשניים.

Fractionation מונחה bioassay היא גישה משולבת, איטרטיבי המתפרס על שני שדות: כימיה וביולוגיה. גישה זו משתמשת בתוצאות של bioassays פיזיולוגיים והתנהגותיים להנחות את בידוד וזיהוי של תרכובת פרומון פעיל. תמצית גולמי fractionated באמצעות מאפיין כימי (כלומר, גודל מולקולרי, קוטביות, וכו '), נבדק עם הקלטות אלקטרו-olfactogram (EOG) ו/או של bioassay. Bioactive הרכיבים מוקרנים מאת לחזור על השלבים של fractionation ו- EOGs ו/או bioassays. המבנים של חומרים פעילים טהורים הם הובהר על ידי שיטות ספקטרוסקופיות ו spectrometric, אשר מספקים את משקל מולקולרי ומידע המבנית לייצר תבנית של המתחם להיות מסונתז. Fractionation מונחה bioassay יכולות להניב מטבוליטים מגוונים, פרומונים שעשויות להיות הרומן עם שלדים כימי ייחודי כי צפויים להיות החזוי של המסלולים biosynthetic הוחלף נגזר.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול fractionation מונחה bioassay נהגו לבודד לאפיין את bioactivity של תרכובות פרומון מין זכר עגולי הפה לים. הצלופח ים (Petromyzon מרינוס) הוא מודל חוליות אידיאלי ללמוד תקשורת פרומון כי דגים אלו יסתמכו על חוש הריח זיהוי סימנים כימיים לתווך ההיסטוריה החיים anadromous שלהם מורכבת משלושה שלבים ברורים: הזחלים, לנוער, למבוגרים. עגולי הפה ים הזחלים מתחפרים סחף בגדות נחלים, לעבור שינוי דרסטי של, להפוך קטינים זה להגר לאגם או אוקיינוס שבו הם הדורות דגים גדולים המארח. לאחר ניתוק מן הדגים המארח, המבוגרים נודדים בחזרה אל נחלים ההשרצה, בהדרכת את הפרומונים נודדות שפורסמו על ידי זרם תושב הזחלים^{15,16,17,18,19} . זכרים בוגרים ascend לשטח ההשרצה, שחרור של פרומון המין רב רכיבים כדי למשוך חברים, להשריץ לסירוגין במשך כשבוע, זיווה,^15,20. הזיהוי של פרומונים עגולי הפה ים חשוב כי אפנון של מערכת תקשורת פרומון הוא בין האפשרויות נחשב כדי לשלוט על lampreys ים פולשנית האגמים הגדולים רודכב²¹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת מישיגן (AUF # 03/14-054-00 ו 02/17-031-00).

1. אוסף והפקת ים עגולי הפה ממוזגים מים

1. מקום בוגר מינית lampreys ים הגברי (בעלי חיים של 15-30) במיכל שסופק עם 250 לליטר מים ימת יורון קצף ומתוחזק על 16-18 מעלות צלזיוס.
2. איסוף המים ממוזגים זכר לאורך כל לילה מיוני עד יולי.
   הערה: lampreys ים מתים באופן טבעי לאחר ההשרצה. אם דג מתקרבת נקודה זו בחייו, להחליף אותו זכר בוגר טרי.
3. לחלץ את המים ממוזגים על-ידי מיצוי מעבדתי.
   1. להשרות את השרף מתנול במשך 4 שעות לפני טעינתו לעמודה. לטעון השרף לתוך העמודה ולאחר מכן לשאוב אני 10 ליטר מים באמצעות המדור לחסל את הממס האורגני.
   2. עוברים המים ממוזגים ממיכל מחזיק את הדגים באמצעות מערכת שאיבה לחלק העליון של העמודה. המים עובר דרך מצע 2 ק ג של שרף בינוני קוטבי פולימריים-יונים (למשל., Amberlite XAD-7 HP שרף), הכלולים בסדרה של ארבעה 2.5 L בקיבולת זכוכית עמודות. לשמור על עומס במהירויות בין 400 ל 600 מ ל/6 מינימלית Elute המטבוליטים עם L 10 של מתנול כשמיד 5 L של אצטון.
      התראה: שלב זה משתמש מתנול, אצטון. שניהם נמצאים דליק ולא רעילים.
      הערה: ניתן לאחסן השארית במאגר ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף.
4. הפעל מחדש את העמודה לאחר שבוע 1 העשרה על ידי שטיפה עם מים (כ- 10 ליטר).
5. להסיר את הממס האורגני (התערובת של מתנול ומים) ולקצור את התמצית על ידי אידוי על כל ההזמנות עבור 5 שעות תחת לחץ מופחת (300 מתחת mbar) ב- 40 מעלות צלזיוס. לרכז את שאריות המים על ידי הקפאת lyophilization מייבש במשך 48 שעות ב-20 ° C עד יבש.

2. בידוד של שבר בריכות עם כרומטוגרפיה

1. משרים ג'ל סיליקה (mesh 230-400) בשלב הראשוני ניידים עבור 30 דקות העברת את הג'ל עם הממס (השעיה) בעמודה זכוכית. . פתח את הברז של העמודה כדי לאפשר את שלב ניידים לעבור לאפשר את לזרז ויוצרים מיטה סיליקה ג'ל סיליקה ג'ל.
2. מערבבים את תמציות עם סיליקה ג'ל (70-230 mesh) ביסודיות ולטעון אותן לתוך העמודה כרומטוגרפיה נוזלית מעל המיטה סיליקה ג'ל. Elute אותם במילוי הדרגתי מ 95% CHCl₃ (כלורופורם) / MeOH (מתנול) ל- 100% MeOH, 2.5 L בהנפח הכולל. לאסוף את eluent ב בודדים בקבוקונים (כל 10 מ"ל).
   זהירות: ההרדמה בשימוש בשלב זה היא ארסיים ריאגנט.
3. מדריך איגום של eluents לתוך שברים 20 על ידי ניתוח כרומטוגרפיה (TLC) שכבה דקה.
   1. לבצע את הניסוי TLC על צלחות מראש מצופה סיליקה ג'ל על-ידי החלת המדגם על קו הזינוק הטבעית לקו הזינוק של הצלחת בממיסים המתפתח (לבחור את הקוטביות על ידי היחס של CHCl₃ מתנול מ 100-0%) בכוס אטום טנק.
   2. בחר את היחס של פיתוח הממס כדי להפוך כל TLC נקודות עם גורם השמירה (R_f) החל 0.3 - 0.8.
   3. לאחר הממס המתפתח מגיע לקו סיום, לוקח את הצלחת לצאת מהבריכה, לחכות 10 דקות לחומר עד להתאדות.
   4. לדמיין את הנקודות קודם תחת אולטרא סגול 254 ננומטר, כתם אז להם על ידי התזת להם פתרון מתנול חומצי של 5% anisaldehyde (20 μL) על ידי ריסוס כרומטוגרפיה וחימום אותם ב 85 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
      הערה: כתמים צבעוניים על הצלחת TLC מציינים המרכיב העיקרי של השבר.
   5. לשלב את eluent כדי 20 שברים מבוסס על צבע הספוט את הדמיון_f R של המרכיב העיקרי.
4. לרכז את השבר כדי משקע אידוי על כל ההזמנות תחת לחץ מופחת (300 mbar לפי המאפיין של ממיסים) ב 40 מעלות צלזיוס במשך כ 30 דקות.

3. אלקטרו-olfactogram (EOG) הקלטות כדי לזהות שברים מדיף/תרכובות

1. משוך נימים זכוכית בורוסיליקט (הקוטר החיצוני: 1.5 mm; הקוטר הפנימי: 0.86 מ מ; אורך: 100 מ"מ) עם micropipette פולר עם רמת החימום מוגדר כ- 65.
2. ציון ואז הפתח בקצה נים כלי לחיתוך זכוכית שקצהו יהלום ואז למלא אותו אגר מותכת 0.4% ב- saline 0.9%. הפתח בקצה נימי צריך להיות כ-10 מיקרומטר בקוטר.
3. מילוי האלקטרודות נימי משך מן השלבים 3.1 3.2 ומחזיקים אלקטרודות solid-state ואלמנטים טרומיים עם כדורי Ag/AgCl (ראה טבלה של חומרים) עם 3 מ' באמצעות micropipette של אשלגן כלורי.
   הערה: לסלק כל בועות האוויר את נימי או מחזיק האלקטרודה.
4. הכנס האלקטרודות משך מחזיקי אלקטרודה.
5. להכין 100 מ של 10^-5 M L-ארגנין במים מסוננים פחם 10^-2 M L-ארגנין מניות פתרון במים יונים (מאוחסן ב 4 ° C) בבקבוקון הנפחי. העברה 20 מיליליטר 10^-5 M L-ארגנין כדי בקבוקון זכוכית.
6. על עקומת ריכוז-תגובה, להכין 10 מ"ל של דילולים 10-fold הבריכות שבר מהשלב 2.3 בצלוחיות זכוכית. להכין דילולים טריים מדי יום לפני הניסויים ולהשתמש בהם תוך יום. לשים הבקבוקונים זכוכית של פתרונות עבודה של L-ארגנין ו דילולים בריכה של שבר בתוך אמבט מים recirculating כדי לאפשר לטמפרטורה equilibrate ל 8 מעלות צלזיוס.
7. עזים ומתנגד הצלופח עם אסתר אתיל חומצה 3-aminobenzoic (MS222; 100 מ ג/ליטר), לשתק אותו עם זריקה תוך שרירית של gallamine triethiodide (3 מ"ג/ק"ג משקל גוף, ב- saline 0.9%) בעזרת מזרק סטרילי.
   הערה: מספיק לעומק של ההרדמה נקבע על ידי התבוננות אין תנועה גיל, חוסר היכולת לשמור על תנוחה זקופה ולאחר חותינ לצדדים של הטנק באמצעות דיסק דרך הפה שלה. כדי למזער כל זיהום מיקרוביאלי לפני ובמהלך הניתוח, ללבוש כפפות סטריליות ומשרים בכלי ניתוח ב-70% אתנול (v: v) במים יונים לפחות 10 דקות לפני השימוש.
8. אוריינט הצלופח anesthetized ב עמדה בצורת V, לעטוף את זה עם מגבת נייר רטובה כדי למנוע לייבוש.
   הערה: אינם מפריעים הפתחים גיל.
9. הכנס שפופרת של צואה קצף מים המכילים 50 מ"ג/ליטר של MS222 לתוך חלל הפה, להתאים את קצב הזרימה ולהבטיח כי המים הוא יציאה דרך הפתחים גיל ברציפות להשקיית הזימים.
10. שימוש בסיסמה האזמל סטרילי מלקחיים [תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי בהגדלה גדולה-X 1.25 (ראה טבלה של חומרים)] כדי להסיר מקטע² 5 מ מ של העור על פני השטח של הקפסולה חוש הריח לחשוף האפיתל חוש הריח.
11. לשטוף את הצנרור משלוח odorant עם מים מסוננים וחבר אותו לשסתום רכוב על micromanipulator. למקם את צינור קפילרי משלוח odorant לתוך חלל אפיתל חוש הריח באמצעות micromanipulator להעביר מים מסוננים האפיתל חוש הריח כדי למנוע לייבוש כאשר לא ניהול odorants.
12. הר האלקטרודות הקלטה של התייחסות-micromanipulators. להוריד את האלקטרודה הפניה על העור החיצוני ליד naris. באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי (1.25 X), נמוך האלקטרודה הקלטה בקושי לגעת השטח של האפיתל חוש הריח.
13. העבר את ספיגת של הצינור משלוח odorant מן המים רקע מסונן הפתרון L-ארגנין 10^-5 מ'.
14. הפעל את המחשב, מגבר (מוגדר למצב DC), מסנן ולאחר מכן digitizer. באמצעות תוכנת מנהל ההתקן שסתום, לתכנת את ההליך כדי לנהל דופק 4 של יחידה s של odorant על-ידי סימון התיבה של T1, קביעת T 4 s ובדיקת התיבה של T2.
15. בתוכנה רכישת נתונים (ראה טבלה של חומרים), להגדיר את מצב רכישה כ אוסצילוסקופ במהירות גבוהה, לחץ על הסמל ' הפעל ' ולאחר מכן לחץ על התחל במנהל ההתקן שסתום להזניק את הדופק odorant.
    הערה: התוכנה רכישת נתונים באופן אוטומטי רשומות של משרעת התגובה EOG דיפרנציאלי עבור 20 s (3 s בעבר, 4 s במהלך הדופק odorant 13 s לאחר מכן). להשתמש את micromanipulator כדי לתמרן את העמדות של הקלטה אלקטרודה, אלקטרודה הפניה או odorant משלוח צינור כדי להגדיל את יחס אות לרעש עם מענה מרבי תקן L-ארגנין, תגובה מינימלית (בקרה הריק מים מסוננים). פרוק המגבר על ידי מיתוג את המתג מגבר AC-DC ל- GND בעת הזזת האלקטרודות.
16. להקליט את הפקד ריק, L-ארגנין, וריחנים אז את מוכנה בשלב 3.6 מ נמוך כדי ריכוזים גבוהים עם סומק 2 דקות מים מסוננים בין יישומים.
17. לאחר הקלטת התגובות כל odorants להיבדק, קרקע המגבר ומשכו בקפידה את אלקטרודות ו- odorant משלוח צינור קפילרי. הבאים שאושרו אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) השיטות, על הסיום של הניסוי EOG, המתת חסד הצלופח anesthetized עם מנת יתר של MS222 (1 g/L).
    הערה: ודא המתת חסד מוצלחת מאת וציין את חוסר תנועה גיל הדופק לפחות 5 דקות ואחריו pithing המוח.
18. לנתח, להתוות נתונים באמצעות ניתוח תוכנה. לקבוע סף גילוי של odorants²² לזהות בשברים מדיף להפיק תגובות יותר הפקד ריק מים. הבריכות שבר זה להפיק תגובות חוש הריח תלויי-ריכוז שונים מאשר הפקד ריק מים ואז נבדקים וזמינותו התנהגותית (שלב 4).

4. הבחירה השנייה מבוך Bioassay התנהגותית כדי לזהות שברים/חומרים פעילים בהתנהגותו

1. חבל הצלופח ים נקבה בוגרת מינית בכלוב שחרור במבוך (ראה איור משלים 1) עבור 5 דק לשמור על קצב הזרימה של המים בנהר בתוך המבוך
   הערה: המבוך בנוי מידות 6.5 מ' אורך ו- 1.2 מ' רוחב, כיתה ימיים עם הציפוי עץ עם מחיצה 2.7 מ' אורך כדי להפריד את המבוך לתוך שני ערוצים בסוף במעלה הזרם. מים היא זמנית מופנת במבוך. עומק המים צריך להישמר 0.19 m ואת המהירות צריכה להישמר m/s 0.07 ± 0.01.
2. לשחרר את הצלופח ים ולהקליט את כמות מצטברת בזמן הצלופח נמצא ניסיוני וערוץ שליטה כל נהר המכיל מים למשך 10 דקות.
   הערה: אם הצלופח ים נכשל להזין את ניסיוני ולשלוט ערוץ במשך לפחות 10 s בתקופה זו 10 דקות ', בסוף המשפט, זה מעיד על חוסר פעילות או הצדדי החזק הטיה.
3. להחיל את הגירוי מבחן (קרי, פרומון בשם-10^-12 מ' מומס במים מתנול/יונים 50%) בערוץ ניסיוני מוקצות באופן אקראי, את כלי הרכב (50% מים מתנול/יונים) ערוץ הבקרה באמצעות ממברנות משאבות במחירים קבועים של 200 mL/min במשך 5 דקות.
   הערה: זיהוי סף הריכוז של הגירוי הבדיקה כפי שנקבע עם ההקלטות אלקטרו-olfactogram צריכה לשמש את הריכוז ההתחלתי עבור הבדיקה התנהגותית.
4. להחיל את הגירוי הבדיקה ועל הרכב 10 דקות נוספות ולהקליט את כמות הזמן מבלה את הצלופח המצטבר ב- ניסיוני ערוץ הבקרה.
5. לרוקן את המבוך עם מים למשך 10 דקות לפני תחילת המשפט הבא. חזור על שלבים 4.1-4.4 עם lampreys לפחות 7 אם מספיק גירוי הבדיקה זמין.
6. לחשב אינדקס של העדפה²² בכל ניסוי והערכת החשיבות באמצעות מבחן דרגה חתם Wilcoxon.
   הערה: המדד התוצאה מספר בודד יכול להיות חיובי או שלילי. ערך חיובי של המדד של העדפה מציין משיכה, ואילו ערך שלילי של מדד שבמרבית אינדיקציות העדפה. אם האינדקס של העדפה משמעותית שונה מאפס, נחשבת השבר הפעילים.
   
   כאן,
   B_c = הזמן המושקע על ידי הצלופח מבחן בערוץ הבקרה לפני יישום ה-odorant,
   B_e = הזמן המושקע של הערוץ ניסיוני לפני יישום ה-odorant,
   _C = הזמן המושקע של ערוץ הבקרה לאחר יישום ה-odorant, ו
   _E = הזמן המושקע של הערוץ ניסיוני לאחר היישום odorant.

5. כרומטוגרפי בידוד של תרכובות טהור מפני שברים פעילים

1. חזור על שלבים 2.1 2.4 עם הבריכות שבר זה זירוז תגובות חוש הריח (שלב 3) וירתקו את תגובות התנהגותיות (שלב 4).
2. בהמשך לטהר השברים הפעילים למתחמים עם גודל הוצאת גזים באמצעות עמודה ספדקס LH-20.
   1. הכנת המדגם ב- 0.5 מ"ל בשלב הראשוני נייד [CHCl₃- MeOH (1:1) או MeOH 100%], לטעון לתוך העמודה התואמת CHCl₃- MeOH (1:1) בעמודה ולאחר מכן בעמודה MeOH (100%) ו- elute אותם להניב תרכובות.

6. מבנה הבהרה של תרכובת טהורה עם ספקטרומטר מסה (MS), תהודה מגנטית גרעינית (NMR)

1. ו לדלל את המתחם מטוהרים בשלב הראשוני ניידים (בדרך כלל, מתנול כדי מים, 1:1, v: v) ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) כדי ליצור פתרון μL 10 של 1 μg/mL.
   1. להעביר את הפתרון מדגם HPLC בקבוקונים ולהגדיר אותם לתוך תעשיה של HPLC. להזריק את הדגימה (10 μL) לתוך ספקטרומטר מסה יינון (ESIMS) ספקטרומטריית electrospray והקלטה ברזולוציה גבוהה ספקטרומטריית electrospray יינון ספקטרומטר מסה (HRESIMS) ספקטרום באמצעות ספקטרומטר מסה של כרומטוגרפיה²³.
2. לחזות את הנוסחה המולקולרית לפי מסד הנתונים בתוכנה ספקטרומטר מסה (ראה טבלה של חומרים)²⁴.
   1. פתח את chromatogram של המדגם מוזרק, לקבל ספקטרום המונית שלו על-ידי בחירת הפסגה כרומטוגרפי.
   2. קלט המסה נמדד יון (מ/z) לערך (4 ספרות עשרוניות) בהרכב אלמנטלים תחת המודול הכלי . להגדיר את הפרמטר סובלנות לפפ < 5.
   3. כוונן את הפרמטרים סמל להתאמת הרכב אלמנט של המולקולה נמדד. התוכנה יוצרת חיזוי של נוסחה מולקולרית מבוסס על ניתוח המוני יחיד.
3. בחר את ממיסים deuterated (600 μL, CH-אה -₃-d-₄ או דימתיל סולפוקסיד -ד₆) לפי פרוטוקול²⁵ כדי להמיס את הדגימות.
   1. נמסים לחלוטין על מדגם ממיסים deuterated שנבחר כדי ליצור פתרון עם ריכוז ועד כ 0.1 10 מ"ג/מ"ל. להעביר את הפתרון מדגם לתוך צינור NMR כדי להקליט את D 1 (¹H, ¹³ג) ו- 2D NMR [¹H -¹H המתאם ספקטרוסקופיה (COSY), heteronuclear יחיד קוהרנטיות קוונטית (HSQC), heteronuclear מרובים המתאם בונד (HMBC)] ספקטרה על 900 מגה-הרץ NMR ספקטרומטר²⁶.
4. מקום ברכבת התחתית NMR עם הדגימה בתוך הטורבינה ספינר. השתמש מד עומק כדי להבטיח שגובה מדגם הוא באמצע החלון מדידה. לפתוח את התוכנה NMR (ראה טבלה של חומרים), ולחץ על הלחצן ' להרים ' כדי לשנות את הדוגמה של המגנט.
   הערה: החזק יד מעל החלק העליון של המגנט להרגיש את הגז מגיע מהחלק העליון של המגנט. במקביל, צליל whistling צריך להיות נשמעים.
5. בעדינות מניחים את הדגימה על כרית אוויר על גבי המגנט, לחצו על הכפתור להרים שוב לרדת המדגם לתוך המגנט NMR.
   הערה: הקשיבו רעש "לחץ" לציין שהדגימה היא בתנוחה הנכונה.
6. ליצור dataset חדש ולטעון הפרמטרים של ברירת המחדל המומלץ על ידי המכשיר NMR (ראה טבלה של חומרים).
   1. הקלד "נעילה" כדי להפעיל את הליך נעילה אוטומטי ולבחור הממס בדף בקשה.
   2. להתאמות, לוח לשנות, להתאים את לחצן הנעילה במודל, להתאים את הסמן על הלוח לשנות, לנעול את המגנט שוב.
   3. על הבקשה Atma דף, להתאים את הפרמטר בחלונית ' לשנות ' להליך כוונון, אשר עשוי להימשך דקות אחדות. המתן עד כוונון השלמת כדי להמשיך.
   4. הפעל את השגרה shimming אוטומטית על-ידי הקלדת "topshim" בשורת. לחכות עד shimming השלמת כדי להמשיך.
   5. סוג "rga" כדי להגדיר אוטומטית קבלת התאמות לרווח, אז סוג "d1" כדי להגדיר ההשהיה בין פולסים, אז סוג "zg" כדי להתחיל את הרכישה, המתן עד להשלמת הרכישה.
   6. הקלד "ef" או "efp" כדי לעבד את הנתונים ולאחר מכן הקלד "apk" עבור אוטומטי בהדרגה. לעבד את הנתונים על תוכנת עיבוד NMR.
7. להבהיר את מבנה כימי על ידי פרשנות של ניתוח הנתונים NMR.
8. לספור את האותות פחמן בספקטרום ¹³C NMR. בחר את הנוסחה המולקולרית תואמים התוצאה החזוי ספקטרומטריית ברזולוציה גבוהה (HR-MS).
9. לשלב את האותות פרוטון בספקטרום H NMR ¹והקצה הקישוריות של פחמן פרוטון מבוססות על האותות בספקטרום HSQC.
10. להקצות הקישוריות של השלד פחמן בהתבסס על מתאמים ¹H -¹H נעימים HMBC הספקטרום.
11. באופן לא סופי להקצות את המבנה הכימי מבוסס על מבנה הרציונל²⁷. חיפוש מבנה סופי במסדי הנתונים המבנה הכימי. להשוות את מבנה סופי עם אנלוגים בהפניות.
12. הקצה את תצורת יחסי עם הקשת ספקטרוסקופיה אפקט Overhauser הגרעין (NOESY).
    הערה: מאז מאפייני הזהות enantiomers המוצג על מסות ואת שיטות ספקטרוסקופיות זהים, התצורה המוחלטת של תרכובות מסוימות, במיוחד אלה עם 2'-אלכוהול ו 2'-NH₂, חייב להיקבע עם תגובה derivatization. לאחר התגובה derivatization, ההבדלים הצביעו על הספקטרום להקל את ההקצאה חד-משמעית של התצורות מוחלטת של תרכובות רוב²⁸.

7. EOG Bioassay לאשר תרכובות טהורה הם מדיף ופעיל בהתנהגותו

1. חזור על שלבים 3.1-3.5.
2. על עקומת ריכוז-תגובה, להכין 10 מ"ל של דילולים 10-fold של תרכובות טהור מ 10^-6 מ' - 10^-13 מ' של 10^-3 מ' פרומון פתרון מניות ב- 50% מתנול/מים מאוחסן ב-20 ° C מבוסס על משקל מולקולרי נקבע שלב 6.2. לשים את הבקבוקונים זכוכית עם פתרונות עבודה של L-ארגנין ותרכובות טהור באמבט מים recirculating כדי לאפשר לטמפרטורה equilibrate ל 8 מעלות צלזיוס.
3. חזור על שלבים 3.7-3.18.
4. חזור על שלבים 4.1-4.2.
5. חלות המתחם טהור-EOG זיהוי סף הריכוז בערוץ ניסיוני מוקצות באופן אקראי ועל הרכב (50% מים מתנול/יונים) לערוץ שליטה באמצעות משאבה סחרור במחירים קבועים של 200 mL/min במשך 5 דקות.
6. חזור על שלבים 4.4-4.6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

דיאגרמה סיכום השלבים המתוארים הפרוטוקול של fractionation מונחה bioassay מוצג באיור1. הפרוטוקול כרוכה בצעדים כדי לבודד ולאפיין את המבנה, את חוש הריח, והכוחות הפעילות התנהגותית של עגולי הפה ים בשם 5 פרומונים (איור 2). שימוש המוני spectrometric ו- NMR נתונים (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

דגים חיים בעולם כימי מלא של תרכובות, ובכל זאת להיות מזוהה. Fractionation מונחה bioassay הוכיחו חיוניים כדי לזהות ולאפיין מולקולות ביו המתווכות אינטראקציות כימיות רבות, כגון אלה הנהוגות סלמון masu ב³¹פילים אסיאתיים³², ים lampreys^{33, 34,...}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Premium standard wall borosilicate capillaries with filament	Warner Instruments	G150F-4	recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)
Pipette puller instrument	Narishige	PC-10	pulls electrodes for EOGs
Diamond-tipped glass cutter	Generic		cut tip of electrodes for EOG
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150-4	odorant delivery tube for EOG
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm	Warner Instruments	ESP-M15N	recording electrode holder
Reference electrode holder E Series with handle with  Ag/AgCl pellet  for glass capillary OD 1.5 mm	Warner Instruments	E45P-F15NH	reference electrode holder
1 mm pin	Warner Instruments	WC1-10	to bridge reference and recording electrode holders
2 mm pin	Warner Instruments	WC2-5	to bridge reference and recording electrode holders
Agar	Sigma	A1296	molten agar to fill electrodes
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9333	3M KCl to fill electrodes and electrode holders
Micropipette microfil	World Precision Instruments	MF28G-5	to fill electrodes and electrode holders
L-Arginine	Sigma	A5006	positive control odorant for EOG
Methanol	Sigma	34860
Water bath	Custom made	N/A	holds odorants for EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222)	Syndel USA	Tricaine1G	EOG anesthetic
Gallamine triethiodide	Sigma	G8134-5G	EOG paralytic
1 mL syringe	BD Biosciences	301025	to administer paralytic
Subcutaneous needle 26G 5/8	BD Biosciences	305115	to administer paralytic
Roller clamp	World Precision Instruments	14043-20	adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth
Sodium chloride (NaCl)	J.T. Baker	3624-05	for preparation of 0.9% saline
V-shaped plastic stand as specimen stage	Custom made	N/A	holds lamprey during EOG
Plastic trough	Custom made	N/A	holds V-shaped plastic stand during EOG
Scalpel Blades - #11	Fine Science Tools	10011-00	for EOG dissection
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12	for EOG dissection
Straight ultra fine forceps	Fine Science Tools	11252-00	for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps
Curved ultra fine forceps	Fine Science Tools	11370-42	for EOG dissection, Moria MC40B
Straight pring Scissors	Fine Science Tools	15003-08	for EOG dissection
Stereomicroscope	Zeiss	Discovery V8	for EOG dissection
Illuminator light	Zeiss	CL 1500 ECO	for EOG dissection
Plastic tubing	Generic		to connect re-circulating EOG setup and water baths
Odorant delivery tubing	Custom made	N/A
In line filter and gasket set	Lee Company	TCFA1201035A
Micromanipulators	Narishige	MM-3	to position electrodes and odorant delivery capillary tube
Magnetic holding devices	Kanetec	MB-K
Valve driver	Arduino	custom made	to control the opening of the valve for odor stimulation
Electromagnetic valve	Lee Company	LFAA1201618H	valve for odor stimulation
NeuroLog AC/DC amplifier	Digitimer Ltd.	NL106	to increase the amplitude of the elictrical signal
NeuroLog DC pre-amplifier with headstage	Digitimer Ltd.	NL102G	to increase the amplitude of the elictrical signal
Low-pass 60 Hz filter	Digitimer Ltd.	NL125
Digitizer	Molecular Devices LLC	Axon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software	Molecular Devices LLC	AxoScope version 10.4
Faraday cage	Custom made	N/A	Electromagnetic noise shielding
Two-choice maze	Custom made	N/A	waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner
Trash pump	Honda	WT30XK4A	fills maze with water from nearby river
Peristaltic pump with tubing	Cole Parmer	Masterflex 07557-00	to adminster odorants in maze
Inverter Generator	Honda	EU1000i	powers perstaltic pump
Release cage	Custom made	N/A	used to acclimate lamprey in the maze
Mesh	Generic		used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers
Buckets (5 gallon)	Generic		to mix odorants
Flow meter	Marsh-McBirney	Flo-Mate 2000	to measure discharge
XAD 7 HP resin	Dow chemical	37380-43-1	for extraction of conditioned water
Methanol	Sigma	34860	for extraction of conditioned water
Water bath	Yamato	BM 200	for extraction of conditioned water
Freeze dryer	Labconco	CentriVap Concentrator	for extraction of conditioned water
chloroform	Sigma	CX1050	for isolation of fraction pools
Silica gel 70-230 mesh	Sigma	112926-00-8	for isolation of fraction pools
Silica gel 230-400 mesh	Sigma	112926-00-8	for isolation of fraction pools
Pre-coated silica gel TLC plates	Sigma	99571	for isolation of fraction pools
anisaldehyde	Sigma	A88107	for isolation of fraction pools
Sephadex LH-20	GE Healthcare	17-0090-01	for isolation of fraction pools
Amberlite XAD 7 HP resin	Sigma	XAD7HP	for extraction of conditioned water
4, 2.5L capacity glass columns	Ace Glass Inc.	5820	for extraction of conditioned water
Acetone	Sigma	650501	for extraction of conditioned water
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent)	Waters Co.	N/A	for structure elucidation
Binary HPLC pump	Waters Co.	1525	for isolation of fraction pools/compounds
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent)	Agilent	N/A	for structure elucidation
Rotovap drying system	Buchi	RII	for extraction of conditioned water
UV lamp (254 nm)	Spectronics Co.	ENF-240C	for thin layer chromatography