הערכה של תגובות T-cell Zika וירוס ספציפיים באיברים Immunoprivileged של עכברים נגועים Ifnar1- / -

Summary

פרוטוקול להעריך תגובות תא T אנטיגן ספציפי באיברים immunoprivileged של Ifnar1^{- / -} מאתר מודל עבור זיהום בנגיף (ZIKV) Zika מתואר. בשיטה זו הוא מרכזי בשביל לחקור את המנגנונים התאיים של ההגנה, השיגה חיסונים ZIKV, והוא גם יקר להערכת היעילות שלהם.

Abstract

הווירוס Zika (ZIKV) יכול לגרום דלקת באיברים immunoprivileged (למשל, המוח ואת testis), שמוביל תסמונת גיליאן ופגיעה האשכים. במהלך זיהום עם ZIKV, תאים חיסוניים הוכחו לחדור לתוך הרקמות. עם זאת, המנגנונים התאיים המגדירים את הגנה ו/או השיגה של תאים חיסוניים אלה במהלך זיהום ZIKV הם עדיין אינו מודע לקיומם. במסמך זה, אנו מתארים שיטות כדי להעריך את הפונקציונליות של תא T ספציפי וירוס באיברים אלה immunoprivileged ' של עכברים נגועים ZIKV. שיטות אלה כוללות) ZIKV זיהום עם תרכיב חיסון עכברים^{- / -} Ifnar1; ב) histopathology, immunofluorescence ומבחני אימונוהיסטוכימיה לזהות וירוס זיהום או דלקת המוח, האשכים, ואת הטחול; ג) הכנת tetramer של תא T נגזר ZIKV epitopes; ד) הזיהוי של תאי T ספציפי ZIKV ומונוציטים מבודד מן המוח, האשכים, הטחול. באמצעות הגישות האלה, זה אפשרי לזהות את תאי T אנטיגן ספציפי חדרו לתוך האברים immunoprivileged, וכן להעריך את הפונקציות של תאים אלה T במהלך הזיהום: הגנת המערכת החיסונית פוטנציאליים באמצעות וירוס סיווג ו השיגה/או להחמיר את הדלקת. ממצאים אלה עשויים גם לעזור כדי להבהיר את תרומתו של תאי T שנגזרות את חיסון נגד ZIKV.

Introduction

ZIKV הוא flavivirus בעקיצות יתוש זה בודד לראשונה בשנת 1947 באוגנדה מ מקוק רזוס קודח. לאחרונה, הפכה ZIKV משבר בריאות הציבור, עקב הפצתו מהירה באמריקה וגם זיקתה לא צפוי microcephaly ו-^2,1,תסמונת גיליאן³. נתונים אפידמיולוגיים, ZIKV יש חשד להיות הגורם של תסמונת גיליאן בסביבות 1 לכל 4,000 נגוע מבוגרים⁴. יתר על כן, מתאם בין ZIKV ועל האשכים הזיהום/הנזק במודל עכבר הוכח, רומז כי הזיהום ZIKV, בנסיבות מסוימות, באפשרותך לעקוף את מחסום הדם-testis, להוביל בסופו של דבר פוריות הגבר⁵ . ממצאים אלו מדגישים את החשיבות של הבנת לחלוטין את תנאי הגיוס של תגובות מערכת החיסון מגן או פיפטות במהלך זיהום ZIKV.

הרבה נשאר כדי ללמוד אודות החיסון הסלולר התגובות ZIKV. CD4⁺ ו CD8⁺ T-cell התגובות capsid מעטפה, nonstructural חלבון 1 (NS1) נצפו נגועה ZIKV קופים ובני אדם^6,7,8. בעכברים, מספר מחקרים הראו כי CD8⁺ T תאים לשחק תפקיד מגן בשליטה על ZIKV שכפול^9,10,11. חשוב, Jurado. et al. הדגימו כי זיהום ZIKV גורמת להתפוררות מחסום הדם - מוח ואת perivascular חדירה של CD8⁺ אפקטור T תאים בתוך האשכים של עכברים^{- / -} Ifnar1. יתר על כן, הם הראו כי CD8⁺ T תאים לעורר שיתוק הקשורים ZIKV, מופיעים כדי לשחק תפקיד immunopathology המוח neonatal. במחקר הקודם, אנו מוכנים את tetramer_294-302- ZIKV-E, הראה CD8 ZIKV הספציפי הזה⁺ T קיימים תאים המוח, שידרה של Ifnar1 נגועה ZIKV^{- / -} עכברים, שייתכן שיש השלכות חשובות על העיצוב ופיתוח של חיסונים ZIKV¹⁰.

בתגובה הצורך הדחוף חיסון למניעת זיהום ZIKV, מספר חיסונים הם בשלבים פרה של פיתוח, כולל חיסונים RNA, חיסונים מבוססי-וקטור recombinant של חלבון מטוהרים חיסונים. החיסון דנ א פלסמיד הוא שלב 1 ניסויים קליניים¹². הערכת הבטיחות והיעילות של חיסונים ZIKV, לפיכך, הוא חשוב. אחד היתרונות של החיסונים הוא יכולתם להפיק תגובות T-cell ספציפיות, אשר עשוי להיות חשוב להגנה ZIKV. באמצעות ZIKV-derived T-cell הקשורות epitope tetramers, immunoreactivity T-cell המושרה על ידי חיסון ZIKV אדנו-וקטורית יכול להתגלות בעכברים לחסן, M ו- E glycoproteins הוצגו לזירוז CD8 אנטיגן ספציפי חזקים⁺ T-cell immunoreactivity¹³.

במהלך זיהום וירוס, ההכרה של אנטיגנים פפטיד שהוצגו על ידי מולקולות (MHC) מורכבים histocompatibility הגדולות לקולטן T-cell (TCR) הוא מנגנון T-תאית חשוב להגנה על המחשב המארח¹⁴. מבוסס על תיאוריה זו, טכנולוגיה tetramer הוא כלי ייחודי כדי להבהיר את התפקידים בתאי T אנטיגן ספציפי לשחק בוויסות תגובות חיסוניות ה-¹⁵. פרוטוקול זה מתאר את הקמת Ifnar1^{- / -} העכבר המודל עבור זיהומים ZIKV, הגילוי של תגובתי בתאי T בטחול, המוח, ו האשכים של העכברים באמצעות טכנולוגיית tetramer. בנוסף, השתמשנו את tetramer_294-302- ZIKV-E לזהות ולהעריך immunoreactivity T-cell המושרה על ידי חיסון ZIKV (AdC7-מ'/E) בעכברים לחסן. מחקר זה מספק הדרכה על חקירת T-cell תגובות באיברים immunoprivileged, ומספק הפניה עבור יישומים פוטנציאליים השליה או המוח העוברי.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של המכון הלאומי עבור נגיפי מחלות ומניעתן, סין CDC. כל הניסויים בוצעו בעקבות טיפול בעלי חיים מוסדיים, שאושרו על-ידי שימוש הוועדה פרוטוקולים בעלי חיים.

1. בנגיף

1. שמור מבוגר (6 עד 8 בת שבוע) עכברים^{- / -} (50% גברים ו- 50% נשים) Ifnar1 בתנאים סטנדרטיים מיוחד ללא פתוגן (SPF), ולאפשר להם גישה רגילה מזון ומים.
2. להדביק Ifnar1^{- / -} העכברים עם ZIKV דרך חיסון רטרו-מסלולית של 100 µL של ZIKV במאגר באגירה פוספט מלוחים (PBS) המכיל 1 x 10⁴ להיוות המוקד יחידות (FFUs) של הנגיף. באופן דומה, מספקים בקרת עכברים עם אמצעי אחסון שווה ל- PBS.
   התראה: להדביק את העכברים בתנאים ABSL2, לבצע הליכים אלה עם העכברים הנגועים בנגיף ב אבטחה הקבינט.
3. פקח על המשקל ועל סימנים קליניים (רעידות, מרץ מתנדנדת, דו צדדיים-רפוי הינד האיבר) של העכברים מדי יום במשך 15 ימים.

2. חיסון עם החיסון ZIKV

1. השתמש עכברים^{- / -} (50% גברים ו- 50% נשים) Ifnar1 בין גיל 6 עד 8 שבועות. לשמור את העכברים בתנאים סטנדרטיים SPF 18-29 ° C ו- 12 h/כהה מחזור עם גישה מזון ומים.
2. לחסן את Ifnar1^{- / -} העכברים עם החיסון ZIKV: להזריק 100 µL של AdC7-M/E [4 x 10¹⁰ (חלקיקי וירוס)] ב- PBS מאגר באמצעות זריקה תוך שרירית (כביש i.m.) באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 23-G.
3. באופן דומה, להזריק בקרת עכברים עם אמצעי אחסון שווה ל- PBS.

3. בידוד של ומונוציטים מן הטחול

הערה: ניתוקה של ומונוציטים מן הטחול מתוארת כאמור¹⁶.

1. עזים ומתנגד עכברים לחסן, נגועה ZIKV 7 d לאחר חיסון, באמצעות חמצן 100% concentrationin של 5% איזופלוריין (עם קצב זרימה של 1 ליטר/דקה). המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם. לאחר מכן, מיד לטבול והעכבר כולו בתוך 75% אתנול.
   זהירות: משלב זה ואילך, כל הפרוצדורות ניסיוני צריכה להתבצע גילוח ורחיצה כירורגית ב אבטחה ארון.
2. באמצעות מחטים, לתקן את איבריו של העכברים (לאללה, בעבר נגוע/לחסן) על הצלחת קצף עם הבטן פונה כלפי מעלה.
3. לחתוך את העור לאורך הקו האמצעי הבטן לבית החזה עם איזמל סטרילי, לחתוך את שרירי הבטן עם מספריים, לחשוף את חלל הבטן, ולהסיר בעדינות הכבד.
   הערה: האיבר הארוך, אדום כהה-משמאל של הקיבה הוא הטחול.
4. להסיר את הטחול, לשטוף אותו 3 x ב- PBS להסיר דם, ולמקם אותו ב- 1.5 מ של רוזוול פארק אנדרטת מכון קר כקרח בינוני (RPMI). שמור את הטחול על קרח.
5. כדי להפיק השעיה תא בודד של הטחול, מניחים את organ(s) על מסננת תא סטרילית 40 µm-רשת על גבי צינור 50 מ ל ולהוסיף 2 מ של קרח RPMI בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS). באמצעות הבוכנה של מזרק 5 מ ל, מועכים את organ(s), מוסיפים בינוני עד האיבר היה מלא הקרקע מבעד לרשת.
6. התליה תא להעביר צינור 15 מ"ל, centrifuge זה ב 600 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע.
7. Resuspend התאים עם 5 מ של תאי הדם האדומים (RBC) פירוק מאגר (NH₄קלרנית, נה₂EDTA ו KHCO₃; ראה את הטבלה של חומרים) דגירה התגובה פירוק בטמפרטורת החדר למשך 5-6 דקות.
8. לעצור את פירוק RBC עם 10 מ"ל של מדיום RPMI/FBS קר כקרח, centrifuge את הצינור ב x 600 g למשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע.
9. Resuspend התאים עם 10 מ"ל של מדיום RPMI מלאה (RPMI עם 10% vol/כרך FBS ו פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין...). להעביר 10 µL של התליה תא צינורית קטנה, ערבב את זה עם 10 µL של 0.4% wt/כרך trypan blue, לספור את מספר תאים באמצעות של hemocytometer.

4. בידוד של Monocytes המוח, האשכים

1. עזים ומתנגד עכברים הזכר נגועים ZIKV 7 d לאחר חיסון, באמצעות 5% isofluranein 100% חמצן (עם קצב זרימה של 1 ליטר/דקה). המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם. לאחר מכן, מיד לטבול והעכבר כולו בתוך 75% אתנול.
   התראה: משלב זה ואילך, כל הפרוצדורות ניסיוני חייב להתבצע גילוח ורחיצה כירורגית ב אבטחה ארון. בידודו של monocytes המוח, האשכים מתוארת כאמור¹⁷.
2. לשתק עכבר זכר (לאללה, נגוע בעבר) במצב שכיבה על קרש חיתוך.
3. לאבטח את הקרקפת עם מלקחיים ישר 1 x 2 שיניים, והשתמש מספריים איריס לעשות חתך קו האמצע על הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
4. תהדק את שני הצדדים של מסלולים עם פינצטה חדה ולתקן את המוח. מקם קצה אחד של מספריים איריס חדות לתוך נקב מגנום וחותכים רוחבית לתוך הגולגולת. חזור על שלב זה עבור הצד השני.
5. שימוש מספריים איריס לחתוך בזהירות מן החלל אותו עד האמצע, לכיוון האף. נסו לשמור לסוף המספריים כמו שטחי ככל האפשר להימנע ופצעו את המוח.
6. הרם את המוח עם מלקחיים, שימוש מספריים איריס לנתח בזהירות את סיבי עצב הגולגולת. מסירים את המוח עם מלקחיים ומניחים אותו בצינור 15 מ"ל המכיל 5 מיליליטר בינוני RPMI/10% FBS קר כקרח.
7. תפסי בעור בטן עם מלקחיים ולהשתמש מספריים איריס חדות עושים חתך אורכי דרך בעור בטן ולחשוף את החלק מוערמת של הבטן. לדחוף את האשכים עד החתך. בעדינות משוך על שכבת השומן עם פינצטה, לחשוף את מבחן הכדוריים משני הצדדים.
8. איריס חדה בשימוש מספריים לנתח בזהירות את שכבת השומן ואת יותרת האשך. מקם את האשכים בשפופרת 15 מ"ל המכיל 5 מ של הקר RPMI/10% FBS בינוני עם מלקחיים.
9. כדי להפיק השעיה תא בודד מן המוח או האשכים, למקם את האיבר על מסננת סטרילית תא עם רשת 100 מיקרומטר על גבי צינור 50 מ ל ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום RPMI/10% FBS קר כקרח. באמצעות הבוכנה של מזרק 5 מ ל, מועכים את האיבר ולהוסיף בינוני עד האיבר היה מלא הקרקע מבעד לרשת.
10. התליה תא להעביר צינור 15 מ"ל, centrifuge זה ב 600 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע.
11. Resuspend התאים עם 5 מ של 30% בצפיפות בינונית הדרגתי, לאחר מכן, הוסף אותם לאט לאט עד 2 מ"ל של 70% צפיפות בינונית הדרגתיות בשפופרת 15 מ"ל.
12. . תכבה את הבלמים, centrifuge הצינורות ב 4 ° C-x 800 גרם עבור 30 דקות קבל לימפוציטים מן השכבה האמצעית.
13. להעביר את לאטמוספרה צינור 15-mL טריים, להוסיף 10 מ של מדיום RPMI/10% FBS קר, centrifuge את הצינור ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע.
14. Resuspend התאים עם 10 מ"ל של מדיום RPMI/FBS קר כקרח, centrifuge אותם ב 600 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע.
15. Resuspend התאים עם 10 מ"ל של מדיום RPMI מלאה, לספור את מספר התאים כמו שלב 3.9.

5. tetramer הכנה

1. לבנות פלסמידים לבטא את התחומים חוץ-תאי של H-2D^b עם תג באתר biotinylated-C-הסופית של תחום α3, β₂m באמצעות וקטור pET28a NdeI, XohI הגבלה באתר¹⁸.
2. אקספרס והכן הכללה גופות של H-2D^b וβ₂מ' כפי שתואר לעיל²⁰.
3. Renature ולטהר את MHC/פפטיד מורכב H-2D^b-E_294-302-ה.
   1. להכין 200 מ של פתרון refolding [100 מ מ טריס-HCl (pH 8.0), 400 מ L-ארגנין, 2 מ מ EDTA-נה, 5 מ מ GSG, ו 0.5 מ מ GSSG]. להוסיף מעכבי פרוטאז: 2 מ"ל של פלואוריד phenylmethylsulphonyl (PMSF, מניות 100 מ מ), 100 µL של pepstatin (מניות 2 מ"ג/מ"ל) 100 µL של leupeptin (מניות 2 mg/mL). מגניב המאגר ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   2. להוסיף הפתרון refolding H-2D^b, β₂מ' ופפטיד.
      1. מזריקים µL 500 מ'₂β מומס הפתרון guanidine (30 מ"ג/מ"ל מניות) באמצעות מזרק. בשביל זה, שימוש במחט 23 גרם עם מזרק 5 מ ל, מזריקים β₂m לתוך הפתרון refolding טיפה על ידי ירידה. לשמור את הפתרון באופן קבוע ולאט זע ב 150 סל ד ב 4 º C.
      2. לאחר β₂מ' יש כבר מומס הפתרון refolding, לפתור 2 מ ג של פפטיד_294-302- E ב- 200 µL של דימתיל סולפוקסיד ולא במהירות ומזריקות אותו הפתרון refolding באמצעות פיפטה. לאט לאט מוסיפים את הפתרון ב 150 סל ד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      3. להזריק 1.5 מ ל H-2D^b המומסים בתמיסה guanidine. שמור את מסתובבת בר stir ב rpm 150 עבור refolding של H-2D^b -4 מעלות צלזיוס במשך 8-10 h.
         הערה: הפתרון הונח בתוך קופסה סגורה בחדר קר.
   3. ריכוז החלבון refolded בתוך תא מווסת עם קרום kDa 10 להחליף את המאגר [20 מ מ טריס-HCl (pH8.0), 50 מ מ NaCl] אל התא ולרכז אותו לאמצעי הסופי של 30 – 50 מ.
   4. להעביר את הפתרון refolding שפופרת צנטרפוגה ולסובב את זה ב 2,500 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
   5. בזהירות להעביר את תגובת שיקוע 10 kDa צנטריפוגלי מסנן, עוד יותר להתרכז זה לאמצעי אחסון הסופי של 500 µL ב x 2,500 g למשך 30 דקות.
   6. להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים ואת זה ספין-12,000 x g עבור 15 דקות Purify החלבון עם S200 10/300 GL ג'ל כרומטוגרפיה filtration.
   7. לאסוף את השיא מורכב MHC ולרכז אותו לאמצעי הסופי של 350 µL.
4. כדי ליצור אמצעי אחסון התגובה 500-µL עבור biotinylation, להוסיף ההנהלה לפי הסדר הבא: µL 100 של פתרון A [0.5M bicine (pH 8.3)], 100 µL של פתרון B (100 מ מ ATP, 100 מ מ MgOAc, ביוטין µΜ 200), 100 µL של תוספת d-ביוטין (ביוטין µΜ 500) , µL 20 של האנזים בירה (60 µg), 0.5 µL של pepstatin (2 מ"ג/מ"ל) ו- 0.5 µL של leupeptin (2 mg/mL). דגירה הצינור התגובה בין לילה ב 4 º C.
   התראה: לא להוסיף שום EDTA התגובה biotinylating.
5. לטהר את MHC באמצעות S200 10/300 GL ג'ל סינון העמודה כדי להסיר כל ביוטין נוספת.
6. לקבוע את יעילות biotinylating עם וזמינותו streptavidin-shift¹⁸.
   1. להכין 3 דגימות, A, B ו- C, על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, לנתח את התוצאות על ידי 10% עמודים מרחביות. לדוגמה A מורכב µL 8 של מולקולות MHC biotinylated 2 µL של מאגר exchange, מדגם B של 8 µL של מולקולות MHC biotinylated µL 2 מדגם C של 2 µL של streptavidin (20 מ"ג/מ"ל), streptavidin (20 מ"ג/מ"ל), ואת מאגר exchange µL 8.
      התראה: לא להרתיח את הדגימה.
7. טופס multimers של מולקולות biotinylated MHC.
   1. לייצר tetramer על ידי ערבוב של biotinylated E_294-302- פפטיד-H₂D^b קומפלקס עם התווית על-ידי phycoerythrin streptavidin ב השומה יחס של 1:5 על מנת להבטיח איגוד מלאה של כל מולקולות MHC biotinylated.
   2. לחשב את כמות streptavidin-המספר המשלים לצורך tetramerization.
      1. לקבוע את השומות של מתחמי פפטיד MHC/החשבונאי ריכוז חלבון ואת המשקל טוחנת (דוגמה: 1.8 מ ג חלבון סה כ = 40 nmol).
      2. לחשב את השומות של הצורך על-ידי חלוקת השומות של MHC/פפטיד עד 5 את streptavidin-המספר המשלים (דוגמה: 40/5 = nmol 8 של streptavidin-המספר המשלים).
      3. לחשב את כמות streptavidin הצורך (ב µg) בהתאם streptavidin-המספר המשלים (לדוגמה: streptavidin-PE [300,000 g/M] ← 8 nmol צריך = 2,400 גרם).
   3. לחלק streptavidin-phycoerythrin 10 דוגמאות. להוסיף כל מדגם שפופרת המכילה את biotinylated E_294-302- פפטיד-H₂D^b מורכבים, במרווח של 20 דקות. לאחר טעינת הדגימה האחרונה, דגירה הצינור התגובה ב 4 ° C בלילה בחושך.
8. להחיל את ריאגנטים multimerized לתוך צינור סחרור 100 kDa ולרכז אותו על ידי צנטריפוגה-x 2,000 g ב- 4 ° C עד נפח של < 100 µL.
9. לדלל את הדגימה בצינור ספין 4 מ ל באמצעות PBS (pH 8.0) ולרכז אותו שוב ל < 100 µL.
10. חזור על ההחלפה מאגר שלב ב- PBS (pH 8.0) 4 x.
11. למלא את הנפח הכולל שוב כדי 500 µL באמצעות PBS (pH 8.0). לרכז את הדגימה ריכוז המשוערת של 2-2.5 מ"ג/מ"ל ב x 2,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס. חנות המדגם בחושך ב 4 º C.

6. דנ

1. דגירה של המתלים תא (מתוך שלב 3.9 ו/או שלב 4.15) ב 4 ° C עם 0.1 µL של murine נגד CD16/CD32 Fc-קולטן ריאגנט חסימה לכל 20 µL (דילול פקטור 1:200) למשך 10 דקות, כדי למנוע כל קישור לא ספציפי.
2. Centrifuge את הצינור tetramer ב x 20,000 g למשך 15 דקות לפחות ב 4 º C.
3. הוסף 20 µL של התליה תא תאים⁶ 96-ובכן platecontaining עונה 1 פרק 10 אחד טוב.
4. להכין את נפח מספיק של המיקס tetramer_294-302- E כתם לכל הצינורות ניסיוני. היכונו עודף של 15% מהנפח הכולל בשילוב זה לחשבון pipetting שגיאות. לדלל את E_294-302- tetramers (2 מ"ג/מ"ל, µL 1/בדיקות) במאגר FACS (PBS, 0.5% FBS) כך µL 20 של המיקס tetramer_294-302- E מתווסף כל בדיקה.
5. הוסף 20 µL של המיקס tetramer_294-302- E לצלחת 96-ובכן. בסוף שלב זה, האחסון הסופי בכל טוב צריך להיות 40 µL.Incubate הצלחת בחושך אווריריות למשך 30 דקות.
6. להוסיף ראשי נוגדנים (FITC מצומדת או מצומדת APC אנטי-CD3 (0.2 מ"ג/מ"ל), PerCP מצומדת אנטי-CD8 (0.2 מ"ג/מ"ל)) µL 1/הבדיקה התליה תא ו, אז, דגירה זה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
7. לשטוף את התאים 2 x 2 מ של מאגר FACS, צנטריפוגה אותם ב x 600 g עבור 5 דק בקפידה וארוקן את תגובת שיקוע ואת resuspend את התאים עם 200 µL מאגר FACS.
8. לאחסן את הדוגמאות באופן זמני ב 4 ° C בחושך עד הניתוח cytometric זרימה.
9. השתמש את האסטרטגיה הבאה חסימה על הניתוח cytometric זרימה.
   1. ליצור שער ללבישה באלכסון באשכולות ידי פיזור קדמי (FSC) לעומת הצד פיזור (האס) אזור.
   2. לאחר מכן, שער ב- CD3⁺ תאים על-ידי הצד פיזור (האס) נגד CD3; בשלב הבא, שער ב- CD3⁺ CD8⁺ תאים; לבסוף, חלוקה לרמות CD8⁺ tetramer⁺ תאים¹⁹.

7. histopathology, Immunofluorescence ואת וזמינותו אימונוהיסטוכימיה

1. Histopathology assay
   1. לאסוף את רקמות המוח ואת testis נגועה ZIKV Ifnar1^{- / -} עכברים 7 d לאחר חיסון ותקן אותן בפורמלין באגירה ניטרלי 4%.
      זהירות: Paraformaldehyde הוא רעיל; ללבוש ציוד מגן אישי המתאים.
   2. להטביע את הרקמה פרפין.
   3. בסעיף ברקמות 5 מ מ באמצעות של vibratome.
   4. כתם הרקמה ועם hematoxylin אאוזין (H & E).
2. אימונוהיסטוכימיה assay
   1. Deparaffinize נוזלים, אנטיגן-אחזר הרקמה מקטעים, המבוססים על שגרות שתוארה לעיל²¹.
   2. מתייחסים הסעיפים רקמות עם 3% H₂O₂ ב- PBS (pH 7.6) 10 דקות ולחסום אותם עם 1% שור אלבומין (BSA) למשך 10 דקות.
   3. דגירה הסעיפים רקמות עם עכבר עכבר אנטי CD3 נוגדנים (דילול: 1/1000) עבור 8 שעות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן, דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   4. לשטוף את הרקמות עם PBS ו, אז, דגירה אותם עם 3 טיפות של נוגדן משני biotinylated (דילול: 1/1000) עבור 2 h בטמפרטורת החדר, ואחריו 3 טיפות אבידין-ביוטין-peroxidase (דילול: 1/200) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   5. לאגד, בעל 3 טיפות של 30, 30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (דילול: 1/1000), כפי שתואר לעיל²².
   6. Counterstain הסעיפים רקמות עם hematoxylin של מאייר.
3. Immunofluorescence assay
   1. מילה נהדרת הסעיפים testis קפואים (6 מ מ) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. לתקן אותם עם אצטון קרח למשך 10 דקות.
   3. לשטוף את הסעיפים עם PBS עבור 3 x ולחסום אותם עם מאגר חסימה (1% BSA, 0.3% טריטון, 1 x PBS) ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   4. דגירה הסעיפים רקמות עם נוגדן ראשוני (Z6) (20 µg/mL) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   5. לשטוף את הרקמות עם PBS ולהחיל הנוגדן המשני (דילול פקטור: 1/200) עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
   6. לשטוף את הסעיפים רקמות עם PBS ו counterstain אותם עבור גרעינים באמצעות 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) (דילול פקטור: 1/1000), ההוראות של היצרן.

תוצאות

בעקבות שיטות אלו, פיתחנו מודל מאתר לזיהומים ZIKV. עכברים^{- / -} Ifnar1 רוב בגיל 6-8 שבועות נדבקו בנגיף עונה 1 פרק 10⁴ מיקוד יוצרי יחידות (ffu ב) של ZIKV על ידי זריקה retroorbital. סימפטומים פתולוגיים, סימנים (איור 1א'), כמו גם שינויים במשקל (איור 1B), נצפו בעכברים^{- / -} Ifnar1 לאחר זיהום עם ZIKV. המוח מאתר הראה בצקת ברור hyperemia (איור 1C). בינתיים, האשכים התכווצה בהדרגה (איור 1D). יתר על כן, שינויים פתולוגיים והרס רקמות נמצאו במוח ובחוט האשכים (איור 2א). ביצענו וזמינותו של immunofluorescence לאתר ZIKV את המוח ואת האשכים (איור 2B). המון נגיפי גבוה אותרו במוח ובחוט testis מאת immunostaining (איור 2B). אימונוהיסטוכימיה הראה על חדירה חזקה של CD3⁺ T תאים לתוך המוח עכברים לאחר ההדבקה עם ZIKV (איור 2C).

לזהות ולהעריך תגובות ספציפיות ZIKV T-cell, הכנו עכבר MHC-אני H-2D^btetramer_294-302 - E. פפטיד E_294-302- יכול לעזור renature^b של ה-2D כראוי, תשואות כמות גבוהה MHC מסיסים-אני (איור 3א). ב- shift וזמינותו, יעילות גבוהה ב- biotinylation יכול להיות שנצפו (איור 3ב). לאחר מכן, שלושה streptavidin קרינה פלואורסצנטית (APC, PE, ו- BV421) - מתויג pMHC - אני tetramers הופקו כדי לזהות תאים ספציפיים ZIKV T (איור 3ג'). Tetramer התווית על-ידי PE היה על יעילות גבוהה יותר כדי לזהות את CD8 ספציפי⁺ תא T בהשוואה tetramers APC ו BV421-שכותרתו, למרות ההבדל לא היה משמעותי סטטיסטית.

באמצעות את tetramer_294-302- E, אנחנו זוהה לימפוציטים מסוג T ספציפי ZIKV הטחול של עכברים נגועים על ידי cytometry זרימה-7 d לאחר חיסון של ZIKV (3.49 ± % 0.45). כמו כן, בדומה השיטה המתוארת בסעיף 3 של פרוטוקול זה, עם חיסונים לאחר 4 שבועות של חיסון AdC7-M/E, לימפוציטים מסוג T ספציפי ZIKV אותרו הטחול (± 6.89 אינץ 1.36%) (איור 4).

יתר על כן, הבחנו לימפוציטים שהסתננו האברים immunoprivileged, כגון המוח, האשכים, לאחר ההדבקה ZIKV. השערים נקבעו כדי לבחור עבור CD3⁺CD8⁺ T תאים לימפוציטים מוחלט של המוח, האשכים. יחס גבוה של תאי T E הספציפי tetramer_294-302 יכול להתגלות במוח (42.2% ב- CD3⁺CD8⁺ T תאים), את האשכים (26.4% ב- CD3⁺CD8⁺ T תאים) לימפוציטים (איור 5).

איור 1 : אפיון של הזיהום ZIKV בעכברים^{- / -} Ifnar1. עכברים^{- / -} Ifnar1 רוב בגיל 6-8 שבועות היו נגועים 10⁴ מיקוד יוצרי יחידות (ffu ב) של ZIKV באמצעות הזרקת retroorbital, עכברים הזריק PBS שימשו פקדים נגוע. מורפולוגיה (A) ושינויים (B) במשקל של עכברים^{- / -} Ifnar1 נגוע נוטרו. החיצים האדומים מצביעים על Ifnar1^{- / -} עכברים המוצג עם myeloparalysis ו- paraparesis מנוע לאחר הזיהום. (ג) המוח-חיסון שלאחר 7 d ועל האשכים (D)-0, 7, 14, ו- 30 יום לאחר חיסון נבצרו. להחליפן בתמונות של המוח, האשכים של העכברים מוצגים עם סרגל כדי לציין את הגודל. קווי השגיאה לייצג את זאת אומרת ± ב- SEM. n = 10 עכברים לכל קבוצה לכל ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : זיהוי של ZIKV ו לימפוציטים במוח ובחוט testis של עכברים^{- / -} נגוע ZIKV Ifnar1. (א) לוח זה מראה שינויים histopathological המוח, האשכים של עכברים נגועים ZIKV בהשוואה עם פקדים שלילי-7 d לאחר חיסון. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר (החלונית הימנית) ו- 50 מיקרומטר (לוח נכון). (B) immunofluorescence assay בוצעה עם הנוגדן Z6 אנטי-ZIKV (ירוק). כל דגימות רקמה נאספו מעכברים נגועים ZIKV-חיסון שלאחר 7 d. הגרעינים היו מוכתמים דאפי (כחול). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (ג) אימונוהיסטוכימיה תוכניות של חדירה חזקה של CD3⁺ T תאים לתוך המוח ואת testis. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר (החלונית הימנית) ו- 50 מיקרומטר (לוח נכון). סגול מציין hematoxylin, חום מייצג הנוגדן CD3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : הכנת ספציפי ZIKV pMHC-אני tetramers. (א) הכריכה של E_294-302- H-2D^b הובהר על ידי במבחנה refolding. כחול מציין החלבון_294-302- H-2D - E^b. הכתום מייצג את הפקד שלילי ללא פפטיד. (B) לוח זה מראה את וזמינותו של H-2D^bshift_294-302 - E. (ג) זיוף מייצג פקד PBS. זריחה streptavidin 3 (APC, PE, ו- BV421) - מתויג pMHC - אני tetramers שימשו לזיהוי תאי T ZIKV ספציפיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : זרימה cytometric ניתוח של CD8 וירוס ספציפיים ⁺ תאי T בהטחול של עכברים נגועים ZIKV ואת לחסן חיסון. עכברים^{- / -} Ifnar1 רוב בגיל 6-8 שבועות נדבקו גם עם 10⁴ מיקוד יוצרי יחידות (ffu ב) של ZIKV או התקבלה מנה אחת של 4 x 10¹⁰ חלקיקים נגיפיים של AdC7-M/E או PBS כפקד שלילי. לאחר 7 ימים לאחר הפגיעה או 4 שבועות לאחר חיסון, העכבר splenocytes היו קוצרים, נותחו על ידי cytometry זרימה. הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± SD. Statistical הניתוח התבצע בעזרת חד-כיווני אנובה (לא משמעותי: P > 0.05; *P < 0.05; * *P < 0.01; * * *P < 0.001; * * *P < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

איור 5 : Gating אסטרטגיה ותוצאות נציג של וירוס ספציפיים CD8⁺ T תאים במוח ובחוט האשכים של עכברים נגועים ZIKV. מגרשים נציג מוצגים עבור לימפוציטים הסתנן (A) של המוח ו- (B) בזרמה. רצף של גייטס מוגדר בחר הלימפה-פיזור⁺ ואת CD3⁺ אירועים. אלה, CD8⁺ אירועים הן פיקוח לניתוח של תאי T epitope ספציפיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Discussion

Epitope T-cell immunogenic ממלא תפקיד משמעותי הסלולר חסינות מפני פתוגנים²³. לפיכך, הגילוי של תאי T ספציפי ZIKV באיברים immunoprivileged היא מתודולוגיה קריטי להבין T-cell תגובות נגד הזיהום ZIKV טבעי. בינתיים, T-cell תגובת הזיהוי היא כלי מצוין כדי לחקור את היעילות של החיסון ויראלי. . הנה, אנחנו מראים פרוטוקול מקיף כדי להמחיש את הניסויים, הכוללים את הבידוד של לימפוציטים מן הטחול, המוח, האשכים של עכברים נגועים ZIKV, הכנת tetramer_294-302 epitope E immunodominant, ו זיהוי של CD8 ספציפי ZIKV⁺ T תאים באיברים immunoprivileged של עכברים נגועים ZIKV.

מחקר קודם הראה כי ZIKV בשידור חי או RNA שלה ניתן להבחין בהזרע של חולים הגברי, אשר מציין כי ZIKV יכולה לעקוף את מחסום הדם-testis, לשכפל את עצמו בתוך מערכת הרבייה²⁴. בעבר, גם הראנו כי ZIKV יכול לגרום לנזק האשכים, להוביל פוריות הגבר עכברים²⁵. ZIKV זיהום יכול לגרום viremia ב קופי רזוס, ניתן להבחין RNA נגיפי מערכת העצבים המרכזית (CNS), וכן איברים מהבטן. אימונוהיסטוכימיה חשף כי אנטיגנים ספציפיים ZIKV הוצגו ב מערכת העצבים ו איברים היקפיים בגוף מספר²⁶. גם דגמים מאתר, ZIKV זיהום יכול לגרום של CD8 נגיפים עמידים⁺ T-cell התגובה בטחול ו CNS²⁶.

לעומת העבודות הקודמות, מחקר זה קובע שיטתי שיטות לזהות CD8 ספציפי ZIKV⁺ T-cell תגובות המוח, האשכים, אשר הם immunoprivileged אתרים. חשוב להעריך את הפונקציונליות של וירוס ספציפיים בתאי T באיברים immunoprivileged של העכברים הנגועים ZIKV. השימוש tetramers כדי לזהות CD8 ספציפי ZIKV⁺ T-cell תגובות באיברים immunoprivileged מאוד לשפר את ההבנה שלנו של זיהומים ZIKV שלהם תגובות מערכת החיסון של הפונדקאי. שימוש tetramer_294-302- E, וירוס ספציפיים T תאים במוח, testis יכול להיות מבודדת על ידי cytometry זרימה, לחקור את המנגנונים התאיים של הגנה, השיגה במהלך זיהום ZIKV. בינתיים, היא מסייעת לחוקרים לחקור עוד יותר את הפונקציות של CD8⁺ T תאים כדי לשלוט על ZIKV, או כדי לשפר את השיגה באיברים אלה במהלך זיהום ZIKV.

כדי לנתח את CD8 מאתר של אנטיגן ספציפי⁺ T-cell תגובות באיברים immunoprivileged, אנו מוכנים H-2D^btetramer_294-302 - E, זיהה את CD8⁺ T תאים על-ידי cytometry זרימה. Tetramers הם כלי רב עוצמה כדי לזהות תאים T אנטיגן ספציפי. כאן, נוצרו שלושה סוגים של streptavidin fluorochrome מצומדת (APC, PE, ו- BV421). אמנם אין הבדלים משמעותיים סטטיסטית APC-, BV421-ו tetramers התווית על-ידי PE לזיהוי תאי T אנטיגן ספציפי, pMHC התווית על-ידי PE-אני tetramers הניבו את התוצאות הטובות ביותר. לפיכך, tetramer התווית על-ידי PE שימשה במהלך מחקר זה. מעניין, על סמך את tetramer_294-302 התווית על-ידי PE H-2D - E^b, הבחנו יחסי גבוה של תאי T אנטיגן ספציפי בתוך המוח והן האשכים, אשר מצביעים על יכולת העברה של תאי T ספציפי וירוס מהדם אל immunoprivileged איברים.

עם זאת, ישנן כמה מגבלות לפרוטוקול. Tetramer_294-302- H-2D - E^bאינה שימושית עבור זיהוי אדם T-cell, כי זיהוי tetramer תלויה MHC ההגבלה. הקרנת הסרט immunodominant מוגבלת הלע פפטידים שיש בכך צורך. חוץ מזה, רטרו-מסלולית זיהום יעיל עבור זיהום ZIKV, אך ייתכן לא מבצע נוח עבור חוקרים מסוימים. לפיכך, גם נתיבים אחרים של זיהום, כולל הצפק, תת עורית או תוך ורידי, הם מומלצים.

פרוטוקול המתוארים כאן, הוא שלב קריטי בידודו של monocytes המוח, testis. חשוב לרכוש באיכות גבוהה לימפוציטים; לכן, חשוב להקדיש תשומת לב, לדוגמה, צנטריפוגלי המהירות, את הכוח של הרקמה שחיקה, ואת הקרע של רקמת המוח, testis. חוץ מזה, הכנה tetramer, מעכבי פרוטאז (PMSF, pepstatin, leupeptin) הם מועיל כאשר הגנה על חלבון מפני שהוא הושפל. לכן, הגיוני להוסיף מעכב פרוטאז למאגר refolding ולהחליף את המאגר במהלך התהליך של הכנת tetramer.

לסיכום, אנו מציגים שיטות זיהוי אנטיגן ספציפי T-cell תגובות באיברים immunoprivileged של Ifnar1^{- / -} העכבר מודל עבור זיהום ZIKV. פלטפורמה זו יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי לחקור את מנגנוני החיסון המתעוררים, שוב מתעוררים וירוסים אשר יכולים לעקוף את המחסומים בין הדם האברים immunoprivileged. יתר על כן, מחקר זה עשוי לסלול את הדרך לפיתוח עתידי של המועמד חיסונים immunotherapies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z6	our lab		Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3	Santa Cruz	sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated	CWBIO	CW0115
FITC anti-mouse CD3	Biolegend	17A2
APC anti-mouse CD3	Biolegend	100236
PerCP anti-mouse CD8a	Biolegend	100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	Toxic and corrosive reagent. Handle with care
Streptadivin	BD	S4762-FZ	Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and  stored at -20 °C
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG	5 mg in 2.5 mL DMSO, aliquots stored at -20 ºC
Leupeptin	Sigma	L8511	5 mg in 2.5 mL dH2O, aliquots stored at - 20 ºC
Peptides	Scilight-peptide		Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	Must be stored at 4 °C
DMSO	MP	219605590	Store at room temperature.
APC-Streptadivin	BD	554067	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
FITC-Streptadivin	BD	554060	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
PE-Streptadivin	BD	554061	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
BV421-Streptadivin	BD	563259	Must be stored and maintained at 4 °C. Do not freeze.
PageRuler Unstained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26614	Must be stored at 4 °C
Cell Strainers	BF	BF10-5040	Store at room temperature.
Amicon Ultra 100 kDa	Millipore	UFC510024	Store at room temperature.
Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific
FACS Cantol			Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used.
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE healthcare
red blood cell lysis buffer	Solarbio	R1010	Store at 4 °C.