גישה במבחנה טיפול פוטודינמי

Summary

טיפול פוטודינמי (PDT) היא הליך רפואי הכרוך דגירה של אפלייד exogenously פוטוסנסיטייזר (PS) ואחריו photoactivation אור גלוי כדי לגרום אפופטוזיס. אנו מציגים במבחנה PDT פרוטוקול שנועדו לדמות PDT בהם ניתן ללמוד הבדלים PS הדגירה ופרמטרים טיפול קל.

Abstract

טיפול פוטודינמי (PDT) היא הליך רפואי המערבת דגירה על פוטוסנסיטייזר exogenously יישומית (PS) ואחריו photoactivation אור גלוי לזירוז תא אפופטוזיס. הממשל הפדרלי הסמים אישרה PDT לטיפול קרנת אקטינית, הנחיות קליניות ממליצים PDT לטיפול אקנה דלקתית של עור שאינו מלנומה סרטן מסוימים. PDT הוא מודאליות טיפולית יתרון הוא בעלות נמוכה, לא פולשנית, והוא מזוהה עם תופעות לוואי מינימליות ולא מפחיד. בשלב הראשון של PDT, PS חלה, מותר לצבור intracellularly. הקרנה אור עוקבות גורם היווצרות מינים חמצן תגובתי, דבר שעלול להוביל בסופו של דבר תא אפופטוזיס, ממברנה הפרעה, נזק מיטוכונדריאלי, אפנון המערכת החיסונית, התפשטות תקין ו מחזור קולגן. במסמך זה, אנו מציגים שיטה במבחנה ללימוד PDT בשורה התא חסיד. פרוטוקול טיפול זה מיועד כדי לדמות PDT, עשוי להיות מותאם כדי ללמוד את השימוש PDT עם שונים שורות תאים, photosensitizers, דגירה טמפרטורות או אורכי הגל photoactivation. קשקש קרצינומה של תאים היו מודגרות עם 0, 0.5, 1.0 ו- 2 מ מ 5-aminolevulinic חומצה (5-ALA) עבור 30 min ו- photoactivated עם 417 אור כחול nm 1,000 s. מדד התוצאה העיקרי היה אפופטוזיס נמק, כפי שהיא נמדדת cytometry זרימה D annexin V ו- 7-aminoactinomycin. הייתה עלייה למינון של אפופטוזיס תא בעקבות שלושים דקות דגירה של 5-ALA. כדי להשיג תוקף הבין-המבחן גבוהה, חשוב לשמור על דגירה עקבי ופרמטרים אור בעת ביצוע ניסויים במבחנה PDT. PDT הוא שמחקר בהליך ו במבחנה קליני שימושי עשוי לאפשר פיתוח PSs הרומן, אופטימיזציה של פרוטוקולים, סימנים חדשים עבור PDT.

Introduction

טיפול פוטודינמי (PDT) היא הליך רפואי המערבת דגירה על פוטוסנסיטייזר exogenously יישומית (PS) ואחריו photoactivation אור גלוי לזירוז תא אפופטוזיס. הניהול סמים הפדרלי (FDA) אישר PDT לטיפול קרנת אקטינית (אי קאי), הנחיות קליניות ממליצים PDT לטיפול אקנה וולגריס^1,2של עור שאינו מלנומה סרטן מסוימים. שימושים שאינם דרמטולוגיים המתעוררים PDT כוללים טיפול במערכת העיכול, הערמונית, הגינקולוגית סרטן³. PDT הוא מודאליות טיפולית יתרון זה בעלות נמוכה, לא פולשנית, הקשורים עם תופעות לוואי מינימליות הצטלקות².

בשלב הראשון של PDT, PS חלה, מותר לצבור intracellularly². בארצות הברית, עכשוי 5-aminolevulinic חומצה (5-ALA) משמש בדרך כלל לטיפול AKs. במהלך שלב, 5-ALA מומר protoporphyrin התשיעי (PP-IX) דרך השביל ביוסינטזה heme תאים incorporated³. תאי סרטן וסרטן קדם פחתו ferrochelatase פעילות, אשר ממירה protoporphyrin התשיעי (PP-IX), המוצר הסופי, heme. כתוצאה מכך, תאי סרטן לצבור PP-IX לעומת תאים נורמליים^4,5. זו הצטברות של PP-IX בסרטן, תאים סרטניים מראש ביחס הרקמה שמסביב מאפשר PDT להיות בגישה יישוב עם תופעות לוואי מינימליות. הקרנה אור מוביל החמצן מגיב מינים (ROS) דור כאשר חמצן מקבל אלקטרונים מ PP-IX. PP-IX יש קליטה שיא בספקטרום סגול עם פסגות קטנות יותר ברחבי גלוי הספקטרום אור, כולל אור כחול ואדום². היווצרות ROS עשוי להוביל בסופו של דבר תא אפופטוזיס, הפרעה ממברנה, נזק מיטוכונדריאלי, אפנון המערכת החיסונית, התפשטות תקין ו קולגן מחזור^{6,7,8,9 , 10}.

PDT פותחה בשנות השבעים והוא מודאליות טיפולית המתפתחת³. פרוטוקול שאושרו על-ידי ה-FDA לטיפול של מיכל ממליצה 5-ALA העור הדגירה במשך 14 – 18 h, אך incubations h 1 עד 2 משמשים הקלינית². חוץ גופית ב , אנחנו הראו כי קצר יותר 15 דקות 5-ALA incubations עשוי להגדיל את אפופטוזיס תאי פיברובלסט בהשוואה fibroblasts לא מטופל^11,12. בנוסף, הרומן chlorin, phthalocyanine ו- PSs מבוססי ננו-חלקיק להיות נלמדים כדי לשפר את היעילות PDT³. במסמך זה, אנו מציגים שיטה במבחנה כדי לימוד PDT חסיד קשקש קרצינומה של תאים תאים. ב פרוטוקול זה, SCC-13 תאים מודגרת עם 0, 0.5, 1.0 ו- 2 מ מ 5-ALA עבור 30 min ו- photoactivated עם 417 אור כחול nm 1,000 s. מדד התוצאה העיקרי הוא אפופטוזיס נמק, כפי שהיא נמדדת cytometry זרימה annexin V ו- 7-aminoactinomycin D (7-מ). פרוטוקול טיפול זה מיועד כדי לדמות PDT, עשוי להיות מותאם כדי ללמוד את השימוש PDT עם אחרים שורות תאים, photosensitizers, דגירה טמפרטורות או אורכי הגל photoactivation. הכנת קבוצות פקדים נוספים עשוי להיות נחוץ, כולל fluorophore וללא רבב, יחיד צבעונית, פקדי השליליים והחיוביים עבור cytometry זרימה. סקירה מקיפה של התיאוריה, פרוטוקולים, תכנון ניסויים gating עבור cytometry זרימה אפופטוזיס/נמק ניתן למצוא במקום¹³.

Protocol

1. הכנת תאים

1. צלחת 20,000 תאים ב- 2 מ של תרבות בינוני לתוך כל טוב של צלחת 6-ובכן שימוש סטרילי טכניקה אבטחה בארון.
2. מקום 6-ובכן צלחות חממה humidified (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) במשך 24 שעות ביממה לאפשר את התאים לדבוק צלחות.

2. הכנה של פוטוסנסיטייזר לטיפול של תאים

1. להכין 0.5, 1 ו- 2 מ מ 5-ALA פתרונות במדיום תרבות. אם העובר שור סרום (FBS) הוא מרכיב של תרבות בינוני, להכין, יטפל בתאים עם 5-ALA בפתרון תרבות בינוני עם 0.1% FBS עבור incubations. ^{11 , 12} . במקרה זה, SCC-13 תאים אינם דורשים FBS, כך 5-ALA נוספו ישירות תקין ללא סרום בינוני בתוספת תמצית יותרת המוח שור, גורם הגדילה באפידרמיס.
2. האחות המדיום תרבות ולשטוף את התאים לפחות 2 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS).
3. האחות PBS ולהוסיף 2 מ"ל של פתרונות, עלא 5 0, 0.5, 1 או 2 מ מ לתוך צלחות נפרדות או בארות.
4. דגירה התאים עם 0, 0.5, 1, או 2 מ מ 5-ALA-36-37 מעלות צלזיוס חימום בלוק עבור 30 דקות להגן על התאים מפני חשיפה קלה במהלך הדגירה באמצעות נייר אלומיניום.
5. וארוקן את הפתרונות, עלא 5 0, 0.5, 1 ו- 2 מ מ, לשטוף את התאים עם 2 מ"ל ל- PBS.
6. האחות PBS ולהוסיף 2 מ של תרבות בינונית עבור הקרנה אור כחול.

3. פוטותרפיה אור כחול

1. לפני בין התאים, הפעל את ההתקן אור כחול (למשל, דיודה פולטת אור, פלורסנט או אור הלוגן) ולהפעיל עבור מחזור אחד (1,000 s) כדי לחמם את המכשיר. המכשיר אור כחול צריך אורך גל של פלט של 417 ± 5 ננומטר. המאפשר את המכשיר להפעיל עבור מחזור אחד לפני טיפולים מבטיח אורך גל האור הכחול ואת irradiance יהיו עקביים לאורך כל השלב photoactivation.
2. להשתמש photometer כדי למדוד irradiance על פני התא. אחידות irradiance אור כחול על פני התא צריך להיות mW/cm 10². המרחק בין האור בתאים ייתכן שתצטרך להיות מותאם כדי להשיג של irradiance של 10 mW/cm² בהתאם האינטנסיביות של מקור האור.
3. במקום 0, 0.5, 1 ו- 2 מ מ קבוצות הטיפול ALA על משטח שחור תחת מקור האור הכחול. להאיר את התאים עם אור כחול 1,000 s (16 דקות ו-40 s) עבור הכשרון הכולל של J/cm 10². בעקבות photoactivation אור כחול, התאים הם מוכן לניתוח.

4. איסוף של צביעת

1. להכין מאגר זרימה לפי הנחיות יצרן (ראה טבלה של חומרים).
2. האחות תרבות בינוני והתאים לשטוף עם 2 מ"ל ל- PBS.
3. להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ולאפשר לתאים לנתק למשך כ 3 עד 5 דקות. התאים עשויים לבדוק תחת מיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק התא.
4. להוסיף 1 מ"ל של תרבות בינוני (או PBS) עם 10% עוברית סרום שור לבטל את הפעלתה של טריפסין.
5. לאסוף את ההשעיה תא לתוך צינורות זרימה שכותרתו מ.
6. ספין מ ל צינור זרימה ומפרידה ב 201 x g עבור 5 דק וביופסיה פתרון מבלי להסיר תא גלולה.
7. להוסיף 200 µL מאגר זרימה עם annexin V מצומדת נוגדנים (1 µL של annexin v לכל µL 39 מאגר זרימה) כל דגימה.
8. Resuspend התאים ולמקם בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂) במשך 20 דקות לאפשר annexin V מחייב.
9. 3 µL של 7-מ להוסיף כל דגימה. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.

5. ניתוח Cytometric תזרים

1. בצע זרימת cytometer הנחיות יצרן הקמה (ראה טבלה של חומרים).
2. לאסוף ולנתח דגימות עם cytometry זרימה. ¹³
3. לבצע השוואה סטטיסטית של טיפול וקבוצות שליטה באמצעות ניתוח השונות (ANOVA)¹⁴. להשוות את האמצעים של קבוצות טיפול כדי הממוצע של הפקד עם המבחן של Dunnett לצורך ניתוח פוסט הוק .

תוצאות

לאחר SCC-13 היו תאי הדגירה למשך 30 דקות עם 0, 0.5, 1, 2 מ מ 5-ALA, מוקרן עם 1,000 s של כחול בהיר, הייתה עלייה למינון של אפופטוזיס תא. סה כ אפופטוזיס (זאת אומרת ± לשגיאה הסטנדרטית של ממוצע) היתה 3.94 ± 0.34, ± 7.90 0.52, 23.86 ± 0.52 ולאחר 38.33 ± 1.81 לאחר 30 דקות של דגירה עם 0, 0.5, 1, 2 מ מ 5-ALA, בהתאמה, ו- 1000 שניות של כחול בהיר (איור 1). אנחנו לעומת האחוז אכזרי של מוות תאים בין 0, 0.5, 1, וקבוצות 2 מ מ 5-ALA מתפשט באמצעות ANOVA. תאים שטופלו 1 ו- 2 מ מ 5-ALA הייתה עלייה משמעותית אפופטוזיס תא לעומת 0 מ מ 5-ALA תאים שטופלו. איור 2A מראה זרימה נציג cytometric gating של פיזור קדמי (FSC) לעומת הצד פיזור (האס) עבור תאים SCC-13 מודגרות עם 0, 0.5, 1, 2 מ מ 5-ALA. מעגל gating יקיף את האוכלוסייה תא SCC-13. את הניסוי הזה, אירועים 7500 שנאספו, השער אוכלוסיית תאים SCC-13 שנתפסו לפחות 90% מהאירועים. איור 2B מציג מגרש נציג של 7-מ על ה-x וציר annexin V בציר ה-y. האוכלוסיות תא הן פיקוח לתוך ארבעת הרבעים (Q1 עד ש4) להפלות בתאים אפופטוטיים להיפגע. Q1 (גבוהה annexin v, נמוכה 7-מ) מייצג תאים עוברים אפופטוזיס מוקדם. Q2 (גבוהה גבוהה, annexin v 7-מ) לייצוג תאים שעברו אפופטוזה מאוחר או נמק. Q3 (נמוך annexin v, גבוהה 7-מ) מייצג תאים שעברו נמק. Q4 (נמוך annexin v, נמוכה 7-מ) מייצג תאים לא עוברת אפופטוזיס או נמק. כדי לחשב את אחוז התאים עוברים אפופטוזיס, הוספנו את האחוז של תאים ב- Q1 ו- Q2. חוסר עקביות אורך תקופת הדגירה 5-ALA, בטמפרטורת דגירה או photoactivation הקרנה במינון עשוי לשנות PDT היעילות. איור 3 מדגים נציג annexin V ו- 7-מ זרימת cytometric מגרש כאשר הטמפרטורה הדגירה מגוונת (קרי, 27, 36 או 42 ° C). היה גידול תלוי טמפרטורה אפופטוזיס.

איור 1: למינון עלייה אפופטוזיס לאחר שלושים דקות דגירה של 5-ALA. 5-ALA מודגרות ב 36 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחריו 1,000 s של אור כחול בתאים SCC-13. העמודות מייצגות ממוצע אחוז annexin V חיובי תאים כל טיפול וכל קבוצת הביקורת. הניסויים בוצעו שהפקידים טכני. מובהקות סטטיסטית נקבע על ידי ANOVA, עם p < 0.05 מסומן על ידי כוכבית (*). קווי שגיאה לייצג זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: מגרשים נציג Cytometry זרימה. (א) נציג פיזור קדימה לעומת הצד פיזור cytometry מגרשים ב יחידות שרירותי (AU) עבור x - ו y ציר עבור 0, 0.5, 1 ו- 2 מ מ 5-ALA מודגרות תאים. את הניסוי הזה, אירועים 7500 שנאספו, השער אוכלוסיית תאים SCC-13 שנתפסו 90% מהאירועים. (B) נציג annexin V לעומת 7-מ cytometry זרימה חלקות ב AU עבור x - ו y ציר עבור 0, 0.5, 1 ו- 2 מ מ 5-ALA מודגרות תאים. ש1: בתאים אפופטוטיים להיפגע מוקדם, Q2: בתאים אפופטוטיים להיפגע/נמק מאוחר, Q3: תאים עם נמק, ו- Q4: התאים קיימא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: המקננת 5-ALA בטמפרטורות שונות עשוי לשנות היעילות PDT. נציג annexin V לעומת cytometry זרימה 7-מ מגרשים ב AU עבור x - ו y ציר עבור תאים SCC-13 מודגרות עם 0.5 מ מ 5-ALA-27, 36 ו- 42 ° C. ש1: בתאים אפופטוטיים להיפגע מוקדם, Q2: בתאים אפופטוטיים להיפגע/נמק מאוחר, Q3: תאים עם נמק, ו- Q4: התאים קיימא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

היה גידול משמעותי אפופטוזיס SCC-13 בעקבות 30 דקות incubations של 0.5, 1 ו- 2 מ מ 5 עלא ואחריהם 1,000 s של אור כחול. תוצאות אלה הן בקנה אחד עם המחקר שלנו שפורסמו בעבר הוכחת כי 5-ALA incubations של 30 דקות ואחריו הפעלה אור כחול מוביל לעלייה למינון באחוזים של תאי פיברובלסט שעברו אפופטוזה^{12, 14}.

זו גישה נסיונית כדי PDT לומד יש יתרונות ומגבלות. השיטות שתואר לציית הקלינית כפי PS זמינים מסחרית ושימשו מקור האור. חוקרים רשאים להתאים אישית את השיטות עם סוגי תאים שונים, PSs, מקורות אור ופרמטרים הקרנה. עם זאת, קיימות מגבלות גישה זו כמו פרוטוקול זה תוכנן עבור תאים חסיד תרבותי ב טפט. באימון קליניים, הבדלים רקמות פתולוגיה אדריכלות או מחלה (קרי, hyperkeratosis או פיברוזיס) עשויה להקטין PS הקליטה או אור חדירה¹⁵. כתוצאה מכך, הטיפול במינונים של ממצאי הניסוי לא ישירות יתאימו ל הקלינית. ספרואיד הגידול מודלים, microfluidic שבב נחקרו כפעולות להשתכפל יותר מקרוב את הגידול microenvironments^16,17,18. Spheroids יש נישות הסלולר הפנימיים והחיצוניים עשויים לשלב את photosensitizers באופן שונה, מייצגים גידול הטרוגנית אדריכלות. חוקרים אחרים השתמשו microfluidic צ'יפס על המסך טיפול תנאי ומסירת כלי הדם photosensitizers. עם זאת, צ'יפס microfluidic עשוי להיות יקר לפתח או קשה ליישום עבור חוקרים לא מוכר עם הטכניקה. יתר על כן, spheroids וצ'יפס microfluidic אינן משקפות בהכרח הטיפול הקליני של סרטן העור שבו photosensitizers מוחלים ישירות אל פני השטח הגידול ללא כלי דם הפצתו. חוקרים, ייתכן שיהיה עליך להעריך את היתרונות והחסרונות של טפט תרבות, ספרואיד הגידול מודלים microfluidic צ'יפס עבור לימוד PDT במערכות מחלות שונות. כפי אין תאים חיסוניים או מטריצה חוץ-תאית, אין אפשרות לקבוע כיצד PDT משפיע על תאים תאים מורכבים אינטראקציות. חוקרים, ייתכן שיהיה עליך לאשר במבחנה תוצאות ניסויי באמצעות מודלים של ניסויים קליניים. כדי להשיג תוקף הבין-המבחן גבוהה, חשוב לשמור על דגירה עקבי ופרמטרים אור בעת ביצוע ניסויים במבחנה PDT.

הטמפרטורה ידועה לשנות את היעילות של PDT¹⁹. מחקר אחד הוכיח כי מוות של תאים, ספיגת 5-ALA, היווצרות PP-IX, ושחרור ציטוקינים עשוי להיות מוגברת על ידי המקננת תאים עם 5-ALA בטמפרטורות עד 44 ° C¹⁹. הדגירה טמפרטורות מעל 44 ° C עלולה להוביל מוות תאי המושרה תרמי, דגירה בטמפרטורה שמתחת 20 ° C עלולה להוביל לא משמעותי ספיגת 5-ALA והצטברות¹⁹. אנו ממליצים כי החוקרים לבצע PS incubations על בלוק חימום הטמפרטורה-מתכווננת בטמפרטורה קבועה לפקד עבור פוטנציאל משתנה מתערב מהשפעות תרמיות. בנוסף, חשוב תקופת דגירה של פוטוסנסיטייזר של כמות מספקת של זמן כדי לאפשר ההמרה של 5-ALA לתוך PP-IX. ב פרוטוקול זה, SCC-13 תאים היו מודגרות עם 5-ALA למשך 30 דקות, אשר בהצלחה המושרה תא אפופטוזיס. בעבר הראו כי דגירה 10 דקות של 5-ALA לא להגביר באופן משמעותי אפופטוזיס פיברובלסט לעומת שליטה שאינו מטופל fibroblasts^11,14. PP-IX מתחיל לצבור בעור העכבר לאחר 5-ALA היא המקננת במשך שש דקות ב 37 º C. לכן, אחרי עשר דקות של דגירה 5-ALA, ייתכן שאין מספיק הצטברות PP-IX לזירוז תא אפופטוזיס²⁰. אנו ממליצים על תקופת הדגירה מינימום 20-30 דקות במשך 5-ALA בהתבסס על שלנו^11,הקודם מחקרים¹⁴. חוקרים, ייתכן שיהיה צורך לייעל את תקופת דגירה בהתבסס על המעבדה הגדרת, פוטוסנסיטייזר של ריבית, סוג התא אינדיקציה קלינית. ניתן לבצע ניסויים טיטור ואופטימיזציה נוגדן לקבלת התוצאות הטובות ביותר באמצעות הנחיות היצרנים. ניתן לבצע מבחני אחרים עניין בעקבות photoactivation אור כחול, כולל dihydroethidium זרימה cytometric כימות של ROS. ¹⁴

וריאציה אור נמסר לכל יחידת שטח (קרי, irradiance), הכולל הקרנה במינון (קרי, הכשרון) במהלך השלב photoactivation עלול להשפיע על היווצרות ROS ו תא אפופטוזיס²¹. היחסים בין הכשרון, irradiance ושעה יכולה להיות מתוארת באמצעות המשוואה הבאה:

הכשרון (J/cm²) = Irradiance (W/cm²) x זמן (s)

כמו הכשרון הוא תלוי זמן, הארכה או קיצור שלבי photoactivation עשויים להשתנות יעילות הטיפול. אחידות irradiance הוא יחסי מרחק בריבוע בין מקור האור את רקמת המטרה. כתוצאה מכך, אם האור הוא רחוק מדי, ייתכן שאין מספיק אנרגיית האור נמסר רקמות ייעודיים כדי לעורר PS.. לחלופין, אחידות irradiance עלולה להיות מוגברת על ידי אור המשקף הנחה המשטחים שמסביב. לכן, אנו ממליצים ביצוע irradiations אור עם הצלחות תרבות תא מניחים על משטח שחור כדי למנוע השתקפות אור. חוקרים עשויה לרכוש מסחרית זמינים או שאושרו על-ידי ה-FDA כחול דיודות פולטות אור והתקנים פלורסנט להשתמש בניסויים PDT, אך התקנים אלה ייתכן פלטים כוח שונים, שדה אור אחידות. Photometer גל ספציפי אמור לשמש כדי למדוד את irradiance תא השטח, אחידות של השדה אור לפני בכל ניסוי עבור תוצאות עקביות. ניתן להשתמש מפזר זמינים מסחרית כדי לשפר את שדה אחידות, במידת הצורך.

לסיכום, תארנו במבחנה גישה חוקרת PDT לפי המפרט את התיאוריה, שיטות נסיוניות, מגבלות, מוקשים פוטנציאליים והמלצות עבור אופטימיזציה. PDT הוא שמחקר בהליך ו במבחנה קליני שימושי עשוי לאפשר פיתוח PSs הרומן, אופטימיזציה של פרוטוקולים, סימנים חדשים עבור PDT.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte serum free medium	Thermofisher	17005042	Culture medium for SSC-13 cells
DMEM low glucose glutamax	Thermofisher	10567022	Possible culture medium for other cell types
6-well culture plates	Thermofisher	720083
PBS	Thermofisher	14190250
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher	25200056
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermofisher	15250061	For cell counting and plating
BLU-U light	DUSA	Request from manufacturer	Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used
5-ALA	DUSA	Request from manufacturer
FBS	Atlanta Biologicals	C17032
FlowCellect Annexin Red Kit	Millipore Sigma	FCCH100108	Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer
FACSCanto II	BD	Request from manufacturer	Any flow cytometer may be used
Counting Chamber	Hausser	3120	For cell counting and plating
FlowJo	FlowJo	Request from manufacturer	Flow cytometry analysis software