שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקולי האימות גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 כמטרה סמים בלוקמיה באמצעות העכבר גנטי, humanized במבחנה ויוו מודלים. בשיטה זו ניתן ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

Abstract

ההדגמה של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) בטיפול לוקמיה מיאלואידית כרונית (CML) יש בישרה עידן חדש ותרופות לסרטן. עם זאת, אוכלוסיה קטנה של תאים אינו מגיב לטיפול TKI, והתוצאה היא מחלה שיורית מינימלית (MRD); אפילו הכי חזק TKIs להיכשל כדי למגר תאים אלה. תאים אלה MRD לשמש מאגר לפתח עמידות לטיפול. למה TKI הטיפול אינו יעיל נגד MRD תאים לא ידוע. גורם הגדילה איתות הייתה שם בתמיכה ההישרדות של MRD תאים במהלך הטיפול TKI, אך הבנה מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו c מוגברות-פוס ואת הביטוי Dusp1 כתוצאה מתכנסת oncogenic פקטורי גדילה איתות בתאים MRD לתווך TKI ההתנגדות. עיכוב גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 מעבד לוקמיה מיאלואידית כרונית רגישים להפליא TKIs ומרפא CML בשני המודלים העכבר humanized גנטי. זוהו הגנים האלה היעד באמצעות מיקרו-מערכים מרובים TKI רגיש ותאים עמידים. כאן, אנו מספקים שיטות אימות היעד באמצעות העכבר במבחנה ויוו מודלים. שיטות אלה ניתן בקלות ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

Introduction

פעילות קינאז טירוזין המכונן של BCR-ABL1 פיוז'ן אונקוגן גורמת CML, אשר מהווה הרציונל למקד את פעילות קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנה. ההצלחה של TKIs בטיפול בחולי CML מהפכה הקונספט של טיפול ממוקד^1,2. לאחר מכן, טיפול אנטי-קינאז כתרופה דיוק פותחה עבור מספר ממאירויות אחרות, כולל גידולים מוצקים. עד כה, מעכבי קינאז יותר משלושים אושרו על ידי ה יונייטד המדינה-FDA לטיפול גידולים ממאירים שונים. בעוד TKI טיפול יעיל מאוד בדיכוי המחלה, זה לא מרפא. חוץ מזה, אוכלוסיה קטנה של תאים סרטניים נמשכת במהלך הטיפול:^4,3,MRD⁵. אפילו חולים אשר הראו הפוגה מלאה נשארים עם MRD, אשר בסופו של דבר התוצאות ב- relapse אם לא באופן רציף מודחקים. לכן, מיגור של MRD תאים נדרש כדי להשיג היענות עמיד או ריפוי. לוקמיה מיאלואידית כרונית מייצג פרדיגמה ערך להגדרת המושג דיוק רפואה, מנגנונים של oncogenesis, הרפוי רציונלי מכוון מטרה, התקדמות המחלה תרופתיים. עם זאת, גם היום, מנגנון נהיגה מוות תאי TKI-induced בתאי סרטן אינה מובנת במלואה, ולא למה תאים MRD (המורכב של תאי גזע לוקמיה [LSCs]) עמידים ממהותם^4,TKIs⁶. למרות זאת, התופעה של "תלות אונקוגן" כדי oncoprotein קינאז מוטציה הוא בהפרות יעילות TKI איפה עיכוב חריפה של יישוב אונקוגן מאת TKIs גורם מכת oncogenic שמוביל מסיבי proapoptotic תגובה או תרדמה בתא באופן תלוי-ההקשר^6,7,8,9. עם זאת, בהתפשטות אונקוגן התלות מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה לסבך כי גורם הגדילה איתות abrogates אונקוגן התלות, כתוצאה מכך מקנה עמידות TKI טיפול^10,11,12. לכן, כדי לזכות בתובנה המנגנון של אונקוגן התלות, ביצענו הגנום כולו ביטוי פרופיל של BCR-ABL1 מכורים ותאים nonaddicted (גדל עם גורמי גדילה), אשר גילה ש- c-פוס ו Dusp1 הם מתווכים קריטי של אונקוגן התמכרות¹³. המחיקה גנטי של c-פוס, Dusp1 תאים קטלניים BCR-ABL1-ולהבעת סינתטי, העכברים המשמשים את הניסוי לא לפתח לוקמיה. יתר על כן, עיכוב של c-פוס, DUSP1 על ידי מעכבי מולקולה קטנה נרפא BCR-ABL1-induced CML בעכברים. התוצאות מציגות רמות הביטוי של c-פוס, Dusp1 להגדיר את סף מוות של תאים סרטניים, כזה כי רמות נמוכות יותר להתייעץ סמים רגישות בעוד רמות גבוהות יותר לגרום התנגדות טיפול¹³.

כדי לזהות את הגנים נהיגה התלות אונקוגן, ביצענו כמה הביטוי הגנום כולו פרופיל ניסויים בנוכחות גורם הגדילה של TKI (imatinib) באמצעות העכבר - והן תאים נגזר חולה CML (K562). נתונים אלה נותחו במקביל עם ערכות נתונים חולה CML המתקבל CD34⁺ hematopoietic תאי גזע לפני ואחרי הטיפול בעזרת imatinib. ניתוח זה חשף בשלושה גנים (גורם שעתוק [c-פוס], ירידה לפרטים כפול פוספטאז 1 [Dusp1], ולא של RNA-מחייב חלבון [Zfp36]) אשר הם בדרך כלל upregulated תאים עמידים TKI. כדי לאמת את המשמעות של גנים אלו משוחח עמידות לתרופות, אנחנו ביצעו ניתוח במבחנה , ויוו צעד אחר צעד. רמות ביטוי של גנים אלה שאושרו על-ידי qPCR בזמן אמת (RT-qPCR), סופג המערבי תאים עמידים לתרופות. יתר על כן, ביטוי cDNA של נוקאאוט מאת shRNA סיכות של c-פוס, Dusp1, Zfp36 גילה כי c מוגברות-פוס וביטויים Dusp1 הם מספיק והכרחי להיוועץ TKI ההתנגדות. לכן, אנו לבצע אימות ויוו באמצעות העכבר מודלים עם c-פוס Dusp1 בלבד. לשם אימות גנטי של c-פוס, Dusp1, אנו נוצר c-פוס^{חליל/חליל} ROSACreERT-inducible עכברים (מותנה נוקאאוט)¹⁴ , חצה אותם עם Dusp1^{- / -} (ישר נוקאאוט)¹⁵ כדי להפוך ROSACreERT2-c-פוס^{חליל/חליל} Dusp1^{- / -} העכברים הטרנסגניים-כפול. תאי מח עצם-derived c-Kit⁺ (מ- c-פוס^{חליל/חליל}-, Dusp1^{- / -}-, ו- c-פוס^{חליל/חליל}Dusp1^{- / -}) המבטאת BCR-ABL1 היו שנותחה במבחנה המושבה יוצרי assay יחידה (CFU), ו . ב ויוו על ידי השתלת מח עצם בעכברים אולם לקרינה, כדי לבדוק את הדרישה של c-פוס, Dusp1 לבד או יחד בפיתוח לוקמיה. באופן דומה, העכבות כימי של c-פוס DFC (difluorinated כורכומין)¹⁶ , Dusp1 על ידי BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)¹⁷ נבדקו במבחנה, ויוו באמצעות BCR-ABL1-המבטאת עצם תאי מח-derived c-Kit⁺ מן העכבר (WT) פראי-סוג. כדי לאשר את הדרישה של c-פוס, Dusp1 בתאי גזע לוקמיה, אנחנו מנוצל דגם העכבר CML איפה BCR-ABL1 היה במיוחד שנגזרות בתאי גזע שלו דוקסיציקלין (ט-transactivator מבטא תחת מאתר תאי לוקמיה (SCL) הגן 3' משפר... תקנה)^18,19. השתמשנו מח עצם לין^–סרוק⁺c-Kit⁺ (LSK) תאים מחלון אלו עכברים ב וזמינותו השתלת ויוו. יתר על כן, הקמנו phopsho-p38 רמות, הביטוי של IL-6 כמו דינמי-טוהר הפרמה קופ סמנים ביולוגיים עבור Dusp1 וניגוד c-פוס, בהתאמה, ויוו. לבסוף, כדי להרחיב את המחקר עבור רלוונטיות האדם, נגזר החולה CD34⁺ תאים (המקביל בתאי c-Kit⁺ של עכברים) היו כלפיהן לטווח ארוך במבחנה. מתחילה תרבות תא מבחני (LTCIC) ומודל העכבר humanized ויוו של לוקמיה מיאלואידית כרונית^20,21. העכברים immunodeficient הושתלו עם לוקמיה מיאלואידית כרונית CD34 + תאי, ולאחריו הטיפול בתרופה וניתוח של הישרדות cell לוקמיה אנושי.

בפרויקט זה, אנו מפתחים שיטות זיהוי המטרה והאימותים באמצעות כלים גנטיים והן כימית, שימוש במודלים פרה שונה. שיטות אלה ניתן להחיל בהצלחה כדי לאמת את מטרות נוספות לפתח שיטות כימיות לפיתוח טיפולית.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם לקווים המנחים של טיפול בעלי חיים מוסדיים ושל שימוש הוועדה (IACUC) ב חולים רפואי במרכז (CCHMC סינסינטי ילדים). דגימות אנושי (מוניטור רגיל וזה מ לוקמיה מיאלואידית כרונית (p210-BCR-ABL +) לוקמיה) התקבלו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על-ידי ועדה מוסדית (מוסדיים המנהלים: Federalwide אבטחת #00002988 לילדים בסינסינטי מרכז רפואי בית חולים), הסכמה הודיע התורם CCHMC, באוניברסיטת סינסינטי.

1. בזמן אמת qPCR ניתוח

1. בודד הכולל RNA מתאי BaF3 גדל RPMI בתוספת 10% FBS ו-10% בינוני תרבות ה-וואי בילה כמקור של אינטרלוקין-3 (IL-3).
2. לקצור את התאים בשלב לוגריתמי (99% בחיים) שטופלו (IL-3 ו- imatinib) אך גם מדגימות לא מטופל, centrifuge אותם ב x 435 g למשך 3 דקות. את הבריאות, את שלבי הצמיחה של התאים הם קריטיים כמו שלהם ביטוי גנים פרופילים יכולים לשנות באופן דרמטי.
3. לבודד RNA וטיהור RNA סה כ²². לכמת את הרנ א הכולל; לאחר מכן, נושא זה טיפול DNase²³. המרת כמויות שוות של RNA DNA חופשי (2 µg) כדי cDNA עם רוורס טרנסקריפטאז²⁴.
4. לבצע qPCRs עם תחל הגן הספציפי (טבלה 1). לבצע את מותני בתגובות µL 20 ב- 0.2 מ"ל, המבחנות דקות קיר עם אותיות אופטי, באמצעות פולימראז 1 x לערבב (ראה טבלה של חומרים), 0.5 מיקרומטר של כל פריימר, µL 1 של ה-DNA, ומים. הכנס את התגובה thermocycler עם מחזור הבא: שלב 1, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; בשלב 2, 95 ° C 15 s; שלב 3 ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה; בשלב 4, חזור על שלבים 2-3 40 פעמים. לבצע כל מותני ב- triplicates, לנרמל את הנתונים בזמן אמת לביטוי β-אקטין לפני מזימות.

2. המערבי סופג

הערה: כל תא תמציות הוכנו על-ידי הוספת µL 250 1 x פירוק מאגר כפי שמתואר Kesarwani et al.¹³ שיושלם עם מעכב פרוטאז קוקטיילים וחדר פוספטאז מעכב 2 קוקטיילים.

1. קציר חמישה מיליון תאים BaF3 בשלב לוגריתמי (99% חי) של מטופלים (IL-3 ו- imatinib), כמו גם של לא מטופל BaF3 תאים על ידי צנטריפוגה ב x 435 g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. Lyse התאים במאגר של פירוק (250 µL) על ידי pipetting למעלה ולמטה x 1, ואחריו דגירה 5 דקות ב- 80 מעלות צלזיוס. Sonicate lysate לשבור את כל ה-DNA עם 5-6 פולסים של 5 s בחדר קר ב- 4 מעלות צלזיוס.
2. להעביר את lysate צינור 1.5 mL, centrifuge אותו ב- 16,000 x g עבור 5 דקות כדי להסיר את כל חומר לא מסיסים. ניתן לאחסן את התמצית ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. דוגמאות חום עד 80 ° C עבור 5 דקות בתוך גוש חום לפני הטעינה. לטעון µL 10 המדגם באמצעות טיפ ג'ל העמסה על ג'ל מרחביות-דף 10%.
3. לפתור את החלבונים ב-150 V עד הפניה לצבוע מגיע לתחתית של הג'ל. להעביר את החלבון לממברנות ניטרוצלולוזה על ידי העברה electrophoretic-1 אמפר לשעה. לאחר המעבר, לחסום את הקרומים 1 x באגירה טריס תמיסת מלח + 0.1% Tween 20 (TBST) עם 5% חלב דל שומן 1 h, בדיקה בין לילה ב 4 ° C עם נוגדנים המתאימים לדילול 1:1,000.
4. לשטוף את הקרומים 3 x ל x 5 עם TBST למשך 10 דקות כל; לאחר מכן, בדיקה עם מצומדת HRP המתאים משני נוגדן (1:5, 000 דילול) בטמפרטורת החדר מאובטח. כמות TBST נעשה שימוש תלויה בגודל מיכל. ודא ומטביעים את הקרום ב TBST לחלוטין. לשטוף את הנוגדן משני 3 x עבור חמש דקות כל אחד עם TBST.
5. לפתח את האבן החשופה באמצעות המצע chemiluminescent מגיב. מערבבים נפחים שווים של המצע, המאגר של שני בקבוקים, ממש לפני השימוש. הוסף את המצע העליונה של קרום לכסות את הקרום כל עם פיפטה 1 מ"ל ולאחר תקופת דגירה של 1 דקות. שהכלים צריך לדימות בתוך 1 – 10 דקות להוסיף את המצע.
6. בעזרת מלקחיים בוטה, בזהירות המקום הקרום על הפלטפורמה של מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים), הימנעות הרבה של הנוזל. בחר תצוגה חיה ובחרו שהכלים ו chemiluminiscence ' מתפריט '. באמצעות רכישת ידנית, רוכשים חשיפות מרובות בנקודות זמן שונות. קבצים אלה ניתן לאבחן, לכמת באמצעות תוכנת הדמיה.

3. הדור של עכברים נוקאאוט

1. לחצות c-פוס^{חליל/חליל} עכברים עם עכברים ROSACreERT2 ליצירת ROSACreERT2c-פוס-^{חליל/חליל} -עכברים-¹³. כדי ליצור העכברים (KO) כפול-נוק אאוט, גזע ROSACreERT2c-פוס^{חליל/חליל} עכברים עם עכברים^{- / -} Dusp1 ליצירת ROSACreERT2c-פוס^{חליל/חליל} Dusp1^{- / -} עכברים¹³. גנוטיפ העכברים מאת הזנב קליפים ואחריו PCR, כמתואר להלן.
2. Genotyping:
   1. כדי להכין את ה-DNA, קליפ חלק זעיר של הזנב עם מספריים והכניס אותו לתוך צינור 1.5 מ. לצרוב את הזנב עם מספריים מחוממת. להוסיף 200 µL של 50 מ מ NaOH זנב חתוך בצינור, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום עבור 1 h.
   2. מערבולת הצינור טוב ולנטרל, לאחר מכן, על-ידי הוספת 50 µL של טריס M HCl 1 pH 6.8 ו מערבולת שוב. Centrifuge את הצינור במהירות המרבית עבור 1 דקות.
   3. לבצע את מותני ב 20 תגובות µL ב 0.2 מ"ל, קיר דק את המבחנות התקן באמצעות 1 x Taq פולימראז בסיס תמהיל המכילים צבען, 0.5 מיקרומטר של כל פריימר, µL 1 של ה-DNA, ומים. למקם את הצינורות thermocycler ולהפעיל את מחזורי המתאים כפי שמוצג בטבלה מס ' 2.
   4. להפעיל את המוצר PCR על 2% agarose ג'ל ותמונה באמצעות מערכת תיעוד ג'ל.

4. בידוד תאי c-Kit⁺ של מח העצם

1. להקריב את העכברים בהתאם להנחיות מוסדיים.
   הערה: כאן, העכברים נחשפו פחמן דו-חמצני (CO₂) ב לפי AVMA מומלץ קצב הזרימה עד מותו נקבע על ידי הפסקת נשימה, פעימות הלב, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
2. לקצור את הרגלעצמות מן העכבר — שתי עצמות הירך, שני tibias, שני iliacs. תנקה כל רקמות העצמות על ידי שחיקה עם אזמל. הכניסו את עצמות הרגל PBS קר 1 x על קרח – 5 מ ל צינור 15 מ"ל. שופכים את תכולת השפופרת לתוך מרגמה ולרסק אותו עם כבעלי.
3. סינון התליה תא דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור פקקי בורג 50 מ עם פיפטה 10 מ"ל מצורפים, באמצעות פיפטה. לשטוף את עלי ומכתש מספר פעמים עם PBS קר 1 x, איסוף של הוספת תא ההשעיה הצינור 50 מ. ספין למטה מח העצם ב x 1,200 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. הסר supernatant באמצעות ואקום עם פיפטה מזכוכית מצורף. להשעות בגדר תא ב 5 מ של PBS x 1 עם פיפטה.
4. עם פיפטה, להוסיף לאט מח עצם מושעה לחלק העליון של 5 מיליליטר בטמפרטורת החדר (הטמפרטורה היא קריטית) polysucrose, מטפל מעולה שלא להפריע את הממשק. ספין-x 400 g בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות עם הבלמים כבוי.
5. לאסוף את הממשק מעונן תא מונו-גרעיני הכולל (TMNC) עם פיפטה והכניס אותו לתוך צינור 15 מ"ל. . תביא את אמצעי האחסון עד כדי 10 מ"ל עם 1 x PBS בשביל הכביסה, לוקח 20 µL עבור ספירה, ו ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להשליך תגובת שיקוע ולשמור בגדר בקרח עבור שלב 4.6.1.
6. לבצע c-Kit⁺ תא בידוד.
   1. בצע נוהל ערכת microbead עבור c-ערכת⁺ תא בידוד. Resuspend בגדר תא ב- 80 µL של PBS 1 x + EDTA + BSA 10⁷ תאים. כדי התליה תא, להוסיף µL 20 CD117 גרגרי/10⁷ תאים הכולל. מערבבים היטב בעזרת vortexing, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס. להביא את אמצעי האחסון עד 10 מ"ל על-ידי הוספת 1 x PBS + EDTA + BSA ו ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   2. הסר את תגובת שיקוע באמצעות ואקום, להשעות בגדר התא בתאים 500 µL/10⁸ סה כ 1 x PBS + EDTA BSA. שימוש הדוכן מגנט עם העמודה מגנטי מצורפים, להוסיף 3 מ"ל של 1 x PBS + EDTA + BSA ולאפשר לזרום דרך באמצעות כוח המשיכה לתוך צינור אוסף 15 מ"ל.
   3. לאחר התוספת המאגר הראשון סיימה העוברים דרך העמודה, להוסיף התליה תא העמודה, ומאפשרת לזרום דרך באמצעות הכבידה לתוך הצינור אוסף 15 מ"ל. Flowthrough הזה הוא השבר תאים לא רצויים.
   4. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם PBS 1 x 3 מ"ל + EDTA BSA בכל פעם, ומאפשרת לזרום דרך באמצעות הכבידה לתוך הצינור אוסף. הסר את העמודה המגנט ומניחים על החלק העליון של צינור 15 מ"ל.
   5. הוסף 5 מ של 1 x PBS + EDTA + BSA, מיד לשטוף את זה עם הבוכנה סיפק את העמודה. להסיר את הבוכנה וחזור את הסומק עם אוטם 5 נוספים של 1 x PBS + EDTA + BSA. לספור את תאי האחסון הכולל שימוש בשיטות הרגילות.
   6. ספין למטה התאים ב x 1,200 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. הסר תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב IMDM מלאה (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] + FLT3 ליגנד [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) לתרבות. התרבות שתאים אלה לינה 2 x 10⁶ תאים/1 מ"ל של תא IMDM מדיה מלאה על-ידי הצבתם באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO₂.

5. התמרה חושית

1. פלסמיד retroviral תרביות תאים
   1. טרי הפשרת תאים HEK293 אחר הצהריים לפני באמבט מים מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס. לסובב cryotube המכילות את התאים HEK ב x 435 g בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות להסיר את supernatant באמצעות ואקום, להשהות בגדר תא ב 1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין, גלוטמין.
   2. לספור את התאים ולהוסיף את העוצמה המתאימה צלחת 10 ס מ מטופלים (~ 4 x 10 תאים⁶ HEK293T). להוסיף 14 מ של התקשורת DMEM 10 למנה ולערבב אותה היטב על ידי הזזה למעלה ולמטה על חלוקה שוויונית. מקם את המנה 37 ° C, 5% CO₂ מגשים בן לילה.
   3. למחרת בבוקר, לבדוק את המפגש של התאים תחת מיקרוסקופ אור הפוך (50% או יותר עובד טוב).
   4. לשלב את ה-DNA (פלסמיד retroviral הרצוי), PclEco (אריזה פלסמיד), 2 מ' CaCl₂ו- H₂0 צינור 1.5 מ ל (= 500 µL) באמצעות micropipette הסכומים הבאים: 7.5 µg של ה-DNA (BCR-ABL1-YFP), 7.5 µg של pCLeco, µL 62 של 2 M CaCl₂ , ומים כדי נפח סופי של 500 500 להוסיף µL µL. של x HBS 2 כדי עוד צינור 1.5 מ ל.
   5. תוך כדי ערבוב, מוסיפים ה-DNA dropwise להתערבב הצינור 1.5 mL המכיל 500 µL של x HBS 2 (280 ממ NaCl, 100 מ מ HEPES ו- 1.5 מ מ נה₂HPO₄). להשיג זאת על-ידי הגדרת מערבולת המהירות הנמוכה ביותר והחזק את הצינור HBS על זה עבור ערבוב מתמיד תוך הוספת המיקס תרביות תאים.
   6. אפשר לערבב תרביות תאים תקופת דגירה של 20 – 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, להוסיף 25 ננומטר כלורוקין התאים HEK ולמקם אותם בחזרה בחממה. לאחר הדגירה, להוסיף את תערובת תרביות תאים dropwise התאים HEK ו, ואז, בעדינות מערבולת התקשורת לערבב לערבב תרביות תאים ברחבי הבסיס.
   7. דגירה התאים עם המיקס עבור ~ 8 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ מיכלים. שינוי בתקשורת על תאים אלה על-ידי הוספת באיטיות 14 מ"ל של מדיה DMEM 10 טריים. Pipetting לאט הקיר של המנה מסייעת למנוע כל חסינותו של התאים HEK. דגירה התאים לילה ב- C ° 37, 5% CO₂ מיכלים.
   8. לאסוף את תגובת שיקוע נגיפי בעזרת מזרק 10 מ"ל, לצייר את תגובת שיקוע לתוך המזרק, לצרף את המסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. מזנקת על תגובת שיקוע ויראלי לתוך צינור אוסף חדש. לקחת את האוסף הראשון של נגיפי h ~ 16 supernatant מאוחר יותר.
2. ריכוז ויראלי Fibronectin, התמרה חושית
   1. להוסיף 2 מ של קטע fibronectin האנושי רקומביננטי 0.1 מ"ג 1 x PBS ללוחות לא מטופל תרבות 6-. טוב. להכין כמה שיותר fibronectin כנדרש, אשר תלויה במספר של תאים אחרים. אחד טוב יכול מספיק מגלי 10 מיליון תאים c-Kit⁺ . דגירה את הצלחת בן לילה ב 4 º C.
   2. למחרת, הסר את fibronectin הבארות עם פיפטה, פיפטה 2 מ ל BSA סטרילי 2% ב- PBS 1 x כדי לחסום את הצלחת ולאחר תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר על BSA באמצעות ואקום לשטוף ביסודיות על ידי pipetting 2 מ"ל של 1 x PBS ולאחר מכן להסיר אותו באמצעות ואקום.
   3. מיד להוסיף טרי שנאספו ומסונן (ב- 0.45 מיקרומטר) ויראלי עד supernatant מ ל. צנטריפוגה-x 435 g ב- 32 ° C ח' 2 להסיר את supernatant באמצעות ואקום, חזור על שלב זה עם נוספים תגובת שיקוע ויראלית נאסף טרי, ספין שוב. להסיר את supernatant באמצעות ואקום ולשטוף את הבארות על-ידי הוספת 2 מ של 1 x PBS; לאחר מכן, להסיר אותו באמצעות ואקום.
   4. הוסף שהעכבר c-Kit⁺ תאים כי היו בתרבית תוך לילה (שלב 4.6.6) ויראלי לבארות מצופה על ידי ערבוב טוב את המתלים תא, pipetting אותם המשקולת ויראלי fibronectin מרוכז עכשיו. ספין-x 1,200 g ב- 25 ° C במשך 90 דקות מכניסים את התאים 37 ° C, 5% CO₂ מיכלים.
   5. 48 שעות posttransduction, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב x 1,200 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, resuspend אותם במאגר FACS #1 (1 x PBS + 0.5% BSA) כדי 6 x 10⁶/mL. לקבוע את אחוז תאים חיוביים BCR-ABL1 על ידי מדידת אחוז YFP חיובי באמצעות cytometry זרימה.
   6. רוכשים אירועים עם הליך רגיל. ראשית, שער של תאים חיים המבוסס על פיזור קדימה ואת הצד. לאחר מכן, שער של YFP חיובי תאים חיים למעט YFP-negativecells נקבע על ידי שליטה שלילי (איור 4).

6. המושבה יוצרי UnitAssays

1. להפשיר את methylcellulose עם ציטוקינים עבור העכבר בטמפרטורת החדר במשך ה' 1 – 2 Aliquot 3 מ של methylcellulose בשפופרת FACS באמצעות מזרק 5 מ ל לי מחט. למיין התאים YFP-חיוביות על סדרן התא.
2. ספין התאים למטה, להשעות את צניפה בתקשורת מלאה IMDM. לספור את התאים כדי להיות מצופה ו לדלל אותם לקבל YFP-חיובית 5,000, בתאים µL 100 של התקשורת מלאה IMDM.
3. להוסיף 100 µL של התליה תא המכיל את מעכבי המתאים עד 3 מ"ל של methylcellulose והתאים YFP-חיובית 5,000 (ראה טבלה של חומרים). מערבולת גבוה כדי לערבב את הכל עבור s 10 – 30.
4. אחרי רוב האוויר בועות נמלטו, להשתמש מזרק 1 מ"ל צלחת 1 מ"ל של התקשורת שלוש צלחות שכפל 3 ס מ על ידי הוצאת המדיה בצד אחד ואת באיטיות מטה את הצלחת בתנועה סיבובית להפיץ באופן שווה.
5. הריכוז הסופי של כדי להשתמש הם imatinib-מיקרומטר 3, DFC ב 0.2 µM ולאחר BCI-0.5 מיקרומטר, לבד או בשילובים. בכל מקום מתאים, למחוק c-פוס על ידי ציפוי התאים עם 4-hydroxytamoxifen (1 µg/mL) להוסיף את methylcellulose.
6. לאחר ציפוי, לשים את הצלחות צלחת פטרי גדולה עם צלחת פתוחה אחת המכילה 2 מיליליטר מים סטריליים באמצע. מכסה את צלחת פטרי גדולה, דגירה בקפידה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ מיכלים. להקליט את המספרים המושבה אחרי שבוע אחד של ציפוי על ידי ספירת המספר הכולל של מושבות תחת מיקרוסקופ.
7. לנתח כמה מושבות של לוחות המתאים עבור c-פוס מחיקה על-ידי ה-PCR. לאסוף את המושבות על-ידי מציצת אותם עם טיפ P1000. מכך התאים µL 500 ל- PBS 1 x על ידי שטיפת הקצה ב- PBS מספר פעמים. לסובב את המתלים תא ב x 6,000 g עבור 1 דקות, לחלץ את ה-DNA בגדר התא באמצעות ערכת בידוד הדנ א הגנומי.
8. לשימוש ה-DNA גנומי PCR באמצעות תחל mFos-FP3 mFos-RP5, כפי שמתואר בטבלה 2. ניתוח המוצרים PCR agarose 2% ג'ל ותמונה באמצעות מערכת תיעוד ג'ל.
9. עבור מצגת גרפי של המושבות, מכתים את המושבות, באמצעות Iodonitrotetrazolium כלוריד. להמיס 10 מ"ג כלוריד Iodonitrotetrazolium ב- 10 מ"ל של מים כדי להשיג פתרון 1 מ"ג/מ"ל. מסנן לעקר את הפתרון באמצעות מנעול זכוכית עם מסנן 0.2 µm המצורפת מזרק 10 מ"ל בתנאים סטריליים בשכונה תרביות רקמה.
10. בשכונה תרביות רקמה, להוסיף 100 µL של פתרון מוכתמים dropwise סביב הצלחת CFU; יש להיזהר שלא להחליק או להפריע מושבות. דגירה הלוחות לילה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ תא תרבות חממה. המושבות יהפוך אדמדם כהה חום. באמצעות רקע לבן בשכונה תרביות רקמה סטרילי, לצלם תמונות של צלחת CFU מוכתם.

7. השתלת ואת וזמינותו התמותה

1. אולם שקסמה מקרין והעכברים בקרינה מפוצל באמצעות 137 מבוסס-Cs-גמא במינון של 7.0 Gy ואחריו 4.75 Gy (0.5 Gy/דקה), 3 h בנפרד לפני ההשתלה.
2. השתלת 4 x 10⁴ ממוינת YFP-חיוביות (מחושב בהתבסס על אחוז YFP) תאים עם 3 x 10⁵ תאים במח העצם נורמלי כנשא לתוך כל עכבר באמצעות הזנב הווריד הזרקה.
3. אחרי שבוע אחד של השתלת, לקבוע את engraftment על-ידי ניתוח התאים YFP-חיוביות ממחזור הדם ההיקפיים באמצעות FACS.
4. ביצוע של דימום וריד הזנב וניתוח FACS.
   1. חממו את הכלוב של עכברים תחת מנורת חימום עם זהירות לא לחמם יותר מדי או לצרוב אותם.
   2. לרסן את עכבר restrainer העכבר, ניק את הווריד הזנב עם להב סטרילי. בעדינות חלב הזנב מן והשתרשה עמוק בלבה את ישבנה, ומאפשר טיפה דם לצבור. לאסוף את הדם עם צינור קפילרי heparinized עד מלא (לאסוף סביב 75-100 µL). מזנקת הדם מילוי קפילרי ברכבת התחתית אל צינור אוסף דם המכילה EDTA ומערבבים היטב.
   3. Lyse RBCs על-ידי הוספת 30-40 µL של דם 3 מ ל 1 x מאגר של פירוק RBC (150 מ מ אמוניום כלוריד, 10 מ מ אשלגן ביקרבונט ו- 0.13 מ"מ EDTA). מערבבים היטב, היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10-15 דק ספין-1,200 x g ב- 4 ° C 5 דק. להסיר את supernatant באמצעות ואקום, להשעות את צניפה ב 2 מ של PBS x 1 לרחיצה.
   4. ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. הסר תגובת שיקוע, להשעות את זה במאגר FACS #1. לבצע ניתוח FACS כמתואר לעיל בשלב 5.2.5–5.2.66. החנות לטווח קצר הדם שנותרו בצינור האוסף, אשר יכול לשמש למטרות שונות אחרות, ב 4 º C.
5. עכברים המושתלים שהראו 10 – 40% תאים YFP-חיוביים בדם היקפי שימשו את הניסוי. עכברים שהיו פחות מ 2% של תאים YFP-חיוביות לא נכללו במחקר.
6. להכין טמוקסיפן-20 מ"ג/מ"ל שמן תירס ב 60 מעלות צלזיוס עם vortexing לסירוגין עד התפרקה לחלוטין, ואחסן אותו ב 4 ° C בחושך משך זמן הטיפול. לאחר שבוע של השתלת, למחוק אלל c-פוס^{חליל/חליל} באמצעות הזרקת טמוקסיפן (100 מ"ג/ק"ג בשמן תירס) intraperitoneally (i.p.) לתוך העכברים, כל יום במשך שלושה ימים רצופים. חשוב כי העכברים ששקלת כדי לקבוע כמה טמוקסיפן להזריק. לאחר הטיפול טמוקסיפן (במידת הצורך), לקבץ העכברים עבור טיפולים תרופות (n = 5/קבוצה).
7. לפקח על העכברים על התקדמות לוקמיה, הישרדות ולקבוע נטל לוקמיה (תאים YFP-חיוביות על ידי FACS) שבועי עד שמונה שבועות ב הישרדות העכברים.
8. לנתח את הדם למחיקה c-פוס בכל מקום מתאים, כפי שתואר לעיל בסעיף 6. לרשום את מספר עכברים ששרד בכל יום, התווה את עקומת הישרדות בסוף הניסוי באמצעות תוכנה graphing.

8. העכברים הטרנסגניים מודל של לוקמיה BCR-ABL1

1. בידוד LSK
   1. לשמור על העכברים הטרנסגניים Scl-tTA על דוקסילין צ'או כדי למנוע ביטוי של BCR-ABL1. ארבעה שבועות לפני ההשתלה, לקחת את העכברים דוקסיציקלין צ'או לביטוי BCR-ABL1.
   2. לבודד TMNCs מן העכברים הטרנסגניים Scl-tTA כמתואר לעיל בסעיף 4. להשעות את TMNCs במאגר FACS #2 (1 x PBS + 0.5% BSA + 2 מ מ EDTA) כדי לקבל 10⁶ תאים למ"ל.
   3. לרוקן את TMNCs עבור תאים שושלת היוחסין-חיוביות על-ידי הוספת 10 µL של שושלת היוחסין תא זיהוי קוקטייל ביוטין (ביוטין-מצומדת נוגדנים חד-שבטיים כנגד CD5 [עכברוש IgG2a], CD11b [עכברוש IgG2a], CD45R [B220] [עכברוש IgG2a], אנטי-7-4 [חולדה IgG2a], אנטי-Gr-1 [Ly-6G/C, עכברוש IgG2a], ו- Anti-טר-119 [חולדה IgG2b]) לכל עונה 1 פרק 10⁶ תאים. דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בחושך, ולאחריה שטיפה עם 5 מ של מאגר FACS #2, ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע לחלוטין ו להשעות את התאים µL 400 FACS מאגר #2.
   4. להוסיף 5 µL של המספר המשלים נוגדן אנטי ביוטין-FITC, µL 1.2 של Ly-6A/E (Sca1) PECy7 ו- µL 2.4 CD117 (c-Kit) APC נוגדנים עבור עד 10⁸ מיליון תאים. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לשטוף על ידי הבאת אמצעי האחסון עד 5 מ"ל עם FACS מאגר #2; לאחר מכן, צנטריפוגה ב x 1,200 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. הסר תגובת שיקוע, להשעות את צניפה תא ב- 500 µL FACS מאגר #2.
   5. לסנן את המתלים תא לתוך צינור FACS מסנן-כובע כחול.
   6. שער תאים חיים באמצעות פיזור קדימה ואת הצד. לאחר מכן, בחר את התאים לין^– הראה MFI (כלומר עוצמת קרינה פלואורסצנטית פחות מ 10²) כדי לקבל LSK תאים c-Kit⁺ , Sca1⁺ על biexponential מגרש מהאב לין^– , ולמיין אותם (איור 7 C).
   7. איסוף תאים ממוינים, centrifuge אותם ב 1,200 x g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
2. השתלת
   1. אולם שקסמה מקרין עכברים BoyJ עם מינון הקרינה פיצול של 7.0 Gy ואחריו 4.75 Gy לאחר 3 שעות, לפני ההשתלה.
   2. להזריק 3 x 10³ 5 x 10 תאים³ BCR-ABL1-LSK עם 0.3 x 10 תאים במח העצם של המסייע⁶ מ- WT BoyJ עכברים דרך וריד הזנב (עירוי) לתוך העכברים BoyJ לקרינה.
   3. Posttransplantation ארבעה שבועות, לנתח את העכברים הנמען עבור CD45.1 ו- CD45.2. להשיג את TMNC של הדם ההיקפיים הזנב וריד מדממים כפי שמתואר בשלב 7.4. Resuspend תאי µL 100 FACS המאגר. דגירה התאים עם 1 µL כל של הנוגדן CD45.1-FITC ו- CD45.2-PE בטמפרטורת החדר מאובטח.
   4. לשטוף את התאים על ידי הבאת את הווליום עד 3 מ"ל עם מאגר FACS, ספין-x 1,200 g ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע resuspend אותו ב- µL 200 ל- 1 x PBS.
   5. לנתח את האחוזים על CD45.1 ועל CD45.2 ידי הראשון gating של תאים חיים המבוסס על פיזור קדימה ואת הצד, ואחריו gating תאים FITC ו- PE-חיובי בהתבסס על המדגם וללא רבב.
   6. קבוצת העכברים לתוך ארבע קבוצות (n = 6 לכל קבוצה). נתחיל את הטיפול עם imatinib (75 מ"ג/ק"ג 2 x יומי) לבד, בשילוב עם DFC + BCI (שתי תרופות ניתנו במינון של 10 מ"ג/ק"ג 2 x מדי יום).
   7. באופן דומה, מתייחסים לקבוצות אחרות עם שילובים של imatinib (75 מ"ג/ק"ג) + כורכומין (150 מ"ג/ק"ג) + BCI (10 מ"ג/ק"ג) ו- imatinib (75 מ"ג/ק"ג) + NDGA (100 מ ג/ק ג) + BCI (10 מ"ג/ק"ג) למשך שלושה חודשים, 2 x יום, מאת מוזרק i.p.
   8. לנתח את העכברים 1 x חודש במשך שישה חודשים על לוקמיה chimerism על-ידי קביעת האחוז של CD45.2 חיובי בתאי הדם ההיקפיים עם הזנב הווריד דימום כפי שמתואר בשלב 7.4.

9. בהערכת Vivo BCI ופעילות DFC

1. ניתוח פוספו-p38
   1. קח שלוש לוקמיה עכברים (בת 8-12 שבועות) היו מושתלים עם BCR-ABL1-הבעת ' תאי c-Kit⁺ , כמתואר בסעיף 7. מזריקים העכברים BCI (10 מ"ג/ק"ג) על ידי הזרקת i.p. ארבעה שבועות posttransplant.
   2. למדוד את רמות הדם ההיקפיים פוספו-p38 TMNC באמצעות ערכת cytometry זרימה זרחון בהתאם להוראות של הספק. לאסוף את הדם מכל עכבר כל לפני 6 שעות לאחר הזרקת סמים. לבודד את TMNCs על ידי דלדול RBC ותקן אותן כדלקמן.
   3. להוסיף 4 מ"ל של RBC פירוק פתרון לכל 100 µL של דם היקפיים. לערבב, דגירה על קרח למשך 5 דקות lyse ספין RBCs. למטה התאים ב x 1,200 g למשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על פירוק 1 x יותר.
   4. לאחר השלב השני פירוק, לשטוף את כדורי תא עם 1 מ"ל של BSA 2% ב- PBS. לתקן את התאים על-ידי הוספת µL 100 של קיבוע permeabilization פתרונות, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך. גלולה התא על ידי צנטריפוגה ב x 1,200 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
   5. לשטוף את כדורי עם 1 מ"ל של 1 x permeabilization לשטוף. לחסום את התאים על-ידי הוספת µL 300 של 2% BSA במאגר לשטוף permeabilization בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות לחלק את התאים שלוש שווה aliquots של 100 µL (~ 1 x10⁶).
   6. כל aliquot של תאים קבוע להוסיף 1 µL של נוגדן p-38 מוחלט, µL 1 של נוגדן פוספו-p38 או µL 1 של isotype IgG שליטה, בהתאמה, דגירה בין לילה ב 4 º C.
   7. לשטוף את התאים 1 x 5 מ של BSA 2% ב- PBS דגירה עם נוגדנים משניים (1 µL של אלקסה עבור חיל הים-488 מצומדת) לשעה בטמפרטורת החדר. רוחצים את התאים 1 x שוב את להשעות אותם ב- µL 200 ל- PBS 1 x.
   8. לרכוש את הנתונים לפי FACS ולנתח אותם על-ידי תוכנת ניתוח cytometry זרימה.
   9. לנכות את MFI של פקד ה-IgG מ MFI של הדגימות ניסיוני. ערכי MFI פוספו-p38 הם מנורמל אז לזה של p-38 מוחלט כדי לקבוע את רמות פוספו-p38 אחרי הזריקה BCI.
2. ניתוח ביטוי כמותי גנטי של c-פוס היעד גנים
   1. קח שלוש לוקמיה עכברים (8-12 שבועות), היו מושתלים עם תאי c-Kit⁺ BCR-ABL1-הבעת ' כמתואר בסעיף 7. לאסוף את הדם ההיקפיים כל העכבר, ולאחר מכן הוסף את העכברים עם 10 מ"ג/ק"ג כל DFC + BCI.
   2. לאסוף את הדם ההיקפיים 6 שעות לאחר הזרקת סמים. לבודד TMNCs על ידי דלדול RBC, כמתואר לעיל. גלולה של TMNCs ו להשעות אותם במאגר פירוק מבוסס-פנול (ראה טבלה של חומרים).
   3. לבצע ניתוח RT-qPCR (כמתואר בסעיף 1) Bcl2l11, Lif של IL-6 באמצעות תחל גנים ספציפיים (ראה טבלה1).

10. לטווח ארוך. מתחילה תרבות Assay תא

הערה: וזמינותו LTCIC בוצעה כפי שתואר לעיל²⁵.

1. לגדול העכבר פיברובלסט קו תא MS-5 ב- MEMα confluency בבקבוקון תרביות רקמה T175. Trypsinize התאים כפי שתואר לעיל עבור HEK293T. להשעות את התאים ב- MEMα-2 x 10⁶ תאים למ"ל. קח⁶ תאים 10x10 צינור חרוטי 50 מ ל, להאיר ב 80 Gy. לדלל את התאים כדי 0.5 x 10⁶ תאים/מ ל MEMα בתוספת 10% FBS (M10) מדיה. לוחית רישוי 2 מ"ל לכל טוב בצלחת 12-ובכן, דגירה היא c ° 37, 5% CO₂ מגשים בן לילה.
2. ביום הבא, להכין את hemisuccinate נתרן הידרוקורטיזון על ידי המסת 2.5 מ ג, 5 מ של MEMα (1 מ' פתרון). מסנן-לעקר הפתרון הידרוקורטיזון באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm בשכונה אבטחה. לדלל את הידרוקורטיזון על ידי דילול טורי ב MEM להשגת פתרון 100 מיקרומטר. להוסיף µL 250 זה 25 מ של אדם בינוני תרבות לטווח ארוך (HLTM) (ראה טבלה של חומרים) רק לפני לשימוש, כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מיקרומטר.
3. לסובב את לוקמיה מיאלואידית כרונית-CD34⁺ ואת UCP3 TMNCs להשעות אותם ב HLTM על ידי vortexing קצר ו לקבוע את ספירת על ידי hemocytometer.
4. לשאוב את התקשורת M10 מהצלחת 12-היטב עם תאי משתית ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של התא החולה (CML-CD34⁺ [10,000], UCP3 TMNCs [עונה 1 פרק 10⁶]) השעיה ב- HLTM. השתמש משלוש בארות לכל שילוב סמים לכל סוג התא.
5. לדלל את מניות סמים 2 x הריכוז הנדרש ב- HLTM. להוסיף 1 מ"ל של התקשורת עם סמים התאים הנ ל ריכוז התרופה 1 x. להחליף חצי אחד של אמצעי התקשורת HLTM טריות כל שבוע למשך חמישה שבועות.
6. בסוף התקופה וזמינותו של LTC-IC שישה שבועות, לאסוף תאים nonadherent לתוך צינור התרבויות. Trypsinize תאים חסיד ולשלב אותן עם תאי nonadherent המתאימים.
7. לשטוף את התאים ואת וזמינותו עבור CFUs methylcellulose בינוני המכיל 30% עגל עוברית בסרום, אריתרופויאטין (3 יחידות/mL), SF (50 ng/mL), ו- IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL), גורם מגרה המושבה גרנולוציט/מקרופאג (GM-CSF) (20 ng / mL)-לקבוע את ספירת על ידי hemocytometer.
8. צלחת 5 x 10 תאים⁴ משכפל שלוש. להקפיא את התאים הנותרים דימתיל סולפוקסיד FBS ו-10%-20%. לסדר את הלוחות בצלחת פטרי גדולה עם צלחת אחת פתוח המכיל מים באמצע. מכסה גדול הפטרי בקפידה, דגירה זה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ החממה במשך שבועיים.
9. ציון המושבות, שבועיים לאחר מכן. במקרים מסוימים, רק חלק הקציר הוא לבדיקה עבור CFUs). לחשב שהמספר הכולל של LTCIC נוכח התליה תא הראשונית על ידי חיוץ בהתבסס על CFUs המתקבל חלק הקציר התא. התפוקה CFU הממוצעת לכל LTC-IC הוא 8.
   הערה: לדוגמה, אם בתחילה עונה 1 פרק 10⁶ תאים מצופים בבאר, לאחר חמישה שבועות, 0.5 x 10⁶ תאים נקטפו, עבור CFU, 5 x 10⁴ תאים מצופים ו 50 CFUs התקבלו. זה שווה 500 CFUs/1 מיליון תאים מצופים. מספר זה מתחלק 8 כדי לקבל את LTCIC, ובגלל זה 62.5.

11. humanized דגם העכבר באמצעות CML CD34 תאים⁺

1. Sublethally שקסמה מקרין 8 בת שבוע הנהון scid גמא העכברים, המבטאת IL3 אנושי, GM-CSF ו- SCF (NSGS), עם מנה אחת של Gy 7.0 (700 ראד) עם 50 rads/min.
2. להזריק 3 x 10⁶ CD34⁺ שנבחרו תאים מחולים שלב כרונית CML BCR-ABL1-חיובית אל העכברים לקרינה בזריקה תוך ורידי.
3. אחרי שבועיים של השתלת, לקבוע engraftment לוקמיה במח העצם על ידי FACS באמצעות נוגדנים ספציפיים העכבר או האדם נגד CD45.
4. ביצוע ניתוח FACS.
   1. קח את מח עצם וביופסיה של עצמות הירך של העכברים המושתלים. Lyse RBCs באמצעות מאגר פירוק RBC כמתואר לעיל, לאסוף את TMNCs על ידי צנטריפוגה. לשטוף את גלולה 1 x עם PBS קר 1 x.
   2. לחסום את התאים עם בלוק ה-FcR האנושי של עכבר ה-FcR רחוב ואחריו מכתים עם האנטי-האדם CD45 FITC, אנטי-עכבר CD45 APC^Cy7 בין לילה ב 4 º C. לבצע את הניתוח FACS LSRII ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנות ניתוח cytometry זרימה.
5. קבוצת העכברים לתוך ארבעה גדודים שונים (n = 6/קבוצה) על הטיפול עם הרכב, imatinib (75 מ"ג/ק"ג), DFC + BCI (שניהם ב 10 מ"ג/ק"ג), או imatinib (75 מ"ג/ק"ג) + דלק + BCI (שניהם ב 10 מ"ג/ק"ג). לדלל את הסמים מניות ב- PBS 1 x (הרכב), לנהל אותן באמצעות הזרקת אותם i.p. 2 x מדי יום.
6. מתייחסים העכברים במשך שישה שבועות, לקבוע את הנטל לוקמיה כל שבועיים, עד שבוע 8 לאחר ההשתלה כפי שתואר לעיל ב- 11.4.

תוצאות

התמכרות אונקוגן היה מעורב יעילות טיפולית של TKIs. עם זאת, מנגנוני נהיגה התלות אונקוגן אינם מובנים. אנו לבצע ניתוחים ביטוי ג'ין לא משוחד מרובים כדי לזהות את הרכיב הגנטי מעורב מנצח ההתמכרות. ניתוחים אלה חשף קולטנים את upregulation של שלושה גנים ג-פוס, Dusp1, Zfp36, בתאי סרטן אשר אינם תלויי...

Discussion

עבור חלק הארי של תאים סרטניים, התגובה הטיפולית TKI מתווך על ידי מצור של אותות טירוזין-קינאז-oncoprotein אשר הגידול הוא מכור. עם זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על איך מיעוט של תאים סרטניים לתרום MRD לברוח אונקוגן התלות וטיפול⁴. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי גורם הגדילה איתות שמתווכת תרופתיים לוק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)	Stem Cell	3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)	Stem Cell	4434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H6278
Recombinant Murine SCF	Prospec	CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Recombinant Murine IL-6	Prospec	CYT-350
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	I-5508
Curcumin	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in water
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0.45 μM acro disc filter	PALL	2016-10
70 μm nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5762
Nitrocullulose Membrane	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD	558612
CD117 APC	BD	553356
BD Pharm Lyse	BD	555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)	BD	554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)	BD	554723
phospho p38	Cell Signaling Technologies	4511S
total p38	Cell Signaling Technologies	9212
Mouse IgG control	BD	554121
Alexa Flour 488 conjugated	Invitrogen	A-11034
Calcium Chloride	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Blood Capillary Tubes	Fisher	22-260-950
Blood Collection Tube	Giene Bio-One	450480
Newborn Calf Serum	Atlanta biological	S11295
Erythropoiein	Amgen	5513-267-10
human SCF	Prospec	CYT-255
Human IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Doxycycline chow	TestDiet.com	52662	modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline
Tamoxifen	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolium chloride	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)	Qiagen	217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)	Bio-Rad	1725270
CD117 MicroBead Kit	Miltenyi	130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (boold counter)	Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)	BD
Fortessa I (FACS analyzer)	BD
FACSAriaII (FACS Sorter)	BD
Magnet Stand	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Model 68A	source Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ	mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Made in house
Cells
BaF3	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells	University Hospital, University of Cincinnati