נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה שבה נויטרופילים אנושיים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), התאוששה נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח, לייצר מסיבית מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), השמנה ביעילות תאים סרטניים חינם לאחר מכן לגדול.

Abstract

הפעלת נויטרופילים שחרור נויטרופילים חוץ-תאית מלכודות (רשתות), אשר יכולים ללכוד ולהשמיד חיידקים. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי רשתות מעורבים בתהליכי מחלה שונים, כגון גרורות המחלה פקקת, הגידול אוטואימוניות. כאן, אנו מראים טכניקה מפורט במבחנה לזיהוי פעילות נטו במהלך לכידה של תאים סרטניים חינם, אשר גדלים לאחר חיבור רשתות. ראשית, אספנו בצפיפות נמוכה נויטרופילים (-כעבור שנה.-) של נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח בחולים שעברו laparotomies. Culturing לטווח קצר של-כעבור שנה-הביא שמצביעה נטו מסיבית היה מדמיין עם גרעיני ירוק פלורסנט, כרומוזום counterstain. לאחר דגירה שיתוף של שורות תאים סרטן קיבה אנושית MKN45, OCUM-1 ו- NUGC-4 עם הרשתות, תאים סרטניים רבים נלכדו על ידי הרשתות. כתוצאה מכך, הקובץ המצורף היה יושב לחלוטין על ידי ההשפלה של רשתות עם Time-lapse אני DNase הסרטונים גילה כי תאים סרטניים, שנלכד על ידי הרשתות לא מת, אבל במקום גדל נמרצות בתרבות רציפה. שיטות אלה ניתן להחיל את הגילוי של דבק אינטראקציות בין רשתות סוגים שונים של תאים וחומרים.

Introduction

פולימורף נויטרופילים גרעיני במחזור הדם מופרדים בדרך כלל תאי תאי דרך שיטת הכנה הדרגתיות צפיפות. עם זאת, כמה נויטרופילים הידוע בשם נויטרופילים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), עם פנוטיפים CD11b(+), CD15(+), CD16(+), CD14(-), הם מטוהרים במשותף עם תאי תאי. המספר היחסי של-כעבור שנה-מגדיל באופן משמעותי בתנאים פתולוגיים שונים, כולל מחלות אוטואימוניות^1,2, אלח דם³ו-^4,סרטן⁵. מחקרים קודמים הראו כי-כעבור שנה-מחלקה phenotypically והן מבחינה תפקודית ברורים של נויטרופילים⁶. יצוין, כי-כעבור שנה-במחזור הדם הם נוטים יותר לייצר מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) מצפיפות נורמלי נויטרופילים^2,7. הרשתות הן מבנים דמויי-אינטרנט המורכב של חומצות גרעין, שינויים היסטוניים, פרוטאזות, חלבונים פרטנית ו cytosolic, הם ביעילות במלכודת, להרוס פתוגנים⁸.

לאחרונה, רשתות הוכחו ללכוד לא רק חיידקים, אבל גם טסיות דם ופיזור תאים סרטניים, אשר יכולים לסייע כגון היווצרות⁹ וגידול גרורות^10,11. עם זאת, המנגנונים המולקולריים מאחורי האינטראקציות דבק בין רשתות, טסיות דם או תאים סרטניים נמצאים עדיין לא ברור. לאחרונה, assay אדהזיה במבחנה גילה כי תאים לוקמיה מיאלואידית (K562¹²) ותאים קרצינומה של הריאות (A549¹³) לצרף רשתות באמצעות אינטגרינים β1 וβ3. המחברים השתמשו נטו מניות מבודד נויטרופילים ומופעל על ידי phorbol 12-פעילים 13-אצטט (PMA) המצע אדהזיה¹⁴. למרות assay זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות אמיתי עם רכיבים נטו בהיעדרו של נויטרופילים, זה לנתיחה אם "התא ללא מניות נטו" מבודדת על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה משמרת את המבנה המולקולרי זהה רשתות המיוצר ב ויוו. לאחרונה, מצאנו את נוזל שטיפת הצפק לאחר ניתוח בבטן הכיל הרבה בוגרים-כעבור שנה-, אשר נוצר רשתות מסיבי המוצמדות לתאים הגידול גורם גרורות הצפק¹⁵. במחקר זה, בדקנו בהצלחה את הידבקות תאים סרטניים רשתות שלמות ללא כל פעולה פיזית. כאן, אנו מראים פרטים של טכניקה לגילוי דבק אינטראקציות בין רשתות תאים סרטניים חינם.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

-כעבור שנה-התקבלו מחולים שהשתתפו במחקר זה ואושרו על-ידי מוסדיים סקירה לוח של jichi ב רפואה באוניברסיטה.

1. בידוד של-כעבור שנה-של חלל הבטן Lavages וזיהוי נטו

1. רכישת המדגם
   1. להשרות 1000 מ"ל של תמיסת סטרילית ישירות לתוך חלל הבטן לפני סגירת הפצע בחולים שעברו ניתוח בטן בשל ממאירות במערכת העיכול.
      הערה: דגימות התקבלו מהמטופלים שעברו ניתוח קיבה, קיצור קיבה, או esophagectomy ללא הטיה על בסיס גיל או מין. תמיסת מלח היה הועבר לתוך מיכל והוא נשפך לתוך הבטן כל. דקה אחת. זה מתבצע באופן שגרתי כמו שטיפת הצפק לאחר הניתוח ללא השפעות משמעותיות על חולים.
   2. שטיפת חלל הבטן בהרחבה לפחות 1 דקות.
      הערה: מומלץ כי הנוזל מוחדר אט-אט מנוער בידיים של המנתח כך הדגימות אחיד.
   3. לשחזר 200 מ של נוזל שטיפה עם 4 מזרקים 50 מ.
      הערה: לפעמים גומי מחבר משמש כדי לקחת את הנוזלים.
2. לבצע טיהור של הצפק-כעבור שנה-באמצעות גרנולוציט mAb ספציפי, CD66b¹⁶.
   הערה: כיוון שכבת ביניים לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות מכיל תאי תאי רבים, הבחירה חיובית של נויטרופילים פולימורף באמצעות CD66b mAb בוצעה.
   1. העברת נוזל שטיפת הצפק שפופרת 50 מ.
      הערה: בשלב זה, את הנוזלים עוברים דרך מסנן ניילון 100 מיקרומטר להסיר זיהומים.
   2. Centrifuge את הנוזל הצפק ב g x 270 במשך 7 דקות ב- RT.
   3. Resuspend כדורי ב 5 מ של PBS עם EDTA 0.02%.
   4. בזהירות כיסוי mL 5 תא השעיה על פתרון הדרגתי של צפיפות 3 מ.
   5. צנטריפוגה ב g x 1,700 למשך 15 דקות ב RT ללא כל מעברי.
   6. הקציר mL ~ 2-3 של פתרון המכיל שכבות ביניים (איור 1 א') באמצעות פיפטה ומערבבים אותו עם 10 מ"ל של PBS עם EDTA 0.02%.
   7. Centrifuge את הנוזל הצפק-400 g x עבור 7 דקות ב RT וזורקים את תגובת שיקוע.
   8. להוסיף עוד 10 מ"ל של PBS עם EDTA 0.02%, צנטריפוגה g x 270 עבור 7 דקות-RT. להשליך תגובת שיקוע.
   9. להמיס בגדר תא (1 x 10⁷) 60 µL מאגר עבור ערכת ההפרדה תא מגנטי.
   10. להוסיף 20 µL של Fc גוש כדורי, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס.
   11. הוסף 20 µL של האנטי-CD66b מצומדת עם גרגרי ואת תקופת דגירה של 10 דקות נוספות ב 4 º C.
   12. רוחצים את מחדש להשעות את כדורי ב- 500 µL מאגר מקינטוש.
   13. החלת התליה תא על עמודה מגנטי בשדה המגנטי של מפריד מגנטי מתאים ולאסוף זרימה דרך המכיל CD66b(-) התאים ע י שטיפת העמודה עם 15 מ"ל של המאגר.
   14. הסר את העמודה במפריד מגנטי, מיד לשטוף את התאים CD66b(+) מגנטית שכותרתו בדחיפה בחוזקה על הבוכנה לתוך העמודה.
       הערה: האוכלוסייה תא CD66b(+) מורכב בעיקר נויטרופילים כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS המציין > 95% של השבר CD66(+) הם חיוביים עבור CD11b, CD15 CD16, אבל שלילי עבור CD14.
3. דור של רשתות
   1. לאחר צנטריפוגה-g x 270 עבור 7 דקות-RT, מחדש להשעות את-כעבור שנה-מבודד (5 x 10⁶) ב 1 מ"ל של RPMI1640 עם 10% FCS.
   2. תרבות של-כעבור שנה-על הצלחת מצופה 6-ובכן פולי-L-ליזין (6 ס מ קוטר) עבור 2 h ב- 37 הלעפה תרוטרפמט 5% CO₂.
   3. להוסיף את counterstain פלואורסצנטי ירוק (צבע ממברנה-אטום כדי להכתים את גרעין ואת כרומוזומים) הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר.
   4. מיד להבחין המורפולוגיה של רשתות (חוץ-תאי DNA הרכיבים שגורשו את-כעבור שנה-תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית).

2. צביעת של תאים סרטניים עם צבע מקשר תא ניאון אדום

1. להכין סרטן אנושי שורות תאים MKN45, NUGC, OCUM-1.
2. לשטוף את התאים⁷ עונה 1 פרק 10 עם PBS + EDTA 0.02% 15 מ"ל שפופרת, צנטריפוגה ב 270 x g במשך 7 דקות ב- RT.
3. להוסיף 1 מ"ל של פתרון עבור צבע מכתימה את כדורי, פיפטה בעדינות.
4. להמיס 4 µL של צבע מקשר תא ניאון אדום ב 1 מ"ל של פתרון עבור צביעת ומערבבים עם התליה תא מהשלב 2.2.
5. דגירה כדורי במשך 4 דקות ב- RT.
6. להוסיף 4 מ של DMEM (10% FBS) כדי לעצור את התגובה מוכתמים.
7. צנטריפוגה g x 270 עבור 7 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
8. חזור על שלבים 2.6 ו- 2.7 פעמיים.
9. בדוק עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (עירור = 551 nm, פולטות = 567 ננומטר) כי בתאי הגידול מוכתמים באדום.

3. ניתוח של גידול התא הדבקה על רשתות

1. מחדש להשעות את תאי הגידול מוכתם ניאון אדום (1 x 10⁶) ב 1 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת BSA 0.1%.
2. הוסף את תאי הגידול התרבות-כעבור שנה-שהפיקה את הרשתות כפי שמתואר בשלב 1.3.
3. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 הלעפה תרוטרפמט, אשר מאפשרת לתאי הגידול ליצור קשר עם הרשתות.
   הערה: זמן דגירה גורם גידול התא אדהזיה-כעבור שנה- או את הצלחות.
4. להסיר את המדיום ולשטוף בעדינות את הבארות על-ידי הוספת 2 מ"ל של מדיה prewarmed (BSA 0.1% + RPMI 1640), מתערבל המנה.
5. חזור על הפעולות כביסה בשלב 3.4 פעמיים.
   הערה: מאז רשתות בחולשה לצרף הצלחת, כביסה צריך להיעשות בעדינות ככל האפשר כדי למנוע הסרה של הרשתות עצמם.
6. הוסף את הפלורסנט ירוק עבור מכתימה את גרעין ואת כרומוזומים-ריכוז הסופי של 5 µg/mL עבור ויזואליזציה של הרשתות.
7. לצפות את הרשתות ומחוברת תאים סרטניים באמצעות את המסננים המתאימים (ירוק, עירור = 504 nm, פולטות = 523 ננומטר; רד, עירור = 551 nm, פולטות = 567 ננומטר).
8. למזג את הנתונים כדי להציג את תאי הגידול כי הם לכודים על ידי הרשתות.
   הערה: כמה ניסויים, האנזים DNA השפלה נוספה התרבות-כעבור שנה-(הריכוז הסופי של 100 U/mL) 5 דקות לפני שיתוף הדגירה למשך 5 דקות.

4. זמן לשגות ניתוח וידאו של תאי הגידול לכוד

1. תרבות-כעבור שנה-פריטוניאלית ב 35 מ מ עגול מאכל מצופה פולי-L-ליזין כפי שמתואר בשלב 1.3.
2. הוסף את הפלורסנט ירוק עבור מכתימה את גרעין ואת כרומוזומים להמחיש רשתות כפי שמתואר בשלב 1.3.
3. לאחר 1 דקות של דגירה, מסיר את המדיה ולהוסיף 2 מ"ל של BSA 0.1% + RPMI 1640.
4. מסיר את המדיה ולהוסיף מוכתם עונה 1 פרק 10⁶ MKN45 תאים הושעו ב- 0.1% BSA + RPMI 1640. תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
5. להסיר תאים סרטניים כעיגולים בצבע כלשהו על ידי שטיפת בעדינות כפי שמתואר בשלב 3.4 ולהוסיף DMEM עם 10% FCS בתוספת 100 u/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100.
6. הר המנה תרבות במערכת תצפית נוף כל תא, בחר את השדה המתאים איזה גידול תאים לכוד על ידי הרשתות.
7. ממשיכים תרבות משותפת עבור נוספים יומיים לצלם תמונות רציף של השדה בכל 6 דקות תחת תאורה רגילה וזריחה, אשר מזהה תאים MKN45 ורשתות, בהתאמה.
8. להרכיב את התמונות על כל timepoint ולבנות זמן לשגות וידאו באמצעות התוכנה מציג תמונה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בתרבות 2 שעות CD66b(+)-כעבור שנה-נגזר מבנים מחרוזת הראה נוזל שטיפת הצפק צבעונית עם צבע ירוק-פלורסנט עבור גרעיני, כרומוזום (איור 1B), בעוד CD66b(-) תאי תאי לא (איור 1C). עם זאת, כאשר pretreated היו התרבויות-כעבור שנה-עם 100 DNase U/mL, המבנה האופייני היה נהרס (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקרים קודמים דיווחו כי מחזורי תאים סרטניים יכולים להיות. לכוד סובסטרטים נטו ויוו^10,11. תאי סרטן שד גרורתי הוכחו לעורר נויטרופילים, זירוז היווצרות של רשתות, אשר מסייע צמיחת תאים סרטניים גידולים איבר המטרה¹⁷. בנוסף, מצאנו כי של נוזל שטיפה לאחר ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro