סינתזה, אפיון, ויישום של Nanoprobes תחמוצת ברזל Superמגנטית לאיתור שחפת הריאות חוץ

Summary

כדי לשפר בדיקות אבחון סרולוגית עבור אנטיגנים שחפת של פטרת , פיתחנו superparamagnetic ברזל תחמוצת הnanoprobes כדי לזהות שחפת הריאות.

Abstract

הדמיה מולקולרית בדיקה הכוללת מתכת ברזל superparamagnetic (SPIO) חלקיקים ונוגדן פטרת פני השטח של שחפת (MtbsAb) היה מסונתז כדי לשפר את רגישות ההדמיה עבור שחפת הריאות חוץ (etb). Nanoprobe SPIO היה מסונתז ומצועם עם MtbsAb. SPIO-MtbsAb nanoprobe מטוהרים התאפיין באמצעות TEM ו NMR. כדי לקבוע את היכולת המיקוד של החללית, SPIO-MtbsAb nanoprobes היו מודבטים עם Mtb עבור הדמיה מלאכותית ומוזרק לתוך עכברים Mtb-מחוסן עבור בחקירת vivo עם תהודה מגנטית (MR). הפחתת שיפור הניגודיות על דימות תהודה מגנטית (MRI) של תאים Mtb ו THP1 הראו ביחס לריכוז SPIO-MtbsAb nanoprobe. לאחר 30 דקות של הזרקה SPIO-MtbsAb nanoprobe לתוך עכברים נגועים Mtb, עוצמת האות של האתר גרגירומי היה משופר על ידי 14-קיפול ב-T2 תמונות משוקלל MR לעומת זאת בעכברים מקבל הזרקת PBS. Nanoprobes MtbsAb יכול לשמש כמודאליות הרומן עבור זיהוי ETB.

Introduction

באופן גלובלי, שחפת מחוץ לריאות (ETB) מייצגת שיעור משמעותי של מקרי שחפת (TB). עם זאת, האבחון ETB הוא החמיץ לעתים קרובות או מתעכב בגלל המצגת הקליני חתרני שלה ביצועים ירודים על בדיקות אבחון; תוצאות כוזבות כוללות רוק סמארים שליליים עבור חומצה-באקל מהיר, חוסר של רקמת גרגירואיד על histopathology, או כישלון בתרבות שחפת בתרבית (Mtb). ביחס למקרים טיפוסיים, ETB מתרחשת בתדירות נמוכה יותר וכרוכה שחרור קטן של Mtb bacilli. בנוסף, הוא מותאם בדרך כלל באתרים קשים לגישה, כגון בלוטות לימפה, pleura, ואזורים האוסטארטיקולריות¹. כך, הליכים פולשניים להשגת דגימות קליניות נאותה, מה שהופך את אישור בקטיולוגי מסוכן וקשה, הם חיוניים^2,3,4.

בדיקות לזיהוי נוגדנים זמין מסחרית ETB אינם אמינים עבור זיהוי קליני בגלל מגוון רחב של רגישות (0.00-1.00) וספציפיות (0.59-1.00) עבור כל האתרים הריאתי בשילוב⁵. חיסוני מקושר אנזים (elispot) בחני-γ, התרבות פילטרט חלבון (CFP), ואת היעד מוקדם אנטיגניים הסוד (esat) שימשו לאבחון TB הסמויה פעיל. עם זאת, התוצאות משתנות בין אתרי מחלות שונים לאבחון etb^6,7,8. בנוסף, העור PPD (מטוהר חלבון נגזרות) ו בדיקת קוונטיפט-TB סיפקה לעתים קרובות תוצאות שליליות שווא⁹. בדיקת קוונטיפלון-TB-2g הוא שלמות הדם החיסונית החיסון המערכת, אשר אינו דורש דגימה מן האיבר המושפע וזה עשוי להיות כלי אבחון אלטרנטיבי^6,10,11. שיטות אבחון אחרות המשמשות בדרך כלל עבור TB דלקת קרום העין, כגון תגובת שרשרת פולימראז, עדיין רגישות מדי כדי למנוע בביטחון אבחון קליני^12,13. אלה בדיקות קונבנציונליות להפגין מספיק מידע אבחוני כדי לגלות את האתר זיהום חוץ לריאות. לפיכך, נדרשות הבדיקות הקליניות של האבחון החדשני.

הדמיה מולקולרית שואפת לעצב כלים חדשניים שיכולים להקרין ישירות מטרות מולקולריות ספציפיות של תהליכי מחלות ב vivo^14,15. Superמגנטית תחמוצת ברזל (spio), הסוכן הניגוד T2 משוקלל nmr, יכול לשפר באופן משמעותי את הספציפיות והרגישות של תהודה מגנטית (MR) הדמיה (MRI)^16,17. זה חדש הדמיה תפקודית מודאליות יכול בדיוק לשרטט שינויי רקמות ברמה המולקולרית באמצעות אינטראקציות ligand-הקולטן. במחקר זה, הדמיה מולקולרית חדש בדיקה, הכוללת חלקיקי SPIO, היה מסונתז למשלים עם נוגדן Mtb פני השטח (MtbsAb) עבור אבחון ETB. Spio nanoprobes הם מינימלית פולשנית לרקמות וגופים במבחן^18,19. יתר על כן, nanoprobes אלה יכולים להדגים תמונות מדויקות של MR בריכוזים נמוכים בשל התכונות פאראמגנטיות שלהם. בנוסף, SPIO nanoprobes מופיעות לפחות תגובות אלרגיות משום שנוכחותם של יוני ברזל היא חלק מהפיזיולוגיה הנורמלית. כאן, הרגישות והספציפיות של SPIO-MtbsAb nanoprobes מיקוד ETB הוערכו הן תא והן דגמי בעלי חיים. התוצאות הראו כי הnanoprobes היו ישימים כמו סוכני הדמיה ultrasensitive עבור אבחון ETB.

Protocol

כל הפרוטוקול בנוגע לניסוי בעלי חיים עוקב אחר הליכי ההפעלה הסטנדרטיים של גידול בעלי חיים במעבדה בהתאם למוסדות הלאומיים של הנחיות בריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה (8 ה Edition, 2011) והוא מאושר על ידי ה טיפול בבעלי חיים מוסדיים והוועדה לשימוש.

1. הסינתזה של SPIO ננו-חלקיק

1. הכנת דטרן מצופה תחמוצת ברזל מגנטי חלקיקי על ידי ערבוב נמרצות תערובת של תוספי T-40 (5 מ ל; 50% w/w) ו מימית פוריות₃× 6h₂o (0.45 g; 2.77 mmol) ו-ליטר₂×_{4h 2}o (0.32 g; 2.52 mmol) פתרונות בטמפרטורת החדר.
2. הוסף את NH₄הו (10 מ"ל; 7.5% v/v) במהירות.
3. עוד לערבב את ההשעיה השחורה עבור 1 h; לאחר מכן, צנטריפוגה ב 17,300 x g עבור 10 דקות ולאחר מכן להסיר את האגרגטים.
4. הפרד את מוצרי spio הסופי מ-תוספי T-40 בלתי מאוגד על-ידי ג'ל סינון כרומטוגרפיה²⁰.
5. טען את תערובת התגובה (נפח כולל = 5 מ ל) לתוך 2.5 ס מ × 33 ס"מ עמודה ו elute עם פתרון מאגר המכיל 0.1 M Na אצטט ו0.15 M הנאל ב-pH 7.0.
6. לאסוף את הברזל מטוהרים דטרן מצופה תחמוצת ברזל חלקיקים מגנטיים בנפח הריק והוא מקבל את הטור משחרל ברזל תוספי ב 330 ו 490 nm באמצעות חומצה הידרוכלורית ו-פנול/חומצה גופרתית שיטות²⁰, בהתאמה.

2. הסינתזה של SPIO-MtbsAb

1. לסנתז את spio-מצוכן באמצעות שיטות שדווחו בעבר^21,22.
2. לסנתז את ספיאו-אדבה-סוהילי-סואדאין (SA).
   1. מערבבים פתרון אלקליין (5 מ NaOH; 10 mL)) של SPIO-EDBE ו-SA (1 גרם; 10 μm) בטמפרטורת החדר עבור 24 שעות.
   2. Dialyze הפתרון עם 20 שינויים של 2 L של מים מזוקקים באמצעות צינורות מולקולריים נקבובי ממברנה (12000-14000 MW החיתוך). 6 h עבור כל שינוי.
3. לבסוף, להוסיף 100 μL של SPIO-EDBE-SA (4 מ"ג/mL של Fe) כדי 400 μL של 4.5 mg/mL MtbsAb כדי לסנתז SPIO-MtbsAb באמצעות 1-hydroxybenzotriazole ו (בbenzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate כזרזים ומערבבים את הפתרון בטמפרטורת החדר
4. לבסוף, הפרד את הפתרונות מהנוגדן הלא מאוגד דרך כרומטוגרפיה של סינון ג'ל.
5. לטעון את תערובת התגובה (5 מ ל) על 2.5 ס מ × 33 ס"מ עמודה ו-elute באמצעות מאגר PBS. אשר Ab – ננו-חלקיק מורכבים (כלומר, nanoprobe) באמצעות חומצות חלבון בניה שיטת החומציות ערכת²³.

3. התבוננות במבנה החלקיקים ומדידת רמת ההרפיה

1. לבחון את גודל החלקיקים הממוצע, מורפולוגיה, והפצת גודל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור במתח של 100 kV.
   1. Drop-הטל את הפיזור מורכב על רשת נחושת 200-mesh ואוויר יבש בטמפרטורת החדר לפני טעינת אותו על המיקרוסקופ.
2. למדוד את ערכי זמן ההרפיה (t₁ ו- t₂) של nanoprobes באמצעות מדידת nmr במהירות 20 מגה-הרץ ו 37.0 ° c ± 0.1 ° c.
   1. כיול את מדידת ההרגעת לפני כל מדידה.
   2. תעד את ערכי r₁ ו- r₂ מתוך שמונה נקודות הנתונים שנוצרו באמצעות היפוך-שחזור ורצף הדופק קאר-פורסל-מייבום-גיל, בהתאמה, כדי לקבוע r₁ ו- r₂ relaxivities²⁰.

4. הדמיית תאים

1. לטפח את מונוציטים האדם THP-1 ב RPMI 1640 עם הסרום העוברי 10% העובר, 50 μg/mL ג'אמיאמסינ ' סולפט, 100 יחידות/מml פניצילין G נתרן, 100 μg של סטרפטומיצין סולפט, ו-0.25 μg/mL fungizone 5% שיתוף₂ חממה ב 37 ° c.
2. שיטת המשחק (2 ממ) עם 10⁶ המושבה ויוצרים יחידות (cfu) של בואנטי bcg מראש עם 1 × 10⁷ מונוציטים מופעל בצינורות מיקרוצנטריפוגה (1 מ ל) בחממה 5% CO₂ ב 37 ° c עבור 1 h.
3. צינורות צנטריפוגה ב 200 x g ולהיפטר supernatant. התמוססות מחדש את הפלטות במדיום (200 μL).
4. סריקת הדגימות באמצעות רצף מהיר של מעבר הדרגתי של ההד (זמן חזרה (TR) = 500; זמן ההד (TE) = 20; להעיף זווית = 10 °) דרך 3.0-T-MRI כדי לקבוע את הספציפיות של nanoprobe ורגישות^21,22.

5. BCG (באקלוס מקרתגו-גירין) החיסון

1. ליצור מחדש את החיסון ליאופאו מלאי בקטריאלי במדיום של סאוטון ולאחר מכן לדלל את המניה עם תמיסת מלח עד התפזרו כראוי כפי שתוארה בעבר²⁴.
2. האיחסן זן חי מחליש של M. סטרפטקוקוס bcg, המתקבל adimmune (טאיפיי, טייוואן) (מאמץ קונוט; ImmuCyst אונטיס, פסטר מועלם) בנפח של 0.1 mL/עכבר (כלומר, 10⁷ cfu) הפנים לתוך העור שמאלה או ימינה השכמה של עכברים, כפי שמתואר בעבר²³. הכנס תמיסת מלח לעכברים כפקד שלילי. עקוב אחר בעלי חיים מדי יום לאחר החיסון BCG.
3. להקריב בעלי חיים 1 חודש לאחר חיידקים החיסון באמצעות המתת-תחמוצת הפחמן דו חמצני. . לקצור את הרקמה מהאתר הפנימי תקן את הרקמה בתוך 10% פורמלין ולהטביע פרפין עבור סעיפים סידוריים ב 5-10 μm. מקטעים רקמה עם המטאוקסילין/אאוזין ו-יציבת חומצה הכתמים על חיידקים מהירים של חומצה מהירה²⁴ ועם כחול ברלין עבור ferric ברזל²⁵.

6. ב-MRI vivo

1. הכנס קטמין (80 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף) ו xylazine (12 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) תת-עורי לתוך עכברים עבור הרדמה לבעלי חיים.
2. הכנס את הבדיקות של SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) לתוך ורידים בזנב של עכברים. MR. עכברים תמונה לפני ומייד לאחר הזרקת בדיקה ולאחר מכן כל 5 דקות עבור 30 דקות כדי לרכוש T2 משוקלל מהיר תמונות ספין-הד (TR = 3000; TE = 90; שדה תצוגה = 8).
3. לנתח את כל התמונות MR באמצעות עוצמת אות (SI), מדידה של אזורים מוגדרים של עניין במיקומים דומים של מרכז גרגירומה Mtb ואת השריר האחורי סמוך לאזור גרגירומי.
4. חישוב שיפורי אותות יחסיים באמצעות מדידת SI לפני (שליטה בקרה) ו-0-3 h לאחר הזרקה של סוכני הניגודיות באמצעות הנוסחה
   
   [(SIpost-Sipost)/sipost] × 100
   
   כאשר sipre הוא si של הנגע על הסריקה מוגברת מראש sipre הוא si של הנגע על סריקה לאחר משופרת^21,22.

תוצאות

SPIO-MtbsAb nanoprobe סינתזה ואפיון
חלקיקי SPIO תוכננו למשלים עם MtbsAb. תוספי התייצב על פני השטח של חלקיקי spio היה מקושר על ידי אפיכלורוהידרסין. חלקיקי spio שולבו לאחר מכן עם edbe כדי להפעיל קבוצות העיקרי של האמין העיקריים בקצוות תוספי. לאחר מכן הייתה מצומנת ליצור את SPIO-EDBE-SA. SPIO-MtbsAb nanoprobes הוקמה בשלב...

Discussion

בדומה למחקרים רלוונטיים, הממצאים שלנו לגבי spio-mtbsab nanoprobes הפגינו ספציפיות משמעותית עבור Mtb^27,28. הMtb גרגירומה התת עורית נמצא 1 חודש לאחר הזרקת TB בדגמי העכבר. ממצאי היסטולוגיה של שחפת החומרים הטיפוסיים כללו הסתננות לימפוציטים, נוכחות של מקרופאגים אפיתל, ו neovasculariza...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate	Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole	Sigma-Aldrich
dextran(T-40)	GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)	Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate	Fluka
ferrous chloride tetrahydrate	Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG	Pasteur Mérieux	Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI	GE medical Systems	3.0-T, Signa
NH4OH	Fluka
NMR relaxometer	Bruker	NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300	GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25	GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off	Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb	Acris Antibodies GmbH	BP2027
transmission electron microscope	JEOL	JEM-2000 EX II