JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור ניצול של חרקים תא baculovirus חלבון ביטוי ומערכת לייצר כמויות גדולות של חלבונים צמח מופרש על התגבשות חלבון. וקטור ביטוי baculovirus השתנה עם GP67 או hemolin חרקים פפטיד אות לביטוי הפרשת חלבון צמחי בתאי חרקים.

Abstract

זה כבר אתגר עבור מדענים לבטא הפרשה האיקריוטים חומרים ללימודי הביוכימי מבניים. מערכת ביטוי בתיווך baculovirus תא חרקים היא אחת ממערכות שנועדה להביע האיקריוטים הפרשה חומרים עם מספר שינויים post-translational. הפרשה החלבונים צריכים להיות מנותב המסלולים הפרשה גליקוזילציה חלבון, היווצרות חוב דיסולפידי של שינויים post-translational אחרים. כדי לשפר את הביטוי תא חרקים הקיים של פרוטאינים צמחיים הפרשה, וקטור ביטוי baculovirus הוא שונה על-ידי התוספת של או GP67 או hemolin אות פפטיד רצף בין מקדם אתרים שכפול מרובה. מערכת זו וקטור שונה שעוצבו לאחרונה הפיקה בהצלחה תשואה גבוהה של חלבונים מסיסים צמח המופרש רקומביננטי קולטן של תודרנית לבנה. שני החלבונים צמח ביטוי, התחומים חוץ-תאי של קולטני ממברנה פלזמה תודרנית TDR ו- PRK3, היו גיבש ללימודי לחקר הגבישים רנטגן. מערכת וקטור ששונה הוא כלי משופרת פוטנציאל שיכול לשמש עבור הביטוי של חומרים הפרשה בממלכת החיות גם כן.

Introduction

זה הכרחי עבור מעבדת מחקר להיות מסוגל לייצר כמויות גדולות של חומרים הומוגנית על אפיוני הביוכימי, biophysical, במיוחד ללימודי לחקר הגבישים רנטגן. ישנן מערכות רבות ומבוססת ביטוי heterologous כגון Escherichia coli, שמרים, בתאי חרקים, בתרבית של תאים, תאי צמחים, וכו ביניהם, מערכת ביטוי בתיווך baculovirus תא חרקים היא אחת ביותר נפוץ טכניקות לייצר כמויות גדולות של מבנית מקופל גדול בגודל האיקריוטים חומרים עבור התגבשות חלבון1.

הווקטורים ביטוי במערכת הביטוי baculovirus מתוכננים להכיל polyhedrin חזק או יזם P10 לייצר תשואה גבוהה של חלבונים תאיים רקומביננטי2,3. כדי להפוך את baculovirus רקומביננטי, הגן עניין שוכפל לתוך וקטור חרקים המכיל את לוקוס polyhedrin (polh) של הגנום מולטי-nucleopolyhedroviral Autographa קליפורניה הבונה וכתוצאה מכך הוא ואז וסודרו ולאמת את המסגרת הנכונה קריאה פתוחה (ORF). הבונה הנכון ואז מוחדרים התא המארח חרקים בתהליך של תרביות תאים. הגן עניין מוכנס לתוך הגנום הנגיפי מאת רקומבינציה הומולוגית. אירוע זה תוצאות בייצור של הגנום הנגיפי רקומביננטי, אשר משכפל ואז לייצר רקומביננטי budded חלקיקי וירוס1.

התאים חרקים המשמשים בדרך כלל במערכת הביטוי הם תאים (Hi5) Sf9 וגבוהה חמש. תאים Sf9 הם בידוד המשובטים של Sf21, נגזר מן התאים השחלות הגולמי של זחל כנימה frugiperda, והם Hi5 תאים בידוד המשובטים נגזר הורים Trichoplusia ni תא השחלות קו TN-3684,5. Transfections שיתוף וירוס הגברה, מבחני פלאק מתנהלים על תאים Sf9, ואילו תאים Hi5 נבחרו בדרך כלל לייצר כמויות גבוהות של חומרים6. ראוי לציין כי התאים Hi5 אינם מתאימים עבור דור ו הגברה של וירוס progenies נטייתם לייצר וירוסים מוטציה. באופן מסורתי, טווח טמפרטורה 25-30 מעלות צלזיוס נחשבת טובה לגידול תאים חרקים. עם זאת, דווח שיש 27-28 מעלות צלזיוס טמפרטורה אופטימלית עבור תא חרקים וצמיחה של זיהום7,8.

המבוא של רצף קליטה טובה שקדמו הגן נדרש עבור הביטוי גבוהה של החלבונים המופרש. הרצף אות ביעילות ידריך את חלבון רקומביננטי מתורגם לתוך רשתית תוך-פלזמית עבור הפרשת חלבונים ושינויים post-translational הכרחי עבור קיפול תקין וייצוב3. האות פפטיד רצפים, כגון אופפים baculovirus חלבון GP64/67, דבורת דבש melittin ואחרים, נבחרו כדי להקל על הביטוי של הפרשה חומרים של מערכות ביטוי בתיווך baculovirus3. המבוא של פפטיד האות של GP67 הוכח לשפר את התשואה ביטוי של חלבון רקומביננטי המופרש, לעומת שימוש של פפטיד אות מהותי של ג'ין היעד9. Hemolin הוא חלבון hemolymph של ענק משי העש Hyalophora cecropia, המושרה על זיהום חיידקים10. בשל רמה גבוהה יחסית של ביטוי מושרה, אות פפטיד רצף הגן יכול לשמש כדי לתווך הביטוי הפרשה חומרים במערכת baculovirus-חרק תא.

לבנה א Tracheary רכיב בידול מעכבות פקטור קולטן (TDR) ואבקה קולטן קינאז 3 (PRK3) שניהם שייכים למשפחת חוזר קולטן דמוי קינאז (LRR-RLK) צמח לאוצין-עשיר של חלבונים11,12 . כדי ללמוד את המבנה והתפקוד של משפחה זו של קולטן פרוטאינים צמחיים, כמו גם כדי להקל על אפיון הביוכימי מבניים אחרים פרוטאינים צמחיים מופרש למערכת ביטוי תא baculovirus-חרק שונתה כדי לשפר את התשואה איכות, ייצור חלבונים. חוץ-תאית לתחומי TDR והן PRK3 בהצלחה כבר הביעו באמצעות שני וקטורים ביטוי שונה במערכת הביטוי תא baculovirus-חרק. יש כבר גיבש בשני תחומים חוץ-תאית החלבונים TDR ו- PRK3. מאמר זה מדווח את הביטוי ואת טיהור של כמויות גדולות של חלבונים רקומביננטי צמח מופרשים עם שני baculovirus ששונה ביטוי וקטורים על ידי שילוב של GP67 או hemolin אות רצף בין יזם את שיבוט מרובים אתרים.

Protocol

הערה: מערכת תא חרקים/baculovirus עם ביטוי שונה וקטורים עבור ביטוי חלבון צמחי הפרשה וגיבוש משמש.

1. שינוי של וקטור הביטוי Baculovirus עם פפטיד אות GP67 לביטוי הפרשת חלבון צמחי

  1. לסנתז קטע DNA המכיל של 5' BglII חיתוך האתר13הרצף אות הפרשת GP67, אתר רב-שיבוט עם NotI, BamHI, EcoRI, StuI, סאלי, SpeI, XbaI, PstI ו XhoI (איור 1 א').
    הערה: מאז הן BglII והן BamHI מתעכל דנ א הביא הקצוות דבק אותו, הווקטור ליניארית ניתן מאתרים ומפסיקים למקטע הדנ א מתעכל בעוד אתרים הן BglII והן BamHI ברצף מצדו annealed מוטציה רצף שאינו cleavable על ידי או BglII או BamHI14.
  2. תקציר 4 µg של ה-DNA עם BglII, XhoI, µg 4 של וקטור ביטוי DNA עם BamHI ו- XhoI14. לערבב 10 יחידות של כל אנזים הגבלה עם דנ א ב 1 x ריכוז מאגר התגובה (אצטט אשלגן 50 מ מ, 20 מ מ טריס-אצטט אצטט מגנזיום 10 מ מ, 100 µg/mL BSA, pH 7.9 25 ° c), דגירה התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    1. לטהר את מקטע ה-DNA נכרת, הווקטור ליניארית DNA על-ידי ערכת15החילוץ ג'ל הדנ א.
  3. מיקס 100 ננוגרם של וקטור ליניארית DNA עם 400 ננוגרם של ה-DNA מתעכל קטע בתוך תערובת התגובה מצדו 10-µL המכילה 1-T4 DNA ליגאז התגובה מאגר (50 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ MgCl2, 1 מ מ ATP ו- 10 מ"מ. DTT, pH 7.5 ב- 25 ° C) ו- 5 יחידות של ה-DNA T4 ליגאז. דגירה תערובת התגובה ב 16 ° C עבור 16 h.
  4. להפוך µL 5 של תערובת מצדו µL 100 DH5α תאים המוסמכת בעקבות פרוטוקול סטנדרטי טרנספורמציה ובחר את המושבות המתקבלת על מטוס צלחת אגר אמפיצילין-LB16. לאסוף 5-10 מושבות ולגדול כל המושבה ב 2 מ ל LB בינוני המכיל אמפיצילין µg/mL 100 ב 220 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס חממה חזק עבור 16 h.
  5. תמצית כל פלסמיד DNA עם ערכת miniprep17 דנ א ואשר השיבוטים מאת רצפי DNA עם פריימר AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
  6. PCR-להגביר הגן TDR לבנה א קטע קידוד שאריות 30-642 מן הגן TDR סינתטי לבנות (קדימה פריימר: פול GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, פריימר הפוכה: GC GGATCC CTA חברתנו חברתנו ATG חברתנו חברתנו חברתנו ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). להגביר את ה-DNA 30 מחזורים במאגר תגובת ה-DNA פולימראז המכיל תערובת dNTP 0.5 מ מ, 0.2 µM תחל, µg 0.1 של תבנית ה-DNA, MgCl 0.4 מ מ2ו- 1 יחידה התגובה של ה-DNA פולימראז.
    1. עבור הצעדים מחזור ה-PCR, להגדיר את דנטורציה הראשונית ב 95 ° C ל 30 s ולאחר מכן 30 מחזורים של דנטורציה ב 95 ° C ל 30 s, חישול ב 55 ° C s 30, ואת סיומת ב-72 מעלות עבור 1 דקות, עם סיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 5 דקות.
  7. לעכל את מקטע ה-PCR והן וקטור שונה עם אנזימי הגבלה endonuclease NotI ו- BamHI. מאתרים ומפסיקים את השבר ג'ין עם וקטור ליניארית. מיקס 100 ננוגרם של וקטור ליניארית DNA עם 400 ננוגרם של ה-DNA מתעכל קטע בתוך תערובת התגובה מצדו 10-µL T4 DNA ליגאז התגובה מאגר המכיל 5 יח ל T4 DNA ליגאז. דגירה תערובת התגובה ב 16 ° C עבור 16 h.
  8. להפוך µL 5 של תערובת מצדו µL 100 DH5α תאים המוסמכת בעקבות פרוטוקול סטנדרטי טרנספורמציה ובחר את המושבות המתקבלת על מטוס צלחת אגר אמפיצילין-LB16. לאשר את השיכפולים הנכונה על ידי רצפי DNA.

2. שינוי של וקטור הביטוי Baculovirus עם פפטיד אות חרקים Hemolin לביטוי הפרשת חלבון צמחי

  1. לסנתז קטע DNA המכיל של 5' BglII חיתוך האתר13, הרצף אות הפרשת hemolin חרקים ו אתר רב-שיבוט עם NotI, BamHI, EcoRI, StuI, סאלי, SpeI, XbaI, PstI ו XhoI (איור 1B).
  2. תקציר 4 µg של ה-DNA עם BglII, XhoI, µg 4 של וקטור ביטוי DNA עם BamHI ו- XhoI14. לערבב 10 יחידות של כל אנזים הגבלה עם דנ א ב 1 x ריכוז מאגר התגובה (אצטט אשלגן 50 מ מ, 20 מ מ טריס-אצטט אצטט מגנזיום 10 מ מ, 100 µg/mL BSA, pH 7.9 25 ° c), דגירה התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    1. לטהר את מקטע ה-DNA נכרת, הווקטור ליניארית DNA על-ידי ערכת15החילוץ ג'ל הדנ א.
  3. מיקס 100 ננוגרם של וקטור ליניארית DNA עם 400 ננוגרם של ה-DNA מתעכל קטע בתוך תערובת התגובה מצדו 10-µL המכילה 1-T4 DNA ליגאז התגובה מאגר (50 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ MgCl2, 1 מ מ ATP ו- 10 מ"מ. DTT, pH 7.5 ב- 25 ° C) ו- 5 יחידות של ה-DNA T4 ליגאז. דגירה תערובת התגובה ב 16 ° C עבור 16 h.
  4. להפוך µL 5 של תערובת מצדו µL 100 DH5α תאים המוסמכת ובחר את המושבות על צלחת אגר אמפיצילין-LB. לאסוף 5-10 מושבות ולגדול כל המושבה במדיום LB 2-mL המכיל 100 µg/mL של אמפיצילין-220 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס חממה חזק עבור 16 h.
  5. לחלץ את הדנ א פלסמיד עם ערכת miniprep17 דנ א ואשר השיבוטים מאת רצפי DNA עם פריימר AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
  6. להגביר את-PCR לבנה א אבקה קולטן קינאז 3 (PRK3) ג'ין פרגמנט קידוד שאריות 20-237 מ בונה ג'ין PRK3 סינתטי (קדימה פריימר: פול GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, פריימר הפוכה: CGC GGATCC CTA חברתנו חברתנו ATG חברתנו חברתנו חברתנו TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). להגביר את ה-DNA 30 מחזורים במאגר תגובת ה-DNA פולימראז המכיל תערובת dNTP 0.5 מ מ, 0.2 µM תחל, µg 0.1 של תבנית ה-DNA, MgCl 0.4 מ מ2ו- 1 יחידה התגובה של ה-DNA פולימראז.
    1. עבור הצעדים מחזור ה-PCR, להגדיר את דנטורציה הראשונית ב 95 ° C ל 30 s ולאחר מכן 30 מחזורים של דנטורציה ב 95 ° C ל 30 s, חישול ב 55 ° C s 30, ואת סיומת ב-72 מעלות ל 30 s בתוך כל מחזור, והסיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 5 דקות.
  7. לעכל את מקטע ה-PCR והן וקטור שונה עם אנזימי הגבלה endonuclease NotI ו- BamHI. מאתרים ומפסיקים את השבר ג'ין עם וקטור ליניארית. מיקס 100 ננוגרם של וקטור ליניארית DNA עם 400 ננוגרם של ה-DNA מתעכל קטע בתוך תערובת התגובה מצדו 10-µL T4 DNA ליגאז התגובה מאגר המכיל 5 יח ל T4 DNA ליגאז. דגירה תערובת התגובה ב 16 ° C עבור 16 h.
  8. להפוך µL 5 של תערובת מצדו µL 100 DH5α תאים המוסמכת בעקבות פרוטוקול סטנדרטי טרנספורמציה ובחר את המושבות המתקבלת על מטוס צלחת אגר אמפיצילין-LB16. לאשר את השיכפולים הנכונה על ידי רצפי DNA.

3. ייצור, הגברה של Baculovirus בונה מחסה בקלטת ביטוי חלבון רקומביננטי

  1. שימוש 100 ננוגרם של פלסמיד לבנות להפוך µL 40 תאי המוסמכת DH10Bac בעקבות הפרוטוקול של מערכת ביטוי baculovirus1. דגירה הלוחות טרנספורמציה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  2. לאסוף שתי מושבות לבן של כל צלחת טרנספורמציה, לחסן כל המושבה לתוך 2 מ ל LB בינוני המכיל 50 µg/mL kanamycin, גנטמיצין µg/mL 7 ו- 10 µg/mL טטרציקלין. לפי התקנון של baculovirus ביטוי מערכת1 כדי לחלץ ולוודא את bacmid ה-DNA. Aliquot כל DNA שני צינורות עם 20 µL כל אחד, ולאחסן את הצינורות ב-20 ° C.
    הערה: השלבים הבאים מחייבים פעולה אספטי.
  3. לגדול עם טפט של תאים Sf9 האנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין תרבות המדיה עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 100 µg/mL (או 100 I.U./mL) ב 27 ° C 80% זרימה לתוך צלחת 6-. טוב. להעריך את אחוז הנהרות בהתאם לאחוז אזור מכוסה בצלחת תרביות רקמה.
  4. הכינו את הפתרונות הבאים לפי שני צינורות סטרילי 1.5-mL צנטריפוגה.
    1. צינור 1: עבור כל תרביות תאים, למהול 20 µL של bacmid ה-DNA לתוך µL 100 unsupplemented Sf9 תא תרבות בינוני ללא אנטיביוטיקה. מערבבים בעדינות הדילול על ידי מצליף את הצד של הצינור.
    2. צינור 2: עבור כל תרביות תאים, לדלל 8 µL של השומנים תרביות תאים ריאגנט לתוך µL 100 unsupplemented Sf9 תא תרבות בינוני ללא אנטיביוטיקה. לערבב הדילול ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה עבור 6 x.
  5. לשלב את שני פתרונות, מערבבים בעדינות על-ידי pipetting לאט לאט מעלה ומטה עבור 3 x ולאחר תקופת דגירה אותם של 20-40 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. תשטוף כל טוב של טפט Sf9 תאים 2 x 3 מ של unsupplemented Sf9 תא תרבות בינונית ללא אנטיביוטיקה. עבור כל תרביות תאים, להוסיף 0.8 מ של unsupplemented Sf9 תא תרבות בינונית ללא אנטיביוטיקה כל שפופרת המכילה את התערובת השומנים-DNA. לערבב בעדינות את התוכן של הצינורות על ידי pipetting לאט לאט מעלה ומטה עבור 3 x. האחות שטיפת המדיה מן הלוחות, כיסוי הדגימות עם התערובת תרביות תאים.
  7. לאחר התוספת של התערובת תרביות תאים, דגירה את הצלחת transfected עבור 5 שעות ב-27 º c להחליף את המדיה תרביות תאים המדיום מלאה של תרבות תא Sf9 המכיל 10% FBS ו µg 100/mL (או 100 I.U./mL) האנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה את הצלחת transfected ב 27 ° C עבור 4 d.
  8. הקציר ומגבירים את baculovirus רקומביננטי.
    1. לאסוף את תגובת שיקוע של צלחת נגוע צינור חרוטי 15-mL סטרילית לאחר 4 d של דגירה. לסובב את תגובת שיקוע ב x 1010 g עבור 5 דקות כדי להסיר את שאריות תאים. למחוק בגדר decant את תגובת שיקוע על צינור נקי, לאחסן אותו ב 4 ° C עד 1 שנה.
      הערה: זהו וירוס P0. זה יכול להיות aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס לתקופה ארוכה יותר של זמן.
    2. כדי להגביר את כל וירוס רקומביננטי, לגדול טפט של תאים Sf9 על צלחת 150-מ מ 80% הנהרות. האחות התקשורת מהצלחת, להוסיף 2 מ"ל של הנגיף P0 כנצרות תאים לצלחת, דגירה את הצלחת. בשביל 1 h בחממה 27 ° C. סלע את הצלחת כל 15 דקות לערבב את המדיום עם התאים.
      1. להוסיף 25 מ של המדיה של גרייס מלא המכיל 10% FBS ו µg 100/mL (או 100 I.U./mL) האנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה את הצלחת. בשביל בתלת-ממד בחממה 27 ° C כדי להשיג את הוירוס מעבר P1.
    3. לאסוף את תגובת שיקוע של צלחת נגוע סטרילי 50-mL צינור חרוטי ו ספין-x 1010 g עבור 5 דקות כדי להסיר את שאריות תאים. Decant את תגובת שיקוע על צינור נקי ואחסן אותו ב 4 ° C עד 1 שנה.
      הערה: הווירוס P1 ניתן aliquoted מאוחסנת ב- 80 ° C לתקופה ארוכה יותר של זמן.
    4. כדי להגביר את הווירוס מ- P1 ל- P2 המעבר, לגדול טפט של תאים Sf9 על צלחת 150-מ מ 90% הנהרות, תשאף התקשורת של הצלחת, להוסיף 2 מ"ל של הנגיף P1 לצלחת, תקופת דגירה זה של 1 ש ח בחודש חממה 27 ° C.
    5. חזור על שלבים 3.8.2 ו 3.8.3 כדי להשיג את הקטעים P2, P3 של וירוסים. אל תאחסן את הוירוס P3 ליותר מ- 2 חודשים.

4. חלבון ביטוי, טיהור עם נינטה, התגבשות

  1. תרבות 1 ליטר בתאי חרקים Hi5 האנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין תרבות המדיה עם µg 100/mL (או 100 I.U./mL) על צפיפות של 2 x 106 -100 סל"ד ב שייקר אינקובטור 27 ° C. ספין למטה התאים ב x 570 גרם במשך 5 דקות, decant את תגובת שיקוע, resuspend התאים 20 מ"ל של הנגיף P3 טריים המיוצרים ולשמור אותו בטמפרטורת החדר עבור ה 1 לנער בעדינות את הבקבוק ספין כדי resuspend את התאים 1 x כל 15 דקות.
  2. להעביר את התאים 1 ליטר של תרבות התקשורת עם µg 100/mL (או 100 I.U./mL) סטרפטומיצין פניצילין אנטיביוטיקה, התרבות התאים ב 100 סל"ד ב שייקר אינקובטור 27 ° C עבור ה 72 ספין למטה התאים ב 1,010 x g למשך 5 דקות ולאסוף את תגובת שיקוע.
  3. מחוון ה-pH השתמש רצועות כדי להתאים את ה-pH של תגובת שיקוע כדי 8.0 על-ידי הוספת 0.1 M HCl או 0.1 M NaOH ולהוסיף איגוד מאגר-ריכוז סופי, המכיל מאגר טריס 20 מ מ ב- pH 8.0, 100 מ מ NaCl, ו- 5 מ מ imidazole. להוסיף כמות מסוימת של שרף נינטה (10-40 מ"ל) מבוסס על התשואה המשוערת של ביטוי שלו מתויג רקומביננטי החלבון.
    1. לערבב הפתרון על מהומה מגנטי עם מהירות נמוכה ב 4 ° C עבור 1 ח' שטיפת השרף, elute החלבון מאוגד בעקבות תקן נינטה טיהור פרוטוקול18.
  4. נושא החלבון מטוהרים יונים, ג'ל סינון כרומטוגרפיה, כמו גם שיטות טיהור אחרות חלבון, להניב מדגם הומוגני.
    הערה: עבור ectodomain TDR, 20 מ מ. טריס, pH 8, 100 מ מ NaCl שימשו בתור מאגר סינון ג'ל. עבור ectodomain PRK3, 20 מ מ bis-טריס, ה-pH 6, 100 מ מ NaCl שימשו המאגר סינון ג'ל המועדפת.

תוצאות

כפי שמוצג באיור1, שני וקטורים הביטוי baculovirus pFastBac1 ששונה שימשו כדי לבטא את החלבונים מופרשים עם GP67 או את רצף אות hemolin להחליף את האות מהותי רצף הגן היעד. את GP67 ויראלי, הגנים hemolin חרקים הוכחו יש רמות הביטוי הפרשת גבוהה בתאים. פיוז'ן חלבונים עם אחת משתי אלה שני סיקו...

Discussion

לאור המגוון גודל ויציבות של אלפי חלבונים המצויים המערכות הביולוגיות, זה לעיתים קרובות אמפירי עבור מחקר מעבדה כדי להחליט באיזו מערכת ביטוי heterologous יש שייבחרו עבור הביטוי של חלבון ספציפי. מערכת ביטוי e. coli היא לעיתים קרובות הבחירה הראשונה עבור ביטוי חלבון עקב מחזור החיים הקצר של החיידקי...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרנות הפעלה סגל החדשות של צפון קרוליינה סטייט עבור שו Guozhou.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Incubator shakerVWRModel Excella E2527 oC
IncubatorVWRModel 200527 oC
CentrifugeBECKMANModel J-6with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA PolymeraseAgilent600677-51For PCR amplification of DNA
Thermal CyclerBIO-RADModel C1000 TouchFor PCR amplification of DNA
Incubator shakerNew Brunswick ScientificModel I 24For growing baceria culture
Customer DNA synthesisGENSCRIPT
BamHI (HF)New England BiolabsR3136SRestriction Endonuclease
BglIINew England BiolabsR0144SRestriction Endonuclease
NotI (HF)New England BiolabsR3189SRestriction Endonuclease
XhoINew England BiolabsR0146SRestriction Endonuclease
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202TDNA ligation
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104Plasmid DNA purification from bacteria culture
AgaroseThermo Fisher Scientific15510-019For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cellInvitrogen18-258-012For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB BrothResearch Product International Corp.L24066-5000.0For making bacteria culture
Ampicillin sodium saltThermo Fisher Scientific11593-019Antibiotics
Kanamycin SulfateThermo Fisher Scientific15160-054Antibiotics
TetracyclineThermo Fisher Scientific64-75-5Antibiotics
GentamicinThermo Fisher Scientific15710-064Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cellsThermo Fisher Scientific10361-012For making bacmid DNA
S.O.C. MediumThermo Fisher Scientific15544-034For DNA transformation
CellFECTIN II ReagentThermo Fisher Scientific10362-101Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression SystemThermo Fisher Scientific10359-016Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-galThermo Fisher Scientific15519-028For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTGThermo Fisher Scientific15529-019For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1Thermo Fisher Scientific10360014Baculorirus expression vector
Sf9 cellsThermo Fisher Scientific11496015Sf9 monolayer cells
Hi5 cellsThermo Fisher ScientificB85502High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplementedThermo Fisher Scientific11595030Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplementedThermo Fisher Scientific11605102Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFMThermo Fisher Scientific10902104Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFMThermo Fisher Scientific10486025Hi5 cell culture medium
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081100 ml
FBS CertifiedThermo Fisher Scientific16000-044500 ml
6-well platesThermo Fisher Scientific08-772-1BFlat-bottom
150 mm platesThermo Fisher Scientific353025100/case
1.5 ml Microcentrifuge TubesUSA Scientific1415-2500500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubesUSA Scientific1475-051125 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubesUSA Scientific1500-121125 tubes/bag
Ni-NTA SuperflowQiagen30430NiNTA resin
pH-indicator stripsEMD Millipore Corporation1.09535.0001pH 0 - 14

References

  1. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
  2. Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
  3. Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
  4. Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
  5. Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
  6. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology - Animal. 29A, 388-390 (1993).
  7. Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
  8. Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
  9. Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
  10. Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
  11. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317 (2017).
  12. Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796 (2018).
  13. Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
  14. Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
  15. Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
  16. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
  18. Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
  19. Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
  20. Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
  21. Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
  22. Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
  23. Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
  24. Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
  25. Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
  26. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
  27. Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
  28. Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
  29. Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138baculovirusGP67hemolinbacmid

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved