חיתוך ושיטת צף בשביל לרקמות פרפין-מוטבע על חלוקתה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לשפר את חלוקתה פרפין. שיטה זו משלבת חיתוך צף באמצעות תא תרמוסטטי פשוטות כדי למנוע את תהליך ההעברה הנדרש על-ידי השיטה המקובלת. כתוצאה מכך, את היעילות ואת מספר קטעים שלמים פרפין היו השתפרה מאוד.

Abstract

חלוקתה של הרקמה פרפין-מוטבע הוא בשימוש נרחב כיום מגוון של פתולוגיה. עם זאת, מייגע. כדי לשפר את שיטה זו, מספר חברות מסחריות פיתחו מערכות העברת מקטע מורכבים באמצעות מים נוזלים. כדי לפשט את הטכנולוגיה הזאת, יצרנו שיטה פשוטה באמצעות ציוד ביתי המשלב הביתור ועל צף בתוך תא תרמוסטטי פשוטה; לכן, הסעיפים להזין באופן אוטומטי את המים הרותחים על פני המים. ההיפוקמפוס מוח העכבר למבוגרים, העכבר למבוגרים כליות, מוח העכבר מתחלקים, עיניים למבוגרים דג זברה נחתכו באמצעות חלוקתה הפרפין קונבנציונליים והן בשיטת הציג להשוואה. ניתוח סטטיסטי מראה שיפור השיטה שלנו הזמן שנחסך המיוצר חלקים באיכות גבוהה יותר. בנוסף, פרפין חלוקתה של הדגימה כל תוך זמן קצר קל עבור מפעילי ג'וניור.

Introduction

מחקר מורפולוגי חשוב במחקר הביולוגי. למרות הטכנולוגיה החדשה אפשרה לחוקרים לבחון את המטרות שלהם ישירות מן כל רקמות או אורגניזמים^1,2,3, חיתוך הדגימה למקטעים דק, ואחריו מכתים, נשאר הראשית מורפולוגיה של רקמות היחיד של שיטה ולא לקחת כסף אבל גם חלבון מיקוד ישירות בתוך הרקמה. מיקרוסקופ אור עושה שימוש בשלושה סוגי המקטעים: פרפין, מוקפאים, ולא semithin. למרות cryosectioning נפוץ להגנה על רקמות antigenicity, הכנת הדגימה היא פשוטה, המורפולוגיה רקמות יתרת הוא עני, מצוייה דק אופטים^4,5. פרפין חלוקתה היא השיטה השכיחה בתערוכה מורפולוגיה השתמרה היטב. דגימות הן מיובשת לגמרי, המוטבעות שעווה, ניתן לאחסן את אבני פרפין ללא הגבלת זמן. בנוסף, פרפין חלוקתה מייצרת חלקים דקים לשפר את הגישה בדיקה ביולוגית בניסויים נוספים ולהפחית תא כיסוי שכבת בכיוון Z.

עם זאת, חלוקתה הפרפין קונבנציונליים הוא מייגע, דורש מיומנות מפעיל. פרפין מקטעים לעבור קיבוע התייבשות, הטבעה, חותכים, צף. חשוב, העברת סרטים סעיף מהמחזיק סכין לאמבט מים הוא הכרחי, אבל קשה עבור מפעילי ג'וניור. בעיקר אוויר יבש, הסרטים סעיף חשל עקב חשמל סטטי ולכן קשה נפרשים על פני מים חמים. כדי לשפר את סעיף איכות, הרטבה השטח חשוף רקמות בין מיקרוטום להב מעברים, קירור הבלוקים השעווה הטבעית אותם במי קרח, או העלאת הלחות עם מכשיר לחות ליד האזמל הקטן מומלץ^6,7 . שיטות חדשות לשיפור פרפין חלוקתה כוללים היברידית הטבעה פרפין, cryosectioning⁸ו מחלקה מסחרית העברת מערכת סיוע⁹. למרות השיטות לשפר באופן חלקי פרפין חלוקתה מהירות ואיכות, הם גורמים חלוקתה הרבה יותר מסורבלת, מערכות העברת מקטע מסחריים יקרים.

ב פרוטוקול זה, נדגים כיצד ליצור פשוט, זול וגמיש ציוד צעד אחר צעד, אשר ניתן לחבר בעל להב מיקרוטום רוטרי. ציוד זה כולל ערוץ סעיף באמבט מים, תנור עם מתג זיהוי טמפרטורה. לאחר חיתוך, עשרות סעיפים לזרום לתוך הערוץ מדור והזן את המים הרותחים ישירות, ובכך התגלגלות באופן אוטומטי. זה משפר את היעילות של פרפין חלוקתה, הופך את הטכנולוגיה הזו נוחה יותר. שימוש זו שיטה, הבוגרים יותר בעכבר מקטעים בהיפוקמפוס, העכבר למבוגרים כליות מקטעים, עובריים 15.5 מיושן (E15.5) העכבר המוח, ומקטעים עין דג זברה בוגרת מקטעים היו קוצרים בפחות זמן, נשארה יותר מורפולוגית. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור דגימות רקמה אחרים הדורשים פרפין מואצת חלוקתה תוך הימנעות איבוד ההבחנה סעיף.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת נאנצ'אנג.

1. להרכיב את הציוד ולחבר את האזמל הקטן

1. עיצוב הפרמטר לפי הדרישות (Supplementary איור 1).
2. להגיש את הפרמטר במפעל מקומי לייצור לוחות אקריליק.
3. להרכיב את כל החלקים ברצף: שימוש בכלורופורם לשילוב 7 לוחות אקריליק מסחריים לתוך טנק עם סעיף ערוץ ומים אמבטיה (איור 1).
   התראה: כלורופורם מייצר חומרים רעילים כאשר היא עונה אור וחמצן. להרכיב את המנגנון בשכונה fume.
4. התקנת הרכיב חשמליים דרך החור בלוח אקריליק #1 (איור 2 א, ראש חץ).
5. כדי להתקין את בקר טמפרטורה, ליצור חור קטן על הלוח אקריליק #2 באמצעות מקדחה חשמלית, ולהתקין גלאי טמפרטורה (איור 2 א, חץ). להתקין תרמוסטט דיגיטלית על הטנק (איור 2 א).
   הערה: גלאי טמפרטורה צריך להיות בתוך 1 ס מ מתחת לפני המים.
6. כדי לספק גישה כוח, להתאים את המתח מתחת 24 V לפני הפעלת הציוד.
7. הסר את המגש פסולת סעיף האזמל הקטן.
8. קישור התעלה מקטעים עם בעל להב מיקרוטום עם איטום סיליקון ניטראלי (איור 2B).
   הערה: לא ימרחו כלשהו איטום סיליקון ניטראלי מעל החלק העליון של הלהב כך הלהב הישן מוחלף בקלות.
9. יבש לילה כדי לאפשר את הכלורופורם ואת הזמן איטום סיליקון ניטראלי לגבש.
10. התקן את הלהב בעל להב. יוצקים מים לאמבט המים (איור 2C). פני המים צריך רק לגעת העליון של הלהב (ראש חץבאיור 2D, ).

2. פרפין חלוקתה

הערה: פסולת לצבור לעיתים קרובות על הקצה העליון או התחתון של הרחוב שעווה, פני המים. יש לנקות את הלכלוך הזה באופן קבוע.

1. לבצע הפרפין קונבנציונליים חלוקתה¹⁰.
   1. תהדק את הדגימה פרפין-מוטבע על מיקרוטום סיבוביים ולמקם את הלהב בעל להב.
   2. להפוך את handwheel, סעיף הדגימה.
   3. העברת הכלים פרפין למחלקה לאמבט מים חמים 38.5 מעלות צלזיוס.
   4. לאסוף שהסעיפים אל המיקרוסקופ שקופית של פני המים לאחר התגלגלות.
   5. יבש את השקופיות בתנור ב 42 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. פרפין משופרת חלוקתה (איור 3)
   1. הפעל את הציוד.
   2. לפתוח את התנור עם מתג זיהוי טמפרטורה ולהגדיר את הטמפרטורה יישוב בין C º 38.0 40.0 מעלות לשעה מראש לחמם את המים.
   3. לשנות לבלוק פראפין שרכשה פרפין להטביע; אז במקום לבלוק פראפין על המלחציים קלטת של מיקרוטום ונעל אותה.
      הערה: גבולות לכוחו של הרחוב פרפין צריך להיות שונה בצורה אופקית כדי למנוע רצועת סעיף מ ויוצרים קשת ולהיות מסוגלים לזרום דרך ערוץ קטעים צרים.
   4. במהירות הגישה המדגם על ידי חיתוך להקשיה.
   5. התאם בעובי סעיף מתאים (10 מיקרומטר מוח העכבר למבוגרים, למבוגרים העכבר הכליות של העובר מוח העכבר, 4 מיקרומטר לעיניים דג זברה). להפוך את handwheel ואת הסעיפים יזין באופן אוטומטי את המקטעים ערוץ ואמבט.
   6. בסעיף הדגימה במשיחה חיתוך איטית ואחידה (איור 3 א).
      הערה: Thethickness של המקטע הראשון תשונה לאחר handwheel הופסק למשך מספר דקות. יש להחליף את הלהבים חד פעמי כאשר הסעיפים יש שריטות רצופים.
   7. מדריך הסעיפים לחדר אמבטיה לצוף בקו (איור 3B, ג 3).
      הערה: אם שבאזור head לאנאפוליס הקיר קאמרית, השתמש מדריך מברשת לשמור אותו צף.
   8. דבקים סעיפים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. לאחר הסעיפים לחלוטין נפרשים באמבט מים, מספר מקטעים נפרדים עם פינצטה. אז להרים מהאמבטיה מים על גבי שקופיות מיקרוסקופ (דמות תלת-ממד).
      הערה: סעיפים יש לאסוף מן הצד האחורי של האמבט במים, כמו אלה בערוץ חלקים, החלק הפנימי. של האמבטיה מים לא עדיין יהיה מלא פרש.
   9. יבש את השקופיות על-ידי הצבתם בתנור 42 º C למשך הלילה. השקופיות ואז ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.
3. השתמש Hematoxylin-אאוזין (HE) צביעת לצורך הערכה של שיטה משופרת⁸.

תוצאות

השיטה משופרת גדל מספר קטעים שלמים פרפין. בדקנו שיטה חדשה על רקמות בהיפוקמפוס העכבר למבוגרים, העכבר למבוגרים כליות, מוח העכבר מתחלקים עיני דג זברה. מים נוסף למיכל, טמפרטורת המים נשמר בין 38.0 ° C עד 40.0 מעלות צלזיוס. לאחר באופן סדרתי הכנת את דגימות הרקמות, היו למחלקה, בהשוואה חל...

Discussion

כדי לשפר מורפולוגיה סעיף פרפין לפתור את הבעיה של זמן מבוזבז במהלך הפרפין קונבנציונליים חלוקתה, יצרנו של פרפין משופרת חלוקתה שיטה המשלבת חיתוך התגלגלות. שיטה משופרת זו מסתמכת על ציוד פשוטה שכוללת ערוץ סעיף, אמבט מים, תנור עם מתג זיהוי טמפרטורה. הכלים סעיף נכנס לאמבט מים דרך ערוץ סעיף, מתגלה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Boekel Scientific	133000-2
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	64-17-5
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	1330-20-7
Paraplast	Leica	39601006
Heated Paraffin Embedding Module	Leica
Commercial acrylic board
Trichloromethane	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	67-66-3
Tubular electric heating element(12 V 200 W)
Temperature controller(12 V 120 W)	Mingsuo	XH-W3002
Rotary microtome	Leica
Neutral silicone sealant			Link the water channel with the microtome knife holder
Voltage transformer	Dearll	S-250-12
Disposable blade	Accu-Edge	4689
Hematoxylin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Eosin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Microslide	Sail Brand	7105
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid	10004160
Coverslip	Citoglas	10212424C
Microscope	Carl Zeiss
Hydrochloric acid	Xilong Chemical	7647-01-0
Water bath for paraffin sections	Leica
HistoCore Arcadia C - Cold Plate	Leica
paraffin repellent spray	Thermo Scientific	9990420