לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

Abstract

ניתן לנטר את הפעילות החשמלית של תאי ברקמות בטכניקות אלקטרופיזיולוגיות, אך אלה הם בדרך כלל מוגבל לניתוח של תאים בודדים. מאז עלייה של תאיים סידן (Ca^{2 +}) ציטוזול מתרחש לעיתים קרובות בגלל הפעילות החשמלית, או בתגובה מספר עצום של גירויים אחרים, תהליך זה יכול להיות במעקב על ידי ההדמיה של תאים נטען עם פלורסנט סידן רגיש צבענים.  עם זאת, קשה תמונה תגובה זו בסוג של תא בודד בתוך רקמת כל כי צבע אלה נתפסות על ידי כל סוגי תאים בתוך הרקמה. לעומת זאת, סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים (GECIs) יכול לבוא לידי ביטוי על ידי סוג של תא בודד, לזרוח בתגובה לעליה של תאיים Ca^{2 +}, וכך מאפשר ההדמיה של Ca^{2 +} איתות של אוכלוסיות שלמות של סוגי תאים בודדים. כאן, אנו מיישמים את השימוש של GECIs GCaMP3/6 לצומת neuromuscular העכבר, תאי שוואן סינפסה התלת-צדדי בין מוטורי לגלוקוז, שרירי השלד מסוף/perisynaptic. נדגים את התועלת של טכניקה זו קלאסי שמחוץ רקמות ההכנות. שימוש של הפיצול אופטי, אנו מבצעים הדמיה כפולה באורך הגל של Ca דינמי^{2 +} אותות ותווית סטטי של צומת עצב-שריר (NMJ) בגישה זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לפקח על שני GECI תא ספציפי או מתח מקודדים גנטית אינדיקטורים (GEVI) בו זמנית. לבסוף, נדון את רוטינות המשמש ללכידה מפות מרחביות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. יחד, טכניקות אלו אופטי, מהונדס, אנליטית יכול להיות מועסק ללמוד את הפעילות הביולוגית של subpopulations תאים נפרדים ב- NMJ במגוון רחב של הקשרים.

Introduction

NMJ, כמו כל הסינפסות, מורכב משלושה אלמנטים: מסוף presynaptic נגזר תא עצב, תא נוירון postsynaptic/אפקטור, ותא perisynaptic גליה^1,2. בעוד ההיבטים הבסיסיים של ההעברה הסינאפסית היו שהראו-זה סינפסה³, היבטים רבים של תהליך זה נשאר לא ידוע, בחלקו בשל הביטוי של מולקולות אותו על ידי אלמנטים הסלולר ברורים של סינפסה הזה. לדוגמה, קולטני פורין אדנין נוקלאוטיד ATP והן אצטילכולין (ACh), אשר פורסם במשותף על ידי מנוע נוירונים ב- NMJ חוליות, באים לידי ביטוי על ידי שריר, תאי שוואן מוטורי לגלוקוז, ובכך שמסבך את הפירוש של כל השפעה תפקודית שהופעל על ידי אלה חומרים (למשל, משדר השחרור או תגובה, יצירת כח השריר)⁴. יתר על כן, למרות NMJ מרכיבי ה-tripartite פשוטים בהשוואה, לדוגמה, נוירונים במערכת העצבים המרכזית אשר לעתים קרובות להפגין תשומות סינפטית מרובים, אם המנוע נוירונים, תאי שריר או תאי שוואן להשתנות בתגובה לגירויים מבוסס על מהותי שלהם הטרוגניות (למשל, נגזרת עובריים, סוג של סיבים, מורפולוגיה) אינו ברור. על מנת לטפל בכל הבעיות הללו, זה יהיה יתרון לאתר בו זמנית את התגובה של תאים רבים בתוך אחד רכיב סינפטית, כמו גם מסלול, באותו הזמן, תגובה כזו גם שאר הרכיבים נפרדים. אסטרטגיות המקובלת באמצעות צבעם למדוד סידן איתות לא יכול להשיג שתי מטרות אלה, בגלל צבע שהוחל אמבטיה הוא נלקח על ידי סוגי תאים מרובים לאחר היישום לרקמות, צבע טעון intracellularly יכול לשמש רק לדמיין גדודים נפרדים או קטן של תאים. כאן, ניצול העכברים הטרנסגניים לבטא GECIs תוכנן כדי למדוד סידן לתא ספציפי איתות, יחד עם הדמיה ספציפית, כלי תוכנה⁵, אנחנו מדגימים הראשון של אלה שתי מטרות הכוללת ונדון כיצד התוספת של חדש כלים הטרנסגניים יעזור להשיג השני. טכניקה זו יהיה שימושי עבור מי שמעוניין מעקב אחר הדינמיקה סידן או אחרים הסלולר איתות האירועים נצפות דרך גן מקודד חיישנים אופטיים אוכלוסיות תאים מרובים בו-זמנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

גידול בעלי חיים, ניסויים בוצעו על פי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך עבור הטיפול, השימוש של חיות מעבדה, את IACUC-האוניברסיטה של נבאדה.

1. הכנת דיאפרגמות ועצבים הסרעפת מן העכברים הטרנסגניים

1. לרכוש העכברים הטרנסגניים לנוקלאוטידים גנוטיפ אלו עכברים.
   הערה: תחל מפורטים בדף "מידע" עבור כל אחד אלו עכברים.
   1. מתרבים עכבר 3 ל 6-בן חודש לבטא עותק אחד של המתאים הטרנסגניים/דפיקה-ב Cre-הנהג אלל ועותקים אפס של אלל GCaMP3/6 מותנה עם עכבר השניה, באותו הגיל לבטא אחד או שני עותקים של תנאי GCaMP3 / 6 אלל ועותקים אפס של אלל נהג-Cre.
   2. גנוטיפ הגורים ומארק אלה שיש להם Cre והן מותנה אללים GCaMP3/6 – אלה ייקרא מעתה העכברים הטרנסגניים-כפול (למשל, Myf5-Cre, GCaMP3 מותנה)⁶.
      הערה: בדרך זו, כל הנתונים תפיק מן עכברים המבטאים עותק אחד של Cre והן מותנה אללים GCaMP3/6. הדבר חשוב במיוחד בעת הוספת בעכברים המוטנטים אחרים (למשל, הסתרה) הצלבים.
2. מתי העכברים הטרנסגניים-כפול של הגיל המתאים (למשל, כמחנכת יום 0 או 5 [P0 או P5] או למבוגרים), המתת חסד העכברים על-ידי עריפת ראשו אותם עם מספריים (עבור עכברים צעיר יותר P10) או על-ידי הצבתם תא שאיפה איזופלוריין — כאשר הם כבר לא מגיבים צובט את הזנב עם זוג מלקחיים, הם מוכנים להקריב.
3. להקריב את החיה על ידי עריפת ראש עם זוג מספריים.
4. מדור באופן רוחבי על פני החיה כולו מתחת הכבד, מעל הלב והריאות במספריים iridectomy.
5. לנתח הכבד, הלב, הריאות, וישתדלו לשמור על אורך עצב הסרעפת היא ארוכה דיה להיגרר אלקטרודה היניקה (קרי, 1-2 ס מ).
   הערה: ניתן לזהות את עצב הסרעפת השמאלית כמו פיסת רקמה שמזין את החלק המדיאלי של הסרעפת השמאלית לבן. זה בטח לא לחתוך בעת הסרת הריאות. עצב הסרעפת נכון פועל בתוך פיסת fascia כי גם מכיל את הווריד הנבוב העליון הוא דק, לבן יותר הווריד הנבוב. יחד, הם שניהם לחדור הסרעפת נכון המדיאלי.
6. נוסף להסיר את בית החזה של עמוד השדרה, למעט הרכס דק סביב הסרעפת.
7. הכנס צינור microfuge עם פתרון קרבס-חיזוק עם µg 1/mL 594-αBTX 10 דקות בחושך על הסרעפת ועל המדגם עצב הסרעפת.
   הערה: בריכוז זה של 594-αBTX תוויות ACh קולטנים (AChRs) בלי לחסום את תפקידם (תצפית אישי).

2. גירוי ורישום של פוטנציאל פעולה שריר

1. באמצעות סיכות minutien, לשתק את הסרעפת על-ידי הצמדת אותם על צלחת 6 ס מ מצופה סיליקון ג'ל מבודד, מלא ~ 8 מ"ל של פתרון קרבס-צלצולים יותר מחומצן ולמקם אותו לבמה מיקרוסקופ. Perfuse את הסרעפת עם פתרון קרבס-חיזוק נוסף (8 מ לדקה) למשך 30 דקות.
   הערה: זה ומעכלת את לא מאוגד 594-αBTX, וכן equilibrates את הרקמה לאחר ניתוח.
2. הפוך אלקטרודה היניקה לפי שיטות הוקמה⁷.
   1. בהגדלה X 4, שימוש micromanipulator, זוז האלקטרודה היניקה עצב הסרעפת השמאלית ולהחיל שאיבה על-ידי הוצאת הקנה של מזרק 5-mL מחובר לאורך צינור שאליו מחובר האלקטרודה היניקה.
      הערה: כאשר בהצלחה נמשכים אל האלקטרודה היניקה, עצב הסרעפת הוא מתוח. להפעיל את ממריץ ולעורר את הסרעפת עצב על ידי flipping את ידני לעבור 1 x.
   2. ודא כי הסרעפת חוזים בתגובה הגירוי 1-הרץ על ידי חזותית בודק אותה עם תאורה brightfield. אם לא, להתאים את המתח על-ידי הפעלת הידית מתח מצטבר להשגת דופק supramaximal, אשר ניתנת לאימות כמקורית על-ידי בדיקה ויזואלית של התכווצות שרירים. אם עדיין לא גלוי, לכבות את העצב עם המזרק ולנסות לצייר אותה שוב על-ידי החלת שאיבה.
3. כבה את זלוף ולהוסיף את מעכב BHC שרירים ספציפיים צולבות הקישור חוטים שרירן⁶ או ממוצע-conotoxin⁸ אנטגוניסט ערוץ נתרן ממותגת מתח ריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
   1. 100 מיקרומטר BHC, פיפטה µL 4 של מניות 200 מ מ של דימתיל סולפוקסיד ולחצו predilute זה ב 1 מ"ל של פתרון קרבס-צלצול.
   2. הסר 1 מ"ל של פתרון קרבס-הצלצול של המנה.
   3. הוסף את BHC prediluted, למנה.
      הערה: predilution זו מסייעת למנוע את אינדוקציה על ידי דימתיל סולפוקסיד מדולל של היענות פלורסנט לא ארעי בתאים המבטאים GCaMP3.
   4. המתן 30 דקות ולאחר מכן, הפעל את זלוף בפתרון קרבס-צלצול טריים למשך עוד 20-30 דקות.
4. להכין את האלקטרודה הקלטה.
   1. להשתמש בכפפות, מניחים על filamented זכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני (OD) של 1 מ מ, קוטר פנימי (ID) של 0.4 מ מ פולר micropipette והדק את החוגה כדי. תהדק את זה למקומו. סגור את הדלת פולר.
   2. שימוש של פולר P-97, לתכנת את ההגדרה הבאה: חום-900, ברגע האחרון 120, מהירות ב-75, הפעם 250, הלחץ 500, וכן אין לולאות נוספים.
      הערה: Resistance (R) נמדד באמצעות פקדי תוכנה של המגבר: התוכנה רכישת נתונים מאשר התנגדות על ידי פתירת הנוסחה V = IR. הבקר תוכנה עובר זרם ידוע (I) (בדרך כלל 1 nA) דרך האלקטרודה, מודד את השינוי במתח (V), ובכך מאפשר לנו למציאת המהירות
   3. עבור דיאפרגמות עובריים, ודא כי ההתנגדות היא ליד 60 MΩ, ובשביל דיאפרגמות בוגרים, 10-20 MΩ. לטעון את האלקטרודה הקלטה עם 3 מ' אשלגן כלורי.
5. בהגדלה X 10, להוריד את האלקטרודה לתוך שריר, באמצעות micromanipulator השנייה מעברו האחר של הבמה כמו אלקטרודה מגרה.
6. באמצעות תוכנה רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיות, המתן עד פוטנציאל ממברנה המנוחה משתנה מ- 0 ל-65 mV או בהמשך.
7. לעורר 1 הרץ ואמת הנוכחות של פוטנציאלי פעולה השריר על-ידי בדיקת פוטנציאל גדול זה מוצגים להחטיא צנוע (פוטנציאל המתנשא מעל 0 mV כשזה מתחיל ב-65 mV או בהמשך). אל תבלבל החפץ גירוי עם פוטנציאל הפעולה.
   הערה: פוטנציאל הם באופן משמעותי יותר משך (~ 5 ms) מאשר גירוי חפצים.

3. הדמיה של זריחה המדגם

1. בהגדלה X 20, לאתר הלהקה endplate במרכז של השריר על-ידי חיפוש 594-αBTX – שכותרתו ' NMJs תחת עירור אור ירוק/צהוב (550 ננומטר). לעבור עירור אור כחול (470 ננומטר) התמונה Ca^{2 +} תגובות שריר, נוירון מוטורי או תאי שוואן.
2. אם רצונך בכך, להגדיר המפצל תמונה עם מסננים bandpass ומסנן קצה חד ודיקרואיק זוהר עבור ההדמיה כפולה באורך הגל.
3. על מנת לחשב פלורסצנטיות מקסימלי (Fmax) הוצגו על ידי רקמת GCaMP3/6-הבעת ', להוסיף µL 12 3 מ' אשלגן כלורי (אשלגן) ההכנות של הסרעפת⁶.
   1. לבצע ניסויים עם הבר בהירות על הבר טבלת בדיקת מידע מוגדר כ- 110% של רמת שבו הרקמה GCaMP3/6-הבעת ' מוצגים רוויה בהגדלה X 20, מבלי binning בתגובה אשלגן כלורי.
4. שיא 20 מסגרות לשנייה לא תפספס שאירועים מהר.
5. לעורר עם s 1-45 של 20-40 הרץ של גירוי עצבי על-ידי אספקת רכבת של דחפים באמצעות האלקטרודה יניקה או להוסיף אגוניסטים תרופתי על ידי יישום אמבט או זלוף ולאסוף דינמי פלורסנט Ca^{2 +} תגובות בסוג של תא אחד יחד עם האות NMJ 594 סטטי-αBTX.
   הערה: אם רקמות ספציפיות אדום או מרחיקת אדום GECI או GEVI עכברים הופכים לזמינים לשימוש ב- NMJ, הם יכולים לשמש כדי לאסוף שני אותות דינמי המשקף את שני הרכיבים הסלולר ב- NMJ.
6. כאשר הניסויים הדמיה או אלקטרופיזיולוגיות גמורים כי היה להשיג את התוצאות הרצויות, perfuse המים דרך הקווים זלוף ולמצוץ מים 2 x - x 3 דרך האלקטרודה שאיבה על מנת להבטיח כי מלחי לא לבנות.

4. ייצוא וניתוח של הנתונים באינטנסיביות סטיית תקן מפה של קרינה פלואורסצנטית (SD_iu16)

1. רצפי תמונות הרשומה רשמה 16 סיביות TIFF ערימות ולטעון אותן למערכת הרצויה הדמיה נתונים ניתוח לניתוח.
2. בתפריט קובץ 8 קבוצו של התוכנה, בחר תמונה הערימה עניין ולחץ כדי לטעון.
   1. ברגע הוידאו נטען, יסרוק הזמן כדי לזהות סעיף זה אין פעילות פלורסנט הסלולר.
      הערה: אזור זה ישמש כדי ליצור מדגם רקע.
   2. החזק את מקש Shift ולחץ כדי לצייר אזור התיבה שנוספה (ROI) באזור מזוהה אזור הדגימה רקע.
   3. לאחר יצירת תיבת, לחצו על הרווח כדי ליצור חלקת רקע פעילות שינוי.
   4. המעקב באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר באפשרות מגוון להציג את האפשרות לזרוק רועי כטקסט כדי להפוך את האיתור כקובץ טקסט קואורדינטות xy.
3. חוזרת הוידאו של הריבית, לסרוק שוב כדי לזהות את אזור הזמן שבו מתרחשת הפעילות של ריבית.
   1. באמצעות הכפתור האמצעי של העכבר, בחר באזור הזמן בתיבה זמן צהוב.
   2. לחץ לחיצה ימנית על הסרטון ובחר מחסנית OPS ולאחר מכן אפשרות למפות Stat 5.
      הערה: פעולה זו תיצור מפת סטיית תקן (SD מפה) בחלון השמאלי.
   3. לחץ על המפה SD ולאחר מכן הקש ] מפתח x 19 כדי להחיל את המפה חום הצבע המתאים.
   4. המפה SD באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר STM טען ושמור, אשר יציג את האפשרות לשמור את ה-stm כמו tiff לשמור את המפה SD.
   5. אז, הקש [ מפתח x 19 לשוב אל מפת צבע בגווני אפור.
   6. הקש C ולאחר מכן D כדי להעלות את צפיפות כלי מיפוי. באמצעות לחצן העכבר השמאלי ואת לחצן העכבר במרכז, להתאים את סף כדי לכלול כל פעילות פלורסנט שמוצג במפת ה-SD.
   7. הקש C כדי לסגור את הכלים צפיפות תוך שמירה על הגדרות הסף.
   8. המפה SD באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר חלקיקי ה-STM , ולאחר מכן למצוא את PTCLS.
      הערה: זה יהיה לזהות תאים בודדים לבטא פעילות פלורסנט.
   9. לחץ לחיצה ימנית על המפה SD פעם נוספת ובחר ליצור חלקיקים ROIs.
      הערה: זה להרכיב את התאים שנבחרו על הוידאו המקורי של עניין.
   10. תוך החזקת מקש shift לחוץ, לחץ לחיצה ימנית על כל אחד של החלקיק מזוהה עכשיו ROIs בסרטון המקורי.
   11. בחר סמן רועי ו- Int מידה ב- ROI.
       הערה: פעולה זו תיצור חלקות פעילויות פלורסנט נפרדים עבור כל רועי מזוהה בסרטון של ריבית. אלה יכולים להיות נשמר על-ידי לחיצה ימנית על כל אחד מאלו, בחירת Assorted, ואחריו לזרוק רועי כטקסט.
4. לקבלת נתונים היסטוריים ההיגיון שבבסיס פעולות אלה, נא עיין קובץ קוד מקור⁹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מספר דוגמאות של שינויים בעוצמה פלורסצנטיות, מתווכת על-ידי עליות של תאיים Ca^{2 +} בתוך התא מוגדרים סוגי NMJ, להראות את התועלת של גישה זו. תוצאות אלו מוצגים כמו זריחה המרחבי בעוצמה מפות, אשר מספקים את מיקומו של תאים מגיבה, כמו גם את עוצמת התגובות שלהם, ובכך מאפשר על ההערכה של ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן אנו מספקים דוגמאות של מדידת Ca^{2 +} תגובות תאים מסוימים ברקמת עצב-שריר שלם, שימוש בעכברים לבטא GECI. על מנת לבצע בהצלחה ניסויים אלה, זה הכרחי כדי לא לפצוע את עצב הסרעפת בזמן. לשיקוף Ca^{2 +} תגובות בתאי שוואן בעוצמה נמוך או גבוה (כלומר, 20 X או 60 X), יש צורך להשתמש BHC או ממוצע-conotoxin חסום ל?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data