JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב- Escherichia coli בהבעת משותפת של RNA chimeric המכיל את הרנ א ביקוש לפיגום וירואיד ומפעל ליגאז tRNA. המוצר העיקרי הוא מולקולה מעגלית המקל על טיהור עד הומוגניות.

Abstract

עם הגדלת ההתעניינות RNA ביולוגיה והשימוש של מולקולות RNA ביישומים הביו-טכנולוגיה מתוחכמת, השיטות להפקת כמויות גדולות של RNAs רקומביננטי מוגבלים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב- Escherichia coli בהתבסס על ביטוי משותף של מולקולה chimeric המכיל את הרנ א ביקוש לפיגום וירואיד ומפעל ליגאז tRNA. Viroids הם RNAs עגול קטן יחסית, ללא קידוד, מאוד בסיס לזווג שאינן זיהומיות צמחים גבוהים יותר. המארח לשתול tRNA ליגאז הוא אנזים גויס על ידי viroids שייך למשפחת Avsunviroidae, כגון וירואיד החבויים חצילים (ELVd), לתווך RNA circularization במהלך וירואיד שכפול. למרות ELVd לא לשכפל ב e. coliקודמן ELVd ביעילות עיבד על ידי e. coli RNA פולימראז, עיבדה את ribozymes האמרהאד מוטבעים תאים חיידקיים, שנוצר מונומרים הם circularized על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף להגיע ריכוז יוצא דופן. החדרת RNA עניין לתוך לגרדום ELVd מאפשר הייצור של עשרות מיליגרם רקומביננטי RNA לליטר של התרבות חיידקי בתנאי מעבדה רגיל. שבר העיקרי של המוצר RNA היא מעגלית, תכונה המאפשרת הטיהור של הרנ א רקומביננטי כדי הומוגניות וירטואלי. ב פרוטוקול זה, תואמת DNA (cDNA) משלימים ל RNA עניין נוסף במצב מסוים של cDNA ELVd ב פלסמיד ביטוי המשמש, לאורך פלסמיד לבטא משותפת ליגאז tRNA חציל, להפוך את החיידק. ביטוי משותף של שתי מולקולות תחת השליטה של היזמים מכוננת חזק מוביל לייצור כמויות גדולות של הרנ א רקומביננטי. הרנ א רקומביננטי יכול להיות שחולצו מן התאים חיידקי, הופרדו עיקר RNAs חיידקים ניצול של מעגליות שלה.

Introduction

בניגוד DNA, חלבונים, פרוטוקולים לייצור קל, יעיל וחסכוני של כמויות גדולות של RNA אינם בשפע. עם זאת, המחקר והתעשייה דרישה להגדיל כמויות של מולקולות אלה כדי לחקור תכונות ביולוגיות ייחודיות שלהם1, או להיות מועסק ב מתוחכמים ביוטכנולוגי יישומים, כולל שימוש ספציפי מאוד aptamers 2, סוכני טיפולית3או הדברה סלקטיבי4. תמלול במבחנה, סינתזה משמשים במחקר לייצר RNA. עם זאת, שיטות אלה כרוכה מגבלות חשובות כאשר כמויות גדולות של המוצרים נדרשים. החלופה ההגיונית היא להשתמש את מכונות שעתוק אנדוגני של תאים חיים, ואחריו תהליך טיהור להפריד את RNAs עניין חבריו הסלולר. בעקבות אסטרטגיה זו, פותחו שיטות כדי לייצר RNAs רקומביננטי בתאי חיידקים, כגון המעבדה-הידידותית Escherichia coli5 או את ימית סגול phototrophic האלפא-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. לרוב השיטות לייצור RNA רקומביננטי בחיידקים להסתמך על הביטוי של לפיגום RNA יליד יציב מאוד, כגון להוסיף tRNA או של rRNA, בהן הרנ א עניין הוא7. זה מטיל את ההכרח משחרר את הרנ א עניין מחוץ מולקולת chimeric, אם הנוכחות של RNA נוספת היא בעיה עבור יישומי הזרם8. המושג ב רקומביננטי ביוטכנולוגיה RNA הוא הייצור של מכלולים ribonucleoprotein רקומביננטי ייתכן המוצר הרצוי כשלעצמו או השתמשו כאסטרטגיה מגן כדי להגביר את היציבות RNA של ריבית9, 10. באופן דומה, הייצור של RNAs מעגלית גם הוצע כאסטרטגיה לייצר מוצרים יציב יותר11.

לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה להפקת כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב e. coli המשתתפת בשלוש מתוך המושגים לעיל: החדרת את הרנ א ביקוש לפיגום RNA מעגלי יציב מאוד וביטוי שיתוף רקומביננטי RNA עם חלבונים אינטראקציה לייצר סביר של ribonucleoprotein יציב מורכבים שמצטבר בכמויות מדהים בבקטריאלי תאים12. בניגוד התפתחויות הקודם, השתמשנו זר לחלוטין כדי e. coli, כלומר וירואיד של RNA לגרדום. Viroids הם סוג מאוד מסוים של מדבקים של צמחים גבוהים יותר באופן בלעדי היוו מאת קטן יחסית (246-401 nt) מאוד בסיס לזווג מעגלית רנ א13. מעניין, viroids הם ללא קידוד RNAs, בלי עזרה של חלבונים משלהם, הם מסוגלים להשלים את מורכבות מחזורים זיהומיות ב לנשאים נגועים14. מחזורים אלה כוללות שכפול רנ א-ל-RNA גרעינים או מהכלורופלסט, בהתאם משפחת וירואיד —Pospiviroidae או Avsunviroidae, בהתאמה – תנועה דרך צמחים נגועים התחמקות של התגובה ההגנתית המארח. Viroids חייב להיות מדורגת בין RNAs היציב ביותר בטבע, כתוצאה להיות ה-RNA מעגלי עירומים ויש להם לשרוד בסביבה עוינת של תאי צמחים נגועים. מאפיין זה עלול להפוך viroids מתאים במיוחד כמו פיגומים לייצב רקומביננטי RNA בגישות הביו-טכנולוגיה. בנוסף, השיטה החדשה מבוססת על שיתוף לביטוי לגרדום וירואיד עם חלבון אינטראקציה הצמח. Viroids שכפל באמצעות מנגנון מתגלגל-מעגל בפונדקאי אשר מגויסים אנזימים כדי לעודד את השלבים השונים של התהליך. בייחוד את viroids קצת, ליתר דיוק אלה השייכים המשפחה Avsunviroidae15, מכילים ribozymes המעורבים גם שכפול. תלוי בזן וירואיד, שעתוק של וירואיד RNAs מתווך על-ידי המחשב המארח RNA פולימראז II או את chloroplastic הגרעיני מקודד ה-RNA פולימראז (NEP). וירואיד RNA עיבוד נראה להיות מזורז על-ידי מחשב מארח RNase סוג-III, למרות ב viroids עם ribozymes oligomeric RNA intermediates עצמית קליב במהלך שכפול. בסופו של דבר, שנוצר מונומרים וירואיד הם circularized, בהתאם משפחת וירואיד, את מארח ה-DNA ליגאז 1 או איזופורם chloroplastic tRNA ליגאז16,17. אנזים זה האחרון מעורב מצדו של צורות monomeric של viroids משפחת Avsunviroidae, כגון וירואיד החבויים חצילים (ELVd)18.

במהלך עבודה כדי לנתח את הדרישות רצף מבניים של ELVd הקובעים הכרה על ידי החציל (סולנום melongena ל') ליגאז tRNA, הקמנו מערכת ניסיוני המבוסס על ביטוי משותף של שתי מולקולות ב e. coli 19. הבחנו כי עוד יותר-יחידות ELVd תעתיקים עצמית קליב ביעילות בתאים e. coli עד ribozymes האמרהאד מוטבע וכי וירואיד שנוצר מונומרים עם 5'-הידרוקסיל, 2', טרמיני 3'-phosphodiester circularized ביעילות על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף חציל. אפילו יותר, RNA מעגלי וירואיד וכתוצאה מכך להגיע של ריכוז גבוה לא צפוי ב e. coli, מעבר. rRNAs אנדוגני12. היעדר שכפול intermediates הצביעו על חוסר ELVd רנ א-ל-RNA הגברה תאים חיידקיים אלה. מעניין, החדרת heterologous RNAs במצב מסוים של המולקולה וירואיד הייתה השפעה מתונה על הצטברות של מעגלי נגזר וירואיד RNAs12. תצפיות אלה גרמו לנו לדמיין שיטה לייצר כמויות גדולות של רקומביננטי RNAs בחיידקים. בשיטה זו, cDNAs התואמים RNAs עניין הנוספים של cDNA ELVd, הרנ א chimeric וכתוצאה מכך זה מתבטא ב e. coli דרך מקדם מכוננת חזקה. עבור מערכת לעבודה, e. coli ולשוד במשותף עם פלסמיד לבטא את ליגאז tRNA חציל. בתמליל עוד יותר-יחידות הנגזרות ELVd יעובד על-ידי ribozymes האמרהאד מוטבע, שנוצר מונומרים עם טרמיני המתאים מזוהה, circularized על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף. בדרך זו, הרנ א עניין מוכנס לתוך לפיגום מעגלית יציב מאוד המורכב של המולקולה המעגלית וירואיד. רנ א רקומביננטי זה chimeric היא ככל הנראה עוד התייצב בתוך התאים e. coli על ידי היווצרות ribonucleoprotein מורכבים תוך אינטראקציה עם ליגאז tRNA. בשיטה זו (ראה פרוטוקול להלן), RNA aptamers, סיכת ראש RNAs RNAs מובנים אחרים יש כבר בקלות מיוצר בכמויות של עשרות מיליגרם לליטר של e. coli תרבות בתנאי מעבדה רגיל וטיהרו את ההומוגניות לוקח היתרון של מעגליות12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. פלסמיד בנייה

  1. להגביר את ה-PCR (או על ידי שעתוק במהופך PCR אם החל תבנית הרנ א) cDNA התואם הרנ א עניין באמצעות תחל עם סיומת 5' כדי לאפשר הרכבה לתוך פלסמיד הביטוי. כדי למנוע מוטציות בלתי רצויה, להשתמש אמינות גבוהה DNA פולימראז.
    1. כדי להוסיף את cDNA פלסמיד ביטוי גיבסון הרכבה20, להוסיף סיומות 5' הבאות תחל ה-PCR: קדימה, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; הפוך, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X מייצג נוקלאוטידים הומולוגי לקצה מסוף הרנ א עניין.
    2. תקופת דגירה של 30 s ב 98 ° C, ואחריו מחזורים של 10 s ב 98 ° C, 30 s-55 ° C ו- 30 s 72 ° C, ואת סיומת הסופי של 10 דקות-72 מעלות צלזיוס.
  2. תקציר 100 ננוגרם של פלסמיד pLELVd-BZB עם 10 U של האנזים הגבלת סוג-IIS Bpi אני עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ב תגובה 20 µL 0.5 מ ל צינור במאגר G (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 10 מ מ MgCl2, 50 מ מ NaCl 0.1 מ"ג/מ"ל BSA).
    הערה: פלסמידים כל זמינים על פי בקשה למחבר המתאים. אקדמיית קנוסה אני שווה ל- Bbs אני.
  3. הפרד את המוצרים PCR לעיכול על ידי אלקטרופורזה ב 1% ג'ל agarose טה מאגר (40 מ מ טריס, חומצה אצטית, EDTA 1 מ מ, 20 מ מ pH 7.2). מכתים את ג'ל למשך 15 דקות ע י ניעור ב- 200-מ ל 0.5 µg/mL אתידיום ברומיד. לדמיין את הדנ א באמצעות transilluminator UV וחותכים הלהקות התואם את cDNA מוגבר, את אקדמיית קנוסה -עיכלתי פלסמיד (2046 bp) באמצעות סכין ומהדקים.
    הערה: אקדמיית קנוסה אני העיכול של pLELVd-BZB משחרר גם מוצר bp 528 המתאים הכתב LacZ כחול-לבן.
  4. Elute את DNAs מן השברים ג'ל תוך שימוש בעמודות סיליקה ג'ל (ג'ל ה-DNA שחזור ערכת שולחן שלחומרים) ולכמת את ריכוז הדנ א על ידי ניתוח spectrophotometric.
  5. להגדיר את תגובת הרכבה גיבסון באמצעות את cDNA מוגבר של פלסמיד מעוכל. השתמש של עודף טוחנת 3-fold של הוספה לעומת וקטור20. תקופת דגירה של h 1 ב 50 מעלות צלזיוס, לטהר את המוצרים תגובת משתמש בעמודה סיליקה ג'ל (DNA נקי & רכז ערכת את השולחן של חומרים).
  6. להשתמש במוצרים מטוהרים של התגובה הרכבה גיבסון electroporate המוסמכת e. coli DH5α תאים. בעזרת וואקום אלקטרופורציה 1 מ מ, להחיל את ההגדרות הבאות: 1,500 V ו- 5 גב' Incubate עבור h 1-37 מעלות צלזיוס ב מרק סופר ממוטבת עם דיכוי catabolite (SOC; טריפטון 20 g/L, תמצית שמרים 5 g/L, 0.5 g/L NaCl, 2.5 מ מ. אשלגן כלורי, 10 מ מ MgCl2 גלוקוז 20 מ מ, pH 7.0) בינוני נוזלי, התפשטה ואז על גבי לוריה-Bertani (ליברות; טריפטון 10 גרם/ליטר, תמצית שמרים 5 g/L, 10 גרם/ליטר NaCl) המכיל אמפיצילין µg/mL 50 פלטות אגר (1.5%).
    1. על המסך עבור מושבות המתאים טרנספורמציה e. coli שיבוטים המביאות סביר להניח את תותב, 15 דקות לפני ציפוי תאי electroporated, להפיץ µL 30 של 50 מ"ג/מ"ל 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-גל) ב dimethylformamide. דגירה צלחות בן לילה ב 37 º C.
  7. לבחור מספר מושבות לבן ולגדול בן לילה ב 37 ° C בתקשורת LB נוזלי. לטהר פלסמידים באמצעות miniprep של קיט (ראה טבלה של חומרים) וניתוח הגדלים שלהם על ידי אלקטרופורזה ב 1% ג'ל agarose טה מאגר.
  8. בחר את פלסמיד רקומביננטי סביר המבוסס על הגירה electrophoretic בהשוואה הפקד pLELVd-BZB. לאשר את רצף פלסמיד שנבחרו על ידי רצף באמצעות תחל 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' ו 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' זה לאגף את הקלטת כל ביטוי ב- pLELVd-BZB.
    הערה: זכור כי זה פלסמיד מכיל polylinker bp 528 עם הסמן LacZ זה מוחלף על-ידי cDNA עניין. הגבלת מיפוי עשוי לעזור כדי לבחור את פלסמידים נכון רקומביננטי.

2. RNA ביטוי

  1. Co-electroporate (ראה תנאי ב- 1.6) הנבחר e. coli זן (e. coli BL21 או נגזרת BL21) עם pLELVd-BZB-הנגזרת המכיל את cDNA התואם ה p15LtRnlSm פלסמיד ועניין לבטא במשותף חציל ליגאז tRNA. השתמש את e. coli HT115(DE3), אשר חסרה RNase השלישי21, לבטא RNAs עם אזורי זמן כפול גדילי.
    הערה: הן את הרנ א של עניין ליגאז את סינתזת mRNA משוקלטים על ידי e. coli RNA פולימראז. אין lysogen DE3 כדי להביע T7 RNA פולימראז נדרש המתח e. coli , למרות נוכחותם של lysogen הזה יש אין השפעות מזיקות.
  2. לאחר דגירה 1 h ב 37 מעלות צלזיוס במדיום נוזלי SOC, צלחת electroporated חיידקים במדיום מוצק LB המכיל אמפיצילין µg/mL 50 ו- 34 כלורמפניקול µg/mL. דגירה בין לילה ב 37 º C.
  3. לאסוף מושבה ואת לחסן 1 ליטר התפישה Erlenmeyer הבקבוק עם 250 מ של נוזלי מרק נהדר (TB) בינונית (טריפטון 12 g/L, 24 g/L שמרים תמצית, 0.4% גליצרול, 0.17 מ' ח'2PO4ו- 0.72 M K-2-HPO-4), המכיל אמפיצילין µg/mL 50 34 כלורמפניקול µg/mL. דגירה ב 37 ° C עם טלטול נמרץ ב 180 סיבובים לדקה (סל ד). הקציר חיידקים בין 12 ל- 16 שעות לאחר חיסון תרבות.

3. RNA מיצוי וטיהור

  1. למטרות אנליטית, לקחת 2 מ"ל aliquots של התרבות בנקודות הזמן הרצויים צנטריפוגה ב x 14,000 g עבור 2 דק. להשליך תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 50 טה מאגר (10 מ מ EDTA טריס-HCl, pH 8.0 ו- 1 מ מ) על ידי vortexing.
    1. הוסף אמצעי אחסון אחד (50 µL) של שילוב 1:1 (v/v) של פנול (רווי מים ו- equilibrated ב- pH 8.0 עם טריס-HCl, pH 8.0), כלורופורם. לשבור את התאים על ידי vortexing נמרצת ולהפריד את שלבי מימית ואורגניים על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 14,000 x g.
    2. בזהירות לשחזר את שלבי מימית (העליון) המכילה סה כ RNA חיידקי.
      הערה: ניתן לאחסן ההכנות ב-20 ° C לצורך ניתוח מאוחר יותר.
  2. למטרות מפוח, יוצקים תרבות לתוך הבקבוק צנטריפוגה 250 מ ל ספין למטה תאים ב 14,000 x g עבור 10 דקות להשליך תגובת שיקוע. לשטוף את התאים על ידי resuspending ב 30 מ ל מים. להעביר את שפופרת צנטרפוגה, ספין למטה התאים שוב תחת באותם התנאים.
  3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend התאים 10 מ"ל של מאגר כרומטוגרפיה (50 מ מ טריס-HCl, pH 6.5, 150 מ מ NaCl, 0.2 מ מ EDTA) על ידי vortexing.
    הערה: בשלב זה, תאים שיכול להיות קפוא ב-20 ° C כדי להמשיך בטהרה בכל רגע אחר.
  4. באמצעות הכנה חיידקי טריים או המופשרים, לשבור את התאים על ידי הוספת נפח 1 (10 מ ל) של פנול: כלורופורם (ראה שלב 3.2) ו vortexing נמרצות.
  5. צנטריפוגה 10 דקות ב 12,000 x g, לשחזר את פאזה מימית, לחלץ מחדש עם נפח 1 (10 מ ל) של כלורופורם תחת באותם התנאים.
    הערה: הכנת RNA ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס בנקודה זו.
  6. בהמשך לטהר RNA חיידקי הכולל על-ידי החלפת אניון כרומטוגרפיה. לסנן ההכנה RNA דרך מסנן מזרק מיקרומטר 45 עומס על עמודה 1 מ"ל diethylethanolamine (DEAE).
    1. כרומטוגרפיה-טיהור, לשימוש מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בספיקה של 1 מ"ל לדקה. לפני לדוגמה טוען, equilibrate את העמודה עם 10 מ"ל של מאגר כרומטוגרפיה (ראה שלב 3.3 עבור הרכב).
    2. לטעון את הדגימה ולשטוף את העמודה עם 10 מ"ל כרומטוגרפיה המאגר. Elute RNA עם 20 מ של מאגר • תנאי (50 מ"מ טריס-HCl, pH 6.5, 1 M NaCl, 0.2 מ מ EDTA) ולאסוף aliquots 1 מ"ל.
      הערה: RNA elutes במהירות בחלקים הראשונית. העמודה עשויה להיות שימוש חוזר עבור עוד יותר purifications. בשביל זה, לשטוף את העמודה עם 10 מ"ל מים ולאחסן ב 4 ° C ב- 20% אתנול.
  7. מאז חלק מרכזי רקומביננטי ש-RNA שמצטבר e. coli בטופס מעגלית, מאפיין זה יכול להיות שהרוויח לטיהור הומוגניות12. להפריד RNAs מעגלית עמיתיהם ליניארי על ידי אלקטרופורזה דו-ממדית לזיהוי בג'ל (עמוד 2D) המשלב הלא-denaturing and denaturing (אוריאה מ' 8) התנאים12,22.

4. RNA ניתוח

  1. הכנת ג'ל לזיהוי 5% (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, יחס מסת) ב TBE מאגר (89 מ"מ טריס, 89 מ מ פנמיות, 2 מ מ EDTA) המכילה אוריאה שמונה מ'.
  2. מיקס 20 µL של RNA ההכנות עם נפח 1 (20 µL) של טעינת מאגר (98% formamide, 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, 0.0025% bromophenol כחול, ו 0.0025% קסילן cyanol), תקופת דגירה של 1.5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס בתוך גוש חימום, והכנס מגניב על קרח.
  3. לטעון את הדגימות הג'ל לזיהוי ולרוץ אלקטרופורזה של תנאים מתאימים בהתאם לממדי ג'ל (למשל, לרוץ 140 x 130 x 2 ג'לים מ מ עבור 2.5 h ב- 200 וולט). מכתים את ג'ל למשך 15 דקות 0.5 µg/mL אתידיום ברומיד, לשטוף עם מים, והמחש RNA תחת אור UV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי לייצר רקומביננטי RNA ב e. coli באמצעות מערכת ELVd-derived12, הרנ א עניין הוא הושתל לתוך לגרדום ELVd RNA. רנ א chimeric זו היא ביטוי במשותף לאורך ליגאז tRNA החציל ב- e. coli. לאחר עיבוד, ביקע, circularized, RNA מעגלי chimeric, שממנו הרנ א עניין בולט, סביר להניח צורות מורכבות עם האנזים חצ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כשחיפשתי את רצף ELVd ודרישות מבנה מעורב ההכרה על ידי ליגאז tRNA חציל, שמנו לב את הביטוי שיתוף של שתי מולקולות ב-פונדקאי e. coli הוביל הצטברות גדולה לא צפויה של וירואיד מעגלית טפסים תאים חיידקיים19. הבנו כי הצטברות גדולה של וירואיד RNA ב e. coli ככל הנראה היה התוצאה של שיתוף לבטא מו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי הטכנולוגיה שמתואר פרוטוקול זה כבר פטנט (לנו פטנט מס ' EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים BIO2017-83184-R ו- BIO2017-91865-EXP מ ספרדי Ministerio דה Ciencia, Innovación y Universidades (שותפה במימון קרנות פדר).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phusion High-Fidelity DNA polymeraseThermo ScientificF530S
Bpi IThermo ScientificER1011
AgaroseConda8010D1 low EEO
TrisPanReac AppliChemA1086,1000
Acetic acidPanReac AppliChem131008.1214
EDTASigma-AldrichE5134-500G
Ethidium bromidePanReac AppliChemA1152,00251%
Zymoclean Gel DNA RecoveryZymo ResearchD4001
NanoDropThermoFisher ScientificND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BioLabsE2621S
DNA Clean & ConcentratorZymo ResearchD4003
EporatorEppendorf4309000019
Escherichia coli DH5αInvitrogen18265-017
TryptoneIntron BiotechnologyBa2014
Yeast extractIntron Biotechnology48045
NaClPanReac AppliChem131659.1211
AgarIntron Biotechnology25999
AmpicillinPanReac AppliChemA0839,0010
X-galDuchefaX1402.1000
N,N-DimethylformamidePanReac AppliChem131785.1611
NucloSpin PlasmidMacherey-Nagel22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)Novagen69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)Ref. Timmons et al., 2001
ChloramphenicolDuchefaC 0113.0025
GlycerolPanReac AppliChem122329.121187%
KH2PO4PanReac AppliChem131509.1210
K2HPO4PanReac AppliChem122333.1211
HClPanReac AppliChem131020.1211
PhenolScharlauFE0479100090%
ChloroformPanReac AppliChemA3691,1000
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF columnGE Healthcare Life Sciences17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography systemGE Healthcare Life Sciences11001313
AcrylamydePanReac AppliChemA1089,10002K
N,N’-methylenebisacrylamideSigma-AldrichM7279-100G
UreaPanReac AppliChem146392.1211
Boric acidPanReac AppliChemA2940,1000
FormamidePanReac AppliChemA0937,2500
Bromophenol blueSigma-AldrichB8026-5G
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamineSigma-AldrichA4929-5G

References

  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4(2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268(2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150(2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904(1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141RNARNA aptamerEscherichia coli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved