אינדוקציה והערכה של נישואי קרובים צלבים באמצעות הנמלים, Vollenhovia Emeryi

Summary

ב פרוטוקול זה, שיטות לעריכת נישואין בתוך המשפחה צלבים, להערכת ההצלחה של אלה צלבים, מתוארים על הנמלה Vollenhovia emeryi. פרוטוקולים אלה חשובים עבור ניסויים להבנת בסיס גנטי של סקס נחישות מערכות דבוראים.

Abstract

הרכיבים גנטית ומולקולרית של המפל זוויג נחקרו בהרחבה ב דבורת הדבש, בומבוס, אורגניזם מודל hymenopteran. עם זאת, מעט מאוד ידוע על המנגנונים זוויג נמצאו ב- taxa hymenopteran-דגם אחרים, כגון נמלים. בגלל האופי המורכב של מחזורי החיים שהתפתח במינים hymenopteran, קשה לשמור על התנהלות חוצה ניסיוני בין אורגניזמים אלה במעבדה. כאן, אנו מתארים את השיטות לביצוע הרבעה צלבים, להערכת הצלחת מהצלבים האלה נמלה Vollenhovia emeryi. גרימת נישואי קרובים במעבדה בעזרת נ' emeryi, הוא פשוט יחסית בגלל הביולוגיה ייחודי של המין האנושי. באופן ספציפי, מין זה מייצר androgenetic זכרים, נקבה reproductives שהפגינו פולימורפיזם כנף, אשר מפשט זיהוי הפנוטיפים של צלבים גנטי. בנוסף, להערכת ההצלחה של נישואי קרובים היא פשוטה כמו גברים יכול להיות מיוצר באופן רציף על ידי הניחוש הראשון שלי צלבים, בעוד גברים נורמליים מופיעים רק בעונת הרבייה מוגדרים היטב בשטח. פרוטוקול שלנו מאפשרים שימוש נ' emeryi כמודל לחקור את הבסיס הגנטי והמולקולרי של מערכת קביעת מין במין נמלה.

Introduction

Taxa Eusocial Hymenopteran, כגון נמלים, דבורים, התפתחה מערכת זוויג haplodiploid אנשים אשר שאינם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים על קביעת מין משלימים אחד או יותר לוקוסים (CSD) הופכים נקבות, בעוד אלו שהם הומו - או hemizygous הופכים הזכרים (איור 1א')¹.

רכיבים גנטית ומולקולרית מעורב המפל נחישות סקס נחקרו היטב ב דבורת הדבש, בומבוס,^3,42,אורגניזם מודל hymenopteran. חקירות גנומיקה השוואתי האחרונות מראים כי דבורי הדבש ונמלים לשתף homologs בשם רבים במסלול נחישות סקס, כמו הגן נחישות סקס הראשונית, csd⁵. עם זאת, ראיות של שימור פונקציונלי homologs האלה עדיין חסר נמלים.

כדי לטפל בבעיה זו, נישואי קרובים קווים צריכים להתפתח כפי שהם חיוניים עבור מיפוי גנטי, במחקרים מולקולריים. עם זאת, קשה לשמור על התנהלות חוצה ניסיוני בין אורגניזמים אלה במעבדה בגלל האופי המורכב של מחזורי החיים שהתפתח.

כאן, אנו משתמשים Vollenhovia emeryi כמודל לחקור את הבסיס הגנטי והמולקולרי של מערכת קביעת מין נמלים^6,7. הקווים הרבעה של מין זה פותחו בעבר למיפוי הצמדה של תכונה כמותית אתרים כמותיים עבור תכונות הקשורות קביעת מין בפעם הראשונה בנמלים⁶. בנוסף, המפל זוויג מולקולרית כבר ובדוקים⁷. מין זה התפתח מערכת רבייה יוצא דופן מעסיקה הן gynogenesis והן androgenesis (איור 1B)^8,9. רוב קווינס החדשה של זכרים clonally מופקות מן הגנום אימהי ו אבהית, בהתאמה. בנוסף, העובדים ומלכות מסוימים מיוצרים מינית⁸. מערכת רבייה זו היא התאימו היטב מחקרים גנטיים כי חוצה הרבעה המיוצר באמצעות מינית המיוצר מלכות זכרים שוות מבחינה גנטית backcross קלאסי. מאז מלכות מינית המיוצר נבדלים מורפולוגית מקווינס המופק הגנום אימהי¹⁰ (איור 1B), ביצוע והערכת הרבעה צלבים מתבצע בפשטות רבה יותר בשיטה זו.

במאמר זה, שיטות הקמת מושבות מעבדה לבדיקת המעבר, יישום של הרבעה חוצה שימוש מלא-sib זוגות ולאחר הערכת ההצלחה מהצלבים האלה באמצעות genotyping של חברי המושבה דיסקציה של צאצא זכר איבר המין מתוארים נ' emeryi.

מערכת רבייה מועסקים היישום של הניחוש הראשון שלי צלבים לעתים קרובות הצעד הראשון חיוניים כל חקירה של סקס נחישות מערכות דבוראים. כך למשל ב- Cardiocondyla obscurior, העדר כמעט מוחלט של זכרים דיפלואידי לאחר 10 דורות של מלא-sib ההזדווגות במעבדה מדגים היעדר CSD לוקוס¹¹. זה אפשרי לחזות את מספר CSD לוקוסים מן היחס בין זכרים מיוצר הרבעה צלבים^6,12,13.

Protocol

1. שדה אוסף ותחזוקה של המושבות (פ') Emeryi במעבדה

הערה: קינים של נ' emeryi מצויים נרקב יומני רישום של הנופלים רקובה עץ הדיגיטלי יערות משניים ברחבי יפן. מין זה מציג שני סוגים של מושבות, קרי, מושבות (1) בהפקת רק מלכות לונג-כנף, (2) מושבות בעיקר בהפקת קצר-כנף מלכות בנוסף למספר קטן של מלכות לונג-כנף^8,14. ב פרוטוקול זה, אספנו הסוג האחרון של מושבות ב פריפקטורה אישיקאווה, יפן.

1. לאסוף את המושבות נ' emeryi בחודשי הקיץ המוקדמים.
   הערה: כדי לקבל מספר מספיק של יחידים מינית במהלך עונת הרבייה, מושבות המכיל יותר מ-300 יחידים עדיפים.
2. העברת דגימות נמלה מן הענפים שנאספו לקן טיח מלאכותיים עם כיסוי זכוכית באמצעות של העצמות (איור 2, משמאל).
3. לשמור על מושבות בקן מלאכותי 25 ° c תחת מחזור 16:8 h/כהה. מספקים מי ברז עם בקבוק לשטיפת להרטיב הטיח.
   1. להוסיף כ- 100 מ ג של אבקת קריקט יבשה עטופה בנייר כסף ומכניסים סוכר חום מלא מים תשר (20 µL tip) בכל יום עד reproductives חדש (₁ F המכונף-מלכות וזכרים F₁ ) להגיח.

2. ניסויי מעבדה צלבים

הערה: reproductives חדש להתחיל מגיחים בשלהי הקיץ אל הסתיו (איור 3). מלכות לונג-כנף מיוצרים מינית, קצר-כנף מלכות מיוצרים clonally ויש את הגנום אימהי (איור 1). השתמש ארוך-כנף מלכות וזכרים עבור הניחוש הראשון שלי צלבים.

1. כדי לעצור אנשים מלעבור, מקום מושבות חדר סביבה קבועה ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
2. להסיר את אמצע-רגליו של 30 עובדים באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ולהעביר אותם חדשים קטנים טיח קן (איור 2, נכון) על הניחוש הראשון שלי צלבים.
   הערה: הרגליים יוסרו כדי להבחין בין העובדים הנוכחי של העובדים שיופקו על ידי חוצה הרבעה עוקבות.
3. להוסיף 3-4 זחלים או גלמים לתוך קן גבס המכיל עובדים.
   הערה: עובדים מראים פעילות גישוש במושבה F₀ מלכות-פחות. זחלים או גלמים יכול ביעילות למשוך עובדים אלה, reproductives חדש במרכז המושבה במהלך מבחן המעבר. כתוצאה מכך, לשמור על התנאים של המושבה ניסיוני בקרבת המושבה נורמלי.
4. להעביר מלכה לונג-כנף, זכר אותו לקן טיח מוכן בשלב 2.3 עבור הניחוש הראשון שלי צלבים.
5. לשמור על מושבות 25 ° c תחת מחזור 16:8 h/כהה עם מזון ומים הניתנים כמתואר ב- 1.3 עד המלכה לאבד את כנפיה, להטיל ביצים.
   הערה: זה לוקח שבוע אחד בחודש.
6. בדוק את כל המושבה ניסיוני יום תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. לאחר ביצוע הרבעה חוצה בין הצאצאים₁ F, ביצים יכול להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
7. לאחר F המלכה₁ מתחיל ביציה, להסיר F₁ זכרים, הזחלים או הגלמים הוסיף בשלב 2.3 מן הקן כדי למנוע ערבוב של הדור₁ F (זכרים ונקבות המשמש צלבים נישואי קרובים), הדור₂ F (צאצא המופק צלבים נישואי קרובים).
   הערה: אם ישנם כמה זכרים במושבה, אפשרי לזירוז צלבים הרבעה באמצעות זכר אחד ומלכות 1 עד 3 במושבה ניסיוני אותו.
8. לשמור על מושבות תחת conditionsas זהה המתואר 1.3, עד F₂ הצאצאים מגיחים.
   הערה: העברת F₁ המלכה, F₂ צאצא חדש גדול יותר טיח קן (איור 2, משמאל) לצורך שמירת המושבה לטווח ארוך.

3. הערכה של נישואי קרובים להצלחה

1. מיצוי הדנ א ואת genotyping של הדור הורים (F₀)
   1. הסר רגל אחת של מלכה₀ F באמצעות מלקחיים, להעביר את הרגל microtube 1.5 mL המכיל 100 µL של סוכן קלאציה.
   2. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, לנתח בטן הנשי בצלחת זכוכית מלאים µL 300 של הנדסה גנטית מים באמצעות מלקחיים, לבודד את spermatheca המכיל את הזרע מן הזכרים ובסיומה.
   3. הקילוף הרקמה של spermatheca ולבודד את הזרע של הרקמה של הנקבה באמצעות סיכות חרקים.
      הערה: כדי להקל על שאיבת זרע מ- spermatheca, אחסן דגימות נשים ב- 100% EtOH יותר יום אחד לפני ניתוח.
   4. שימוש של micropipette, העברת הזרע לתוך microtube 1.5 mL המכיל 100 µL של סוכן קלאציה.
   5. דגירה בדגימות של F₀ המלכה, תאי זרע מוכן בשלב 3.1.1 ו- 3.1.3, בהתאמה, ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות פלאש centrifuge את microtube ולאחסן ב 4 º C.
   6. גנוטיפ כל דגימות בשיטה המתוארת במקום אחר⁴.
2. מיצוי הדנ א של זוג נמלים המשמשים הרבעה צלבים (F₁)
   1. לאחר המאשרת ייצור הביצים על ידי sib הזדווגו המלכה₁ F, לחלץ את ה-DNA של המלכה שימוש בכנפיה המחסן או רגל אחת באמצע, גנוטיפ תוך שימוש באותה שיטה המתוארות בסעיף 3.1 לעיל.
   2. תמצית ה-DNA של F₁ זכר באמצעות הרגל ואחד גנוטיפ אותם באמצעות אותו בשיטה המתוארת בסעיף 3.1 לעיל.
      הערה: הדוגמאות שניתן לאחסן ב 100% EtOH לפני הפקת דנ א, ו- DNA בסוכן קלאציה ניתן לאחסן במשך חודשיים ב 4 º C.
3. הערכה של פוריות הגבר אצל זכרים המופק הניחוש הראשון שלי צלבים
   הערה: זכרים דיפלואידי המופק הרבעה צלבים לעיתים קרובות סטרילי.
   1. לנתח את איברי הרבייה הפנימיים בקערת זכוכית עם µL 400 של PBS פתרון באמצעות מלקחיים.
   2. להסיר PBS ולהוסיף 4% paraformaldehyde (PFA) באמצעות של micropipette.
   3. לתקן את הרקמה על ידי המקננת ב- PFA למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (15-25 ° C).
   4. רחץ רקמות 5 פעמים עם µL 400 ל- PBS באמצעות של micropipette.
   5. לדלל את 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) פתרון 1 µg/mL ב- PBS.
   6. הסר PBS ומוסיפים כ- 300 µL של פתרון מכתימים שתדללו את דאפי רקמות.
   7. דגירה 15 דקות בתנאי כהה בטמפרטורת החדר (15-25 ° C).
   8. לשטוף את רקמת 5 פעמים עם µL 400 ל- PBS, העברת רקמות על המרכז של שקופיות זכוכית באמצעות מלקחיים.
   9. הר רקמות על הרכבה בינונית המכיל phalloidin Tetramethylrhodamine TRITC מצומדת.
   10. לבחון דגימות על ידי לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ באמצעות 20 X או עדשות המטרה X 63 סורק.
   11. השתמש 405 ננומטר לייזר עירור גלאי היברידית-410-530 ננומטר לגילוי דאפי.
   12. השתמש לייזר עירור nm 561 גלאי היברידית-565-650 nm לגילוי TRITC.
   13. השתמש מהירות סריקה של 400 Hz (400 קווים/s) ברזולוציה 1024 × 1024 פיקסלים.
   14. לכידת תמונות באמצעות פלטפורמת תוכנה.

תוצאות

התוצאות של ניתוח microsatellite באמצעות F₀ ו- F₁ דורות הראה כי נישואי קרובים צלבים הופקו בהצלחה (איור 4)⁶. כתוצאה מכך של הניחוש הראשון שלי צלבים, ובסיומה מלכות התקבלו בתוך חודש אחד של הקמת המושבות מעבר ניסיוני. רבע (± 27.1 8.91% SD) של כל הצאצאים (F

Discussion

מאמר זה מדגים פרוטוקולים שיכול לשמש זירוז הרבעה צלבים ולהעריך את המופע של נישואי קרובים, הנמלים נ' emeryi. בניסויים, genotyping של אנשים משמש צלבים יש צורך להבטיח כי נישואי קרובים צלבים היו מוצלחים. עם זאת, האפקטיביות של בדיקות אלה מעבר בולטת בבירור זכרים דיפלואידי יכול להיות מיוצר לאורך כל הש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaster powder	N/A	N/A	Any brand can be used
Charcoal, Activated, Powder	Wako	033-02117,037-02115
Slide glass	N/A	N/A	Any brand can be used
Dry Cricket diet	N/A	N/A	Any brand can be used
Brown shuger	N/A	N/A	Any brand can be used
Styrene Square-Shaped Case	AS ONE	Any size	Size varies by number of ants
Incbator			Any brand can be used
Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom	WATSON	131-715CS
Ethanol (99.5)	Wako	054-07225
Stereoscopic microscope	N/A	N/A	Any brand can be used
Forseps	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 sodium form	SIGMA	11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TaKaRa	T9181
Paraformaldehyde	Wako	162-16065
-Cellstain- DAPI solution	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems		Directly contact the constructor formore informations.
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica HyDTM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Directly contact the constructor formore informations.