JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים מודל פיזיולוגיים ועוצמתי כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפרשת הורמון תחושת הבטן, הספיגה במעיים – המעי הדק מבודד עכברוש perfused.

Abstract

הבטן הוא האיבר הגדול ביותר האנדוקרינית של הגוף, לייצר יותר מ-15 שונים פפטיד ההורמונים המווסתים צריכת התיאבון ומזון, עיכול, ספיגת התזונתי, הפצה, וטיולים גלוקוז מים אחרונים. הבנת המנגנון המולקולרי המסדירים את הפרשת הורמון תחושת הבטן היא היסוד עבור הבנה ותרגום בטן הורמון פיזיולוגיה. באופן מסורתי, המנגנונים הפרשת הורמון בטן גם נלמדים ויוו (של חיות ניסוי או בני אדם) או באמצעות הבטן מפריש הורמון ראשי הרירית תא תרבויות או תא קווים. כאן, אנחנו מציגים של המעי הדק מבודד עכברוש perfused שיטה חלופית ללמוד הפרשת הורמון תחושת הבטן. המעלות של מודל זה זה מסתמך על הבטן ללא פגע, כלומר זה recapitulates רוב הפרמטרים החשובים מבחינה פיזיולוגית אחראי על הפרשת במחקרים ויוו, לרבות קיטוב הרירית, יחסים paracrine, דרכי חשיפה זלוף/גירוי. בנוסף, ולהבדיל מחקרים ויוו, המעי הדק מבודד עכברוש perfused מאפשר שליטה ניסויית כמעט מלאה והערכה ישירה של הפרשה. בניגוד מחקרים במבחנה, זה אפשרי ללמוד את סדר הגודל והן את הדינמיקה של הפרשת וכדי שאלות חשובות כתובות, כגון איזה גירויים לגרום הפרשת הורמונים שונים בבטן, באיזה צד של המעיים (luminal או כלי דם) הוא הפרשת גירוי, ולנתח את פירוט סנסורים המולקולרי שבבסיס התגובה הפרשה. בנוסף, ההכנה הוא מודל חזק לחקר הספיגה במעיים ופרטים לגבי הדינמיקה של הספיגה במעיים כולל אחראי למעליות.

Introduction

הבטן הוא האיבר הגדול ביותר האנדוקרינית של הגוף, לייצר יותר מ-15 שונים פפטיד ההורמונים לווסת את ספיגת התזונתי ואת תכונותיהם מזין, צמיחה מעיים, לווסת התיאבון1. הבטן הורמונים, לכן, מעורבים תהליכים פיזיולוגיים בסיסיים רבים, והוא להבנת הדפוסים הללו של הפרשת ופרטי מולקולרית הקובעות את הפרשת ההורמונים המתאימים לכן חשוב עבור טירונות פיזיולוגיים הבנה, למיעון היבטים translational מפעולות הורמון תחושת הבטן; אבל איך אחד יכול ללמוד את חישה. המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפרשת הורמון תחושת בטן? באופן כללי, הפרשת הורמון יכול להילמד אורגניזמים שלמים (בני אדם או חיות ניסוי), ההכנות בטן מבודד או מתרבויות התא הראשי בטן מפריש הורמון או מונצחים תא תרבויות2,3, 4 , 5 , 6. שלנו המודל המועדף הוא המעי הדק מבודד עכברוש perfused, אשר הוא מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית המאפשר הפרשת הורמונים בטן שילמדו בפירוט עם הזמן האופטימלי רזולוציה (הפרשת המחירים יכול להיקבע עם עת הבסיס עד השנייה), והתוצאות הן הסבירות להעברה המצב ויוו7. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט על איך לבצע הליך זה, אך תחילה נדון בשיטות אחרות ללמוד הפרשת הורמון תחושת הבטן, כולל על יתרונותיה וחסרונותיה של מודלים אלה בהשוואה המעי הדק מבודד עכברוש perfused.

אם אדם רוצה להקים אם מתחם מסוים המווסת את הפרשת הורמונים מסוימים במעיים, מחקרים בבני אדם הם המטרה הסופית. לפיכך, אם תרכובת מציג נהדר אפקטים על הפרשת הורמונים בטן אחד או כמה מכרסמים (in vivo או perfusions) או מ הורמון הפרשת תאי (שורות תאים או תאים ראשי), אפקט זה רלוונטית רק לרפואה ופיזיולוגיה האנושית אם זה יכול להיות אישרו אצל בני אדם. עם זאת, ישנם גבולות ברורים עבור הסוג של מחקרים שניתן לבצע אצל בני אדם ולאחר מחקרים ויוו על חיות ניסוי לעיתים, לכן, האפשרות השנייה הכי טובה עבור מחקרים כאלה. עכברים וחולדות הם החיות ניסיוני שנמצאות בשימוש תכוף ביותר ככל הנראה בשל גודלם נוח, בעלות נמוכה ואת האפשרות גנטית לשנות את הגנים בחשד למעורבות של שאלות מחקר ספציפי (למשל, לדפוק נהג מסוים או קולטן). באופן כללי, מודלים ויוו ליהנות מלהיות שלם מבחינה פיזיולוגית, אך יש גם מספר מגבלות. והכי חשוב, גודל קטן של מכרסמים, עכברים במיוחד, הוא גורם מגביל, כמו רוב מבחני על הבטן הורמון כימות דורשים לפחות 20 µL פלזמה (ועוד לעיתים קרובות הרבה יותר), כלומר לפחות 100 µL הדם חייב להיות מופנמים כדי לשכפל כימות. לכן, זה רק ניתן לקבל מעט מאוד המתאים בסיסית דוגמאות ודוגמאות דגימות גירוי פוסט אחד או שניים (נפח הדם הכולל עכבר של 20 גרם הוא ~1.4 מ"ל). כתוצאה מכך, תגובות הפרשה פוטנציאליים (לדוגמה, במהירות או מאוחר המתרחשים התגובות) ולכן עשויים לפספס.

במודל זלוף, להתגבר על בעיה זו, כמו מדגם גדולים מתקבלים כרכים (קצב הזרימה: 7.5 mL/min), ניתן להתאים את המרווחים אוסף לפי הצורך כדי להבטיח כי התגובות מהיר ולא לטווח קצר ולא החמיצה (אנחנו אוספים דגימות כל מין)7 . בעיה נוספת עם vivo מחקרים בחולדות כי רוב ההורמונים בטן הם אפילו יותר מסולק במהירות או מטבוליזם מאשר בני8,9,10, אשר עלול לסבך את הניתוח הביוכימי עוקבות. למשל, הראינו כי GLP-1 עובר מטבוליזם בעכברים בקצב אפילו מהר יותר מאשר אצל בני אדם (כאשר T1/2 הוא 1-2 דקות11) ו, וחשוב, המערבת המחשוף של GLP-1 בעכברים, בנוסף N-מסוף ביקוע על ידי dipeptidyl-peptidase-4 (DPP4) (שהוא האנזים העיקרי של משפילים GLP-1 אצל בני אדם), לקדם ביקוע על ידי אנזים endopeptidase נייטרלית 24.1112. כתוצאה מכך, מבחני המסחרי הנוכחי עבור כימות של GLP-1, אשר גם מבוססים על איזופורם ללא פגע GLP-1 (7-36amide) או את isoform DPP-4 ביקע (9-39amide), במידה רבה אל תזלזל GLP-1 הפרשת בעכברים וגוררים מטעה תוצאות 12. במעי הדק מבודד עכברוש perfused, רוב החומרים של הורמונים מופרשים לסלק או מופחת במידה ניכרת, שכן השפלה בתיווך פלזמה הוא נמנע, חילוץ הכבד/כליות/ריאות/השפלה מנועה (כי perfusate נאסף כשהוא עוזב את הבטן).

כמובן, תובנה חשובה יכול להיווצר על ידי שימוש בבעלי חיים מהונדסים, למשל, נתרן-גלוקוז טרנספורטר-1 נוקאאוט עכברים13, אבל דורש הערכה מפורטת של חיישנים מולקולריים מעורב הפרשת לעיתים קרובות השיקול של מספר אתרי מולקולרית, החל מן מובילי מולקולרית יון ערוצי ומן שונים G-חלבון בשילוב קולטנים חלבונים תאיים. למשל, שסימנו את הפעילות של תשעה אתרים מולקולריים שונים כאשר להתיר את החיישנים המולקולרי האחראי על גלוקוז-המרצת הפרשת GLP-17. חקירת דומה לא יהיה אפשרי ויוו כי כמה של תרכובות בשימוש לא ספציפי או תופעות מזיקות/קטלני. לדוגמה, בעת שימוש הבטן perfused, שזה אפשרי להעריך את התפקיד של מטבוליזם הגלוקוז התוך תאית על ההפרשה של GLP-1 ו- neurotensin על-ידי חסימת היווצרות ATP עם 2-4-dinitrophenol7,14 , כמו גם את התפקיד של ערוצי סידן ממותגת מתח לחומצת מרה מגורה GLP-1, NT ו PYY הפרשת3. אכן, טטרודוטוקסין חוסם הערוץ נתרן רעיל מאוד ניתן להחיל בהצלחה בלימודים זלוף. בסופו של דבר, במודל זלוף זה יכול להיות ישירות מוערך איפה בבטן תרכובת מסוימת מעוררת הפרשת הורמון מסוים, החוקר יכול פשוט לבחור ולהכין את האזור הרצוי כדי perfuse, באותו זמן זה יכול ייחקרו גירוי הפרשת גורם על-ידי הפעלה של חיישנים מולקולריים מהצד luminal או כלי הדם של המעי3,ה-15,16.

מנגנוני הפרשה הפרשת הורמון בטן כבסיס עשויים גם להילמד על ידי שימוש חתיכות רקמה בטן (כולל רקמה אנושית), ראשי מעיים (בדרך כלל של תרבויות עכברים), מונצחים הורמון הפרשת שורות תאים (של העכבר או ממקור אנושי), על ידי הבטן רקמות רכוב בתאי Ussing או על-ידי organoids (הן לרוב של עכברים)2,3,4,5,6,17,18. בהשוואה perfusions מעיים, מחקרים על הבטן האנושית חתיכות, תרביות תאים ראשי שורות תאים טכנית קל יותר לבצע הם דרך זולה יותר ומהירה של יצירת נתונים, אך כמובן המחקר של הבטן חתיכות דורש גישה טריים בטן האדם דגימות. אולם, במודלים אלה קיטוב תאים נורמליים של המעיים הוא מטבעו אבודה, כלומר כי מודלים אלה לא ניתן להשתמש כדי להעריך את ההפעלה הרגילה של חיישנים מולקולריים, תהליכי הקליטה גם לא ניתן לחקור. יתר על כן, מחקרים כאלה בדרך כלל מעסיקים incubations סטטי (עבור עד כמה ש) אשר מאוד שאינם-פיזיולוגיים, יש מה לעשות עם דינמיקה הפרשה נורמלית התאים, כי המוצר מופרשים לא מוסר ולא ובכך עשויים להשפיע משוב הפרשת הורמונים. לעומת זאת, במעי perfused, מולקולות המופרש והוא נספג ביעילות יוסרו על ידי microcirculation הרירית כפי שהם ויוו, המבטיח כי מעברי הצבע transmucosal נשמרים כך הקליטה והפרשת יכול להתרחש בקצב נורמלי. יתר על כן, יש dedifferentiated תרביות תאים של מוצאם תא enteroendocrine מקורי, כלומר כי הם כבר לא נציג של תאים מקורית מבחינת התוכן פפטיד וביטוי של חיישנים מולקולריים, למרות שיהיו עדיין להפריש את ההורמון המדובר. זהו, למשל, במקרה של GLP-1 מפרישים תאי שורות19.

לכן זה, לדעתנו כי התא הראשי תרבויות או תא קו מחקרים מתאימים ביותר לסינון למטרות, לביצוע ניסויים סוגים שלא ניתן שבוצעו ויוו או בבטן perfused מבודדים. למשל, כוח אמיתי של תרביות תאים הראשי, תרביות תאים קו הוא את התוך תאית משני שליחים (למשל Ca2 +, מחנה, NAD(P)H) ניתן לנטר בזמן אמת, וניתן איתות חשמלי של ההורמון מפריש תאים חקר20,21,22. בנוסף, נוקאאוט siRNA יכול להיעשות, אשר הוא שימושי במיוחד אם מעכבי מסוימים אינם זמינים20,21,22,23,24. הבטן רקמת עכברים רכוב בתאי Ussing שימש לאחרונה ללמוד את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפרשת GLP-1 מגורה חומצות מרה, בעוד organoids מעיים (מתוך עכברים) ואת הבטן האנושית חתיכות היו בשימוש גם ללמוד פרטים מולקולרית של הבטן הורמון הפרשת17,25. ואילו היתרונות לשעבר להיות מקוטב2 כל של מודלים אלה כרוכים incubations סטטי. מחקרים על חתיכות הבטן האנושית, לעומת זאת, להפיק תועלת משימוש רקמה אנושית, ולא מכרסמים, אשר חשוב מאז מינים ההבדל בביטוי רקמות של קולטני 7TM והוא מובילי מולקולרית עלול לגרום במשעולים חישה שונים מולקולרי בין מינים. למעשה, רוב הנתונים בשדה זה נוצר על ידי מחקרים על חזירים, עכברים או חולדות, והוא נותר חמקמק אם ממצאים אלה יועברו בני אדם. היא, לעומת זאת, מרגיע חישה המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס גלוקוז-המרצת הפרשת GLP-1 מופיעים דומה בין עכבר, עכבר, אדם, ו transcriptomic, peptidomic יצירת פרופילים של עכבר ו- L-תאים אנושיים חשף חזק גלובלית קווי דמיון בין26,2718,7,שני מינים.

המעי הדק מבודד עכברוש perfused, עם זאת, יש גם כמה מגבלות הנחשבות. והכי חשוב, זה בלתי אפשרי לקבוע אם תגובה הפרשה נתון נובעת הפעלה ישירה על ידי החומר מבחן של תאים מייצרי ההורמונים יישוב או ליתר דיוק נגרמת על ידי מנגנון עקיף. למשל, אשלגן כלורי באופן מיידי מגביר הפרשת GLP-1 המעי perfused7, אבל זה נשאר לא ידוע אם זו תוצאה של דפולריזציה ישירה של L-התא, או נובעת דפולריזציה של נוירונים קרוב L-התאים או השפעות במקביל פרסמה תכשירים/מעכבי paracrine. הנתונים הנובעים מחקרים באמצעות המעי perfused שמטרתם להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפרשה צריכה, לכן, תמיד להכניס ההקשר עם נתונים המתקבלים דגמים אחרים ספציפיים יותר כדי להגדיל את היכולת ליצור סיבתיות. למשל, גלוקוז-המרצת הפרשת GLP-1 GLP-1 שורת התאים מפרישים28,GLUTag29 ומן העכבר הראשי L-תאים תלויים הפעילות של למעליות גלוקוז (SGLT1 ו- GLUT2). חסימת אלה מובילים במעי הדק עכברוש perfused נחלש גם הפרשת20, כלומר, הוא סביר כי גלוקוז-המרצת הפרשת GLP-1 במידה רבה מתווך על ידי פעולות ישירות של גלוקוז על L-התא. הגבלה חשובה נוספת של המעי perfused מבודדים היא חלק של ליפידים הם שקשה ללמוד בשל hydrophobicity שלהם. למרות שניתן לחקור המוצרים הסופיים של עיכול השומנים (חומצות שומן, diacyl glycerols, lysophosphatidylglycerols, וכו '), ולמרות ההכנה ייתכן שניתן יהיה מחדש esterify ליפידים, intra-cellularly, ואולי לארוז אותם לתוך chylomicrons, הובלת chylomicrons התאים ואת ספיגת עוקבות שלהם על ידי lacteals של villi משובשת, שכן אין אפשרות לאבטח את זרימת הלימפה בבטן מבודד. סביר להניח, לכן, ספיגת השומנים נעצרו לאחר המוצרים נספג להתחיל לצבור בתאים. המערכות תא במבחנה מתאימים פחות ללימודי השומנים בשל היעדרם של קיטוב. ברור, מגבלה זו רלוונטי רק עבור שומנים כי הם נספג מועבר דרך lacteals, ואילו אלה נספג דרך כלי הדם במעיים נוטים להיות מטופלים בדרך כלל.

Protocol

כל המחקרים נערכו באישור ניסויים חיה דנית Inspectorate (2013-15-2934-00833), הוועדה האתית המקומית, בהתאם להנחיות של חקיקה דנית בבע ח (1987) וסמכות הלאומית המכונים לבריאות (פרסום מס ' 85-23).

1. חיות ניסוי

  1. לקבל Wistar זכר חולדות (250 גרם) ואת בית 2 לכל כלוב, עם גישה ad libitum תקן האוכל והמים, ולשמור גם עם 12:12 h מחזור אור-כהה. המתקנים שלנו חיות משתמש מים שאינם מטופלים, Alrtromin מכרסם צ'או (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, דנמרק).
    הערה: אפשר חיות לפחות שבוע של הסתגלות.

2. הכנות ממושכות

  1. להפוך את מאגר זלוף: מאגר ביקרבונט קרבס-חיזוק בתוספת 0.1% BSA (שבר V), 5% לתוספי fumarate T-70, 3.5 גלוקוז mmol/L ו- 5 mmol/L פירובט, ולאחר גלוטמט (במידת הצורך); pH 7.4.
  2. להכין כמות מספקת של מאגר זלוף על סינון זה בגודל המתאים של מסנן ולהתאים pH כדי ~7.5 על-ידי חיבור dropwise 5 M HCl.
  3. להוסיף 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (IBMX) (במידת הצורך) ישירות אל המאגר ביום של המחקר ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
    הערה: IBMX הוא מעכב phosphodiesterase מגביר [מחנה]אני , ובכך משחזר את הרגישות ואת ההיענות של הבטן מבחינת הפרשת הורמונים לגירוי הפרשה.
  4. להכין את מבחן solution(s). להכין כלי הדם גירויים-20 x ריכוז גבוה יותר מאשר הריכוז הסופי הרצוי במאגר זלוף מסוננות ולא מותאם pH. להכין את מבחן luminal גירויים בתוך מול תמיסת מלח בריכוז הסופי.
  5. תרכובות לא ברצון מסיס ב- 100% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ו לדלל עוד מאגר זלוף או תמיסת מלח מול. לגירויים בכלי הדם, לשמור על הריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי ב- 1% או להלן, כמו ריכוז לעיל זה נזק המעי עלול להוביל הפרשת הורמון בטן לא ספציפי. למדידת pH ולהתאים את ~7.5 במידת הצורך.

3. מבצע זלוף

הערה: המחשה של מלכודת זלוף מסופק באיור1.

  1. עזים ומתנגד החולדות על ידי שימוש משטר הרדמה שיכולים לתמוך כירורגי והרדמה שיכוך כאבים במשך 30-40 דקות על ידי Hypnorm/Midazolam (משקל הגוף 0.3 ml/100 גרם, לכל ml: Hypnorm: 0.08 מ ג פנטניל, 2.5 מ"ג fluanisone, 0.45 מ ג מתיל Parahydroxybenzoate, 0.05 mg Propyl Parahydroxybenzoate, Midazolam: 1.25 מ ג, מטריקס תרופות, Hellerup, דנמרק)
  2. בדוק בשל העדר רפלקסים (הבוהן צביטה), במקום העכבר על שולחן הניתוחים מחוממת ולבצע חתך של העור כדי לחשוף את המעי.
  3. לחשוף את החלק מסוף של המעי הגס על ידי הזזת המעי הדק הצידה ככל האפשר. תקשור של הספקת להערכת אל המעי הגס, לסלק אותה בהדרגה החל מסוף החלק של המעי הגס, נע לכיוון המעי הדק.
    1. אם רק חלק מסוים של המעי הדק נדרשת עבור זלוף (החצי העליון), בלו מקטעים שאינם הנדרשות לאחר קשירת ויישם להערכת. כדי למזער נזק לרקמות, לחות המעי עם תמיסת מלח מול ולהשתמש מטליות להסיר את רקמת החיבור.
  4. הכנס צינור פלסטיק (אורך: ~ 15 ס מ, קוטר חיצוני: ~0.4 ס מ) לתוך לומן מעיים (בחלק proximal) ואת העניבה בו כראוי באמצעות תפרים. לשטוף היטב עם תמיסת מלח (טמפרטורת החדר) מול לרוקן לומן של chyme.
  5. Perfuse לומן עם תמיסת המלח מול-זרם של 0.25 mL/min, באמצעות מזרק 10 מ"ל מחובר מזרק משאבה.
  6. זוז הצידה את המעי, אז עורק מצע המעי העליון העליון נגיש ולהסיר רקמת חיבור ושמן לחשוף את העורק.
  7. מקום שני תפרים תחת עורק מצע המעי העליון באמצעות מלקחיים הצבע בסדר; אחד התפרים הוא בשביל להרים את העורק כדי לשלוט הדימום ברגע כבר לחתוך את העורק הראשי, והשני הוא לאבטחת הקטטר זה להציב העורק. קח זהירות לא לנקב את העורק.
  8. מקום שני תפרים תחת וריד שער הכבד לאבטחת הקטטר מתכת שהולך להציב הווריד לאוסף למטעי זלוף.
  9. לפני החיתוך החור עורק מצע המעי העליון, ודא כי הצנתר שהולך עד שהוכנס לתוך העורק מתמלא זלוף המאגר כדי למנוע היווצרות תסחיף אוויר.
  10. לחתוך חור קטן בתוך עורק מצע המעי העליון בעזרת זוג מספריים כירורגיים והכנס את הצנתר פלסטיק מיד לאחר.
  11. מיד לאחר הקטטר אובטח, ליזום זלוף של המעיים על ידי הפעלת המשאבה רולר (קצב הזרימה = 7.5 mL/min).
  12. לאשר כי כלי הדם בבטן להפוך חיוור בתוך כמה שניות, וריד שער הכבד הופך חיוור.
  13. מיד לאחר הוקם זלוף נכונה, לקדוח חור וריד שער הכבד, להוסיף את הצנתר מתכת ואבטח אותו עם התפר.
    הערה: הצנתר יכול להיות קשה כדי מקום אבל מרימים את הווריד על ידי משיכת בזהירות מסייע תפר מקורב ביותר.
  14. ברגע קטטרים נמצאים במקום זלוף הפלט הוא משביע רצון, להרוג את החולדה על ידי ניקוב הסרעפת, נזהר שלא לקרוע קטטרים.
  15. לאסוף זלוף פלט עבור 1 דקות, למדוד את עוצמת הקול. התחל זלוף לחץ הרכישה/ההקלטות לחץ לבצע ניסוי בתוכנית ההקלטה לחץ.
  16. לכסות את הבטן עם רקמת בטעימת כדי למנוע את זה ממנו להתייבש במהלך הניסוי.
  17. ודא כי בקצה הדיסטלי של המעי אינה חסומה כך למסקנות luminal יכול לצאת, אחרת המעי יתנפח, בצקת יפתחו, זלוף הלחץ יגדל, פלט זלוף יירד.
  18. יוצאים לקראת כ 30 דקות לפני ביצוע הניסוי.
    הערה: התוצרים הפרשה של הורמונים בטן הם מאוד לא יציב למשך 15 דקות הראשונות של זלוף, ולכן שלב זה equilibration יש צורך לקבל בסיס יציב.

4. ניסוי

  1. לאחר כ 30 דקות של זלוף, להתחיל את הניסוי על ידי איסוף הדגימה הבסיסית הראשונה באמצעות אספן שבר. לאסוף דגימות במרווח הזמן הרצויים (למשל, לכל מין, 6.5-7.5 mL בדרך כלל נאסף) ומניחים אותם על קרח בתוך כמה דקות.
  2. לבחון את מלכודת בועות באופן קבוע, אם רוקנו, למלא אותו באמצעות מאגר זלוף.
    1. לאסוף את המאגר דרך השסתום הזין-כיוונית מיד לפני האיבר של הצנתר הוכנס וריד שער הכבד (אחרי זה perfused דרך איבר המין) כדי לוודא האיבר הפעיל סמויה. לאסוף דגימות-ההתחלה והסוף של ניסוי להערכת הכדאיות לאורך כל הניסוי.
    2. למדוד דגימות במהירות, עם מנתח דם ממוכנת-גז, מכיל/מזרקים מפלסטיק ביותר אינם אטום לחלוטין, וקורים להחליף עם האוויר האטמוספרי.
  3. לאחר 10-15 דקות של אוסף בסיסית, לעורר עם החומר במבחן הראשון. ניהול stimulations התוך עורקי עם מזרק משאבה דרך צימוד-כיוונית (זרימה = 0.350 mL/min).
  4. לבצע luminal stimulations על ידי זריקה בולוס הראשונית (2.5 מ ל/דקה מעל הראשון 5 דקות), כדי להחליף את תמיסת המלח מול שכבר נמצאת לומן, ואחריו הניהול של הפתרון בדיקת קצב זרימה נמוכה יותר (0.5 mL/min).
  5. כדי להבטיח כי לומן במהירות ריקון של חומר המבחן לאחר תקופת גירוי luminal תסתיים, ריקון לומן מעיים בתמיסת מול על-ידי החלת זרימת התעריפים כאמור לעיל.
  6. לאסוף דגימות בסיסית למשך 15-30 דקות לפני החומר המבחן הבא הוא מנוהל. בהתאם לפרוטוקול, 2-3 מבחן גירויים בדרך כלל ניתן לכלול לכל ניסוי. אם פרוטוקול הניסוי כולל הפעלה/עיכוב של אתר מולקולרי מסוים בעת ובעונה אחת עם הממשל של secretagogue נתון, תמיד מראש לגרות עם activator/המדכא 10-15 דקות לפני הנהלת secretagogue כדי ודא כי האתר מולקולרית מעוכבת בתחילת מאוד של secretagogue אינפוזיה.
  7. בסוף הפרוטוקול, לנהל (5-10 דקות) פקד חיובי מתאימים כדי לבדוק את ההיענות של הכנת ולאסוף דגימות בסיסית 10-15 דקות לאחר תום תקופת גירוי.
    הערה: מספר מבחן חומרים יכול לשמש בקרה חיובית, למשל, גירויים הגוברת [מחנה]אני (למשל, ' foskolin ' או ' IBMX '), [Ca2 +]אני (למשל, bombesin או neuromedin C), depolarizing סוכנים (למשל, 30-50 מ מ אשלגן כלורי) או יותר גירויים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית כגון macronutrients: גלוקוז, peptones, חומצות אמינו, וכו '. עם זאת, הבחירה של בקרה חיובית תלויה בתוצאה ניסיוני. גלוקוז הוא למשל secretagogue המסכן כוליציסטוקינין (CCK) ואילו bombesin הוא לא secretagogue חזקים על הפרשת insulinotropic גלוקוז תלויי פפטיד (GIP)30.
  8. בתום הניסוי, לסלק את הבטן perfused, שוקל אותה ולמדוד את אורכו. תכניס אותו paraformaldehyde ואחסן אותו (4 ° C) לניתוח פוטנציאל מאוחר יותר פתולוגיה של תקינות/נזק לרקמות, למשל על ידי H & E מכתים.

5. מדידות הביוכימי

  1. לכמת ריכוזים של פפטידים המופרש למסקנות ורידים על ידי שימוש radioimmunoassays פנימית או זמינים מסחרית (RIA) או אליסה-מבחני. ללימודים זה לחקור את הספיגה במעיים, לכמת את המולקולה של עניין, למשל, גלוקוז או חומצות אמינו, למסקנות ורידים.
    הערה: Perfusate הוא בדרך כלל מאגר הבסיס טובה עבור רוב הניתוחים, כולל מבחני המסתמך על תגובות אנזימטיות (כגון כימות של גלוקוז בשיטת glucoseoxidase).

6. ניתוח נתונים

  1. להציג נתונים בדרכים שונות, למשל כמו גרף זמן-ריכוז המציג את הפלט הפרשה בפועל (זרימה x ריכוז) וכן עמודה עלילה המתארים את הסכום הפרשה פלט בתקופות הבסיס לבין התגובה (בדרך כלל נקודות זמן של 10-15).
  2. מגרש בפועל נמדד ריכוז ההורמונים המתאימים ריכוז היחידות. (pmol/L),
    הערה: עדיף לבטא במקום נתונים כפלט (fmol/דקה), כי עם מודל זה, בניגוד ללימודי אין ויוו, הערכים שהושג הם הפלט הפרשה בפועל (בגלל אוסף קבוע של זלוף בשפכים).
  3. בהתאם למספר קבוצות שינותח סטטיסטית, שימוש דו-זנבית מזווגים t-test (שתי קבוצות) או חד-כיווני אנובה למדידות חוזרות ונשנות (יותר משתי קבוצות) ואחריו מבחן המתאים פוסט-הוק להשוואות מרובות.

תוצאות

יכולת לקבוע גירוי מסוים גורם הפרשת הורמון תחושת הבטן של עניין מסתמך על הפרשת בסיס יציב. יתר על כן, אם אין תגובה הגירוי הוא ציין, בתגובה הפרשה חזקים הפקד חיובית להיות ניכר כדי לא לכלול כי העדר תגובת הגירוי המבחן אינו משקף חוסר ההיענות הכללי. איור 2A ו- 2B

Discussion

המעי הדק מבודד עכברוש perfused הוא כלי מחקר רב עוצמה המאפשר את הדינמיקה ואת המנגנונים המולקולריים שבבסיס בטן הפרשת הורמון שילמדו בפירוט. השלב הקריטי ביותר לייצור מוצלחת של נתונים עם מודל זה הוא הפעולה הכירורגית. טיפול של המעיים באופן בלתי נמנע יגרום נזק אל המעי, לכן ולמורה כדי אבסולוטי מינימל...

Disclosures

המחברים של עבודה זו מצהירים שאין פוטנציאל ניגודי אינטרסים הרלוונטיים למאמר זה.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט מוגבל ל פרופסור Jens Juul הולסט מהמרכז נובו נורדיסק למחקר בסיסי מטבולית (נובו נורדיסק קרן, דנמרק), מענק נפרד מן הקרן נובו נורדיסק עושה מחקרים זלוף מכרסמים (מענק. לא. NNF15OC0016574), מענק הולסט פרופסור מן המועצה האירופית למחקר (גרנט no.695069) ו theEuropean האיחוד הוא תכנית המסגרת השביעית למחקר, TechnologicalDevelopment של פעילויות הדגמה (מענק מס 266408), כמו גם של פוסט דוקטורט להעניק לרון אי Kuhre של הקרן לונדבק (R264-2017-3492). אנו מודים ג'נה אי האנט, קרולין פ דיקון להגהת זהיר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals for perfusion buffer
Bovine serum albumin (BSA)Merck1.12018.0500
Calcium chloride dihydrate (CaCl2 x 2 H2O)Merck102382
Dextran 70Pharmacosmos40014
Fumaric acid disodium salt (C44H2Na2O4)Sigma AldrichF9642
Glucose (C6H12O6)Merck108342
Magnesium sulfate hepatahydrate (MgSO4)Merck105886
Potasium chloride (KCl)Merck104936
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)Merck104873
Pyruvic acid sodium salt (C3H3NaO4)Merck106619
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Merck
Sodium chloride (NaCl)Merck106404
Sodium L-glutamate monohydrate (C5H8NNaO4 x H2O)Merck106445
NameCompanyCatalog NumberComments
Perfusion equitment
Universial perfusion systemHarvard Bioscience, Inc.732316
BASIC UNIT UNIPER UP-100, TYPE 834Harvard Bioscience, Inc.
Roller Pump, with four channelsHarvard Bioscience, Inc.730100
WindkesselHarvard Bioscience, Inc.732068
Thermostatic Circulator,Bath Volume 3L, 230V/50HzHarvard Bioscience, Inc.730125
Operating table, heated on tripod stand, type 873Harvard Bioscience, Inc.733776
Cannula with basked, OD = 2.0 mm, ID = 1.0 mmHarvard Bioscience, Inc.733313

References

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Brighton, C. A., et al. Bile Acids Trigger GLP-1 Release Predominantly by Accessing Basolaterally Located G Protein-Coupled Bile Acid Receptors. Endocrinology. 156, 3961-3970 (2015).
  3. Kuhre, R. E., et al. Bile acids are important direct and indirect regulators of the secretion of appetite- and metabolism-regulating hormones from the gut and pancreas. Molecular Metabolism. , (2018).
  4. Roberge, J. N., Brubacker, P. L. Secretion of Proglucagon-Derived Peptides in Response to Intestinal Luminal Nutrients. Endocrinology. 128, 3169-3174 (1991).
  5. Brubaker, P. L., Schloos, J., Drucker, D. J. Regulation of glucagon-like peptide-1 synthesis and secretion in the GLUTag enteroendocrine cell line. Endocrinology. 139, 4108-4114 (1998).
  6. Jacobsen, S., et al. Changes in Gastrointestinal Hormone Responses, Insulin Sensitivity, and Beta-Cell Function Within 2 Weeks After Gastric Bypass in Non-diabetic Subjects. Obesity Surgery. 22, 1084-1096 (2012).
  7. Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64, 370 (2014).
  8. Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
  9. Ratner, C., et al. Effects of Peripheral Neurotensin on Appetite Regulation and Its Role in Gastric Bypass Surgery. Endocrinology. 157, 3482-3492 (2016).
  10. Wewer Albrechtsen, N. J., et al. Dynamics of glucagon secretion in mice and rats revealed using a validated sandwich ELISA for small sample volumes. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 311, E302-E309 (2016).
  11. Vilsboll, T., Agerso, H., Krarup, T., Holst, J. J. Similar elimination rates of glucagon-like peptide-1 in obese type 2 diabetic patients and healthy subjects. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88, 220-224 (2003).
  12. Windelov, J. A., et al. Why is it so difficult to measure glucagon-like peptide-1 in a mouse?. Diabetologia. 60, 2066-2075 (2017).
  13. Gorboulev, V., et al. Na+-d-glucose Cotransporter SGLT1 is Pivotal for Intestinal Glucose Absorption and Glucose-Dependent Incretin Secretion. Diabetes. 61, 187-196 (2012).
  14. Kuhre, R. E., Bechmann, L. E., Wewer Albrechtsen, N. J., Hartmann, B., Holst, J. J. Glucose stimulates neurotensin secretion from the rat small intestine by mechanisms involving SGLT1 and GLUT2, leading to cell depolarization and calcium influx. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 308, E1123-E1130 (2015).
  15. Kuhre, R. E., Christiansen, C. B., Saltiel, M. Y., Wewer Albrechtsen, N. J., Holst, J. J. On the relationship between glucose absorption and glucose-stimulated secretion of GLP-1, neurotensin, and PYY from different intestinal segments in the rat. Physiological Reports. 5, (2017).
  16. Svendsen, B., et al. An analysis of cosecretion and coexpression of gut hormones from male rat proximal and distal small intestine. Endocrinology. 156, 847-857 (2015).
  17. Goldspink, D. A., et al. Mechanistic insights into the detection of free fatty and bile acids by ileal glucagon-like peptide-1 secreting cells. Molecular Metabolism. 7, 90-101 (2018).
  18. Sun, E. W., et al. Mechanisms Controlling Glucose-Induced Glp-1 Secretion in Human Small Intestine. Diabetes. , (2017).
  19. Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716 and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. Journal of Molecular Endocrinology. 56, 11 (2016).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
  22. Kuhre, R. E., et al. Fructose stimulates GLP-1 but not GIP secretion in mice, rats and humans. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306, G622-G630 (2014).
  23. Reimann, F., Tolhurst, G., Gribble, F. M. G-Protein-Coupled Receptors in Intestinal Chemosensation. Cell Metabolism. 15, 421-431 (2012).
  24. Parker, H. E., et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion. British Journal of Pharmacology. 165, 414-423 (2012).
  25. Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63, 410-420 (2014).
  26. Parker, H., et al. Predominant role of active versus facilitative glucose transport for glucagon-like peptide-1 secretion. Diabetologia. 55, 2445-2455 (2012).
  27. Roberts, G. P., et al. Comparison of Human and Murine Enteroendocrine Cells by Transcriptomic and Peptidomic Profiling. Diabetes. , (2019).
  28. Reimann, F., Gribble, F. M. Glucose-Sensing in Glucagon-Like Peptide-1-Secreting Cells. Diabetes. 51, 2757-2763 (2002).
  29. Drucker, D. J., Jin, T., Asa, S. L., Young, T. A., Brubaker, P. L. Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase-A in a novel mouse enteroendocrine cell line. Molecular Endocrinology. 8, 1646-1655 (1994).
  30. Svendsen, B., et al. GLP1- and GIP-producing cells rarely overlap and differ by bombesin receptor-2 expression and responsiveness. The Journal of Endocrinology. 228, 39-48 (2016).
  31. Bak, M. J., et al. Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies. Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).
  32. Jacobsen, S. H., et al. Effects of gastric bypass surgery on glucose absorption and metabolism during a mixed meal in glucose-tolerant individuals. Diabetologia. 56, 2250-2254 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144perfusedpepide 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved