ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

Summary

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה ידידותית למשתמש המבוססת על פיג'י, יחד עם הוראות ברורות המסבירות כיצד לנתח באופן אמין את התנהגות actomyosin בתאים בודדים ורקמות אפיתל מעוקל. כישורי תיכנות אינם נדרשים לבצע את הלימוד; כל השלבים מתבצעים באופן חצי אינטראקטיבי באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של פיג'י ותוספים משויכים.

Abstract

דרוזופילה ביצים לא בוגרות נקראות תאי ביצה, והמבנה שלהם דומה לאברים פרימיטיביים העוברים שינויים מורפולוגיים מסיבוב לצורת אליפסואיד במהלך הפיתוח. תהליך התפתחותי זה נקרא oogenesis והוא חיוני כדי לייצר ביצים בוגרות תפקודית כדי לאבטח את דור הזבוב הבא. מסיבות אלו שימשו תאי ביצה כמודל אידיאלי ורלבנטי להבנת התפתחות אברי החיות.

כמה מהפרוטוקולים בפרוטוקולים מחוץ למבחנה פותחו, אך קיימים מספר חסרונות לפרוטוקולים אלה. אחד כולל את היישום של כיסויים שונים, כי להפעיל לחץ מלאכותי על תאי ביצה התמונה כדי לשתק אותם ולהגדיל את מטוס רכישת התמונה של המשטח ההיקפי של תאי ביצה מנותח. גישה כזו עלולה להשפיע לרעה על ההתנהגות של מכונות actomyosin דק היוצר את הכוח לסובב תאי ביצה סביב הציר הארוך שלהם.

לפיכך, כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו התרבות דרוזולה תאי ביצה באופן חופשי בתקשורת כדי לנתח בצורה אמינה מכונות actomyosin לאורך ההיקף של תאי ביצה. בחלק הראשון של הפרוטוקול, אנו מספקים מדריך המפרט כיצד לנתח את מכונות actomyosin במישור רכישה מוגבלת בקנה מידה הסלולר המקומי (עד 15 תאים). בחלק השני של הפרוטוקול, אנו מספקים למשתמשים תוסף חדש מבוסס פיג'י המאפשר החילוץ הפשוט של שכבה דקה מוגדרת של משטח הביצה ' היקפי. לאחר מכן, הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לנתח אותות actomyosin בסולם הרקמה (> 50 תאים). לבסוף, אנו מאתרים את המגבלות של גישות אלה הן בסולמות הסלולר והן הרקמה המקומית ודנים בפיתוח עתידי הפוטנציאלי וביישומים אפשריים.

Introduction

פיתוח מתמשך של הדמיה הרומן וטכנולוגיות תוכנה עם יישומים במדעי החיים סיפקה השפעה עצומה על הבנת עקרונות היסוד של החיים. אחד האתגרים העיקריים הוא ההדמיה המהימנה של תהליכים התפתחותיים בשילוב עם הדמיה חיה ברקמות שונות. רקמות הן חלקים של איברים וגופים, וככאלה, הרוב אינו נגיש בקלות להדמיה. לכן, הפרוטוקולים המאפשרים את הניתוח שלהם ובדיקת החוץ הגופית פותחו על מנת להמחיש אירועים ביולוגיים המשקפים בצורה מספקת את המצב הvivo בתוך גוף חי.

במהלך העשורים האחרונים, ההדמיה החיה של מתקני ביצים של דרוזוהילה , מבנים דמוי-שכבתית הדומים לאברים פרימיטיביים, תרמה רבות להבנת העקרונות הבסיסיים של פיתוח איברים פרימיטיביים^{1 ,} מיכל השני ^{, 3}. כיום, יש כמה פרוטוקולים culturing זמין, השימוש שלהם תלוי בזמן הרכישה, סוג התא כדי להיות בתמונה, ואת הנגישות שלהם (למשל, הפנימי germline מול קו הסומאטיק החיצוני)⁴.

תכונה נפוצה בכל הפרוטוקולים הללו culturing הוא הצורך השתק של תאי ביצה מנותח המציגים פעילות הקונקטילה גבוהה במדיה נוזלית. הפעילות הקונאקטעית של תאי ביצה נגרמת בעיקר על ידי גיליון השריר המכסה מחרוזת ארוכה של תאי ביצה מחוברים^5,6,7. לכן, כדי להשיג השתק מתאים של תאי ביצים צעירים, התפתחו גישות שונות, מעורבים כיסוי תאי ביצה עם מכסים^6,8,9 או שמיכות גמיש^{4, 10} או להטביע אותם בנקודת התכה נמוכה-ההיתוך^3,11. גישות אלה הן פופולריות כפי שהם גם מאפשרים הדמיה של מטוס חזותי גדול יותר בשל שיטוח עדין של המשטח ההיקפי של תאי הביצה.

עם זאת, לאחרונה, זה הוכח כי חדרי ביצה צעירים (שלב 1-8) לסובב סביב הציר האחורי שלהם⁶ וכי תנועה זו רקמה מופעל על ידי רשת actomyosin קנס קרוב למשטח ההיקפי של אלה ביצה ^{צעירים 12}. לכן, שינוי מלאכותי של משטח הסלולר הנגרם על ידי שיטוח עדין של רקמה זו עשויה להיות השפעה שלילית על התנהגות של מכונות הפקת כוח actomyosin. קונטרפונקט הוא כי אם הרקמה הקאמרית ביצה אינו משוטח, הדמיה מיקרוסקופית של חלבונים על פני השטח הcircumשל תאי ביצה הופך להיות מוגבל עוד יותר על ידי גודל ירידה של מטוס הרכישה.

לכן, יש לנו פרוטוקולים משולבים מ פראסאד ואח '⁹ ואת המעבדה של סלסט ברג^4,10 ועוד שונה אותם כך לא coverslip/שמיכה גמישה/agarose משמש בשיטה מפותחת. מרבית תאי הביצה מתורבתים באופן חופשי בתקשורת והפרוטוקול המוצג כאן חל רק מיקרוסקופ הפוך. . יש שני חלקים לפרוטוקול החלק הראשון מתמקד בניתוח של אותות actomyosin בקנה מידה הסלולר המקומי (עד 15 תאים) בתוך תאי ביצה. בחלק השני אנו מתמקדים בהתגברות על המגבלות הקשורות למישור הרכישה הקטן שנגרם כתוצאה מהתפירה החופשית של תאי הביצה. בהקשר זה, פיתחנו הרומן מבוססי פיג'י שיטה חישובית עם ממשק משתמש גרפי למחצה אינטראקטיבי באופן סלקטיבי ומתגלה שכבות מוגדרות של משטח רקמות. הדבר מלווה בפרוטוקול המתאר כיצד לנתח actomyosin בסולם הרקמה (כלומר, > 50 תאים). כמו החילוץ סלקטיבי של שכבה דקה מוגדרת של רקמות אפיתל מעוקל לא ניתן בקלות באמצעות הקרנת z-מחסנית קלאסית (איור 1), זו שיטה קלה לשימוש משמש כתנאי מוקדם חשוב להבין באופן מקיף את ה אופן הפעולה של רשת actomyosin דקה (< 1 μm) בסולם הרקמה בתאי ביצת דרוסופילה .

בנוסף, כדי להקל על הפרוטוקול, אנו מספקים למשל סרטים לפקיעה זמן (TLMs) וקבצים לדוגמה של מתויג בלתי שרירים רירן II התנהגות קונבנציונאלי (ראה קובץ משלים 3). רירן II הוא חלבון מוטורי ומייצג את החלק האקטיבי של המכונות actomyosin. כדי לדמות רירן II, אנו משתמשים הקווים הטרנסגניים הכוללים שרשרת אור שונה הרגולציה של רירן II בשם mrlc:: gfp (ראה טבלת חומרים לפרטים)^12,13. כדי להמחיש את קרום התאים, הפרוטוקול מבוסס על צבעים מסחריים (ראה טבלת חומרים). פרוטוקול זה מתאים לא רק לניתוח של mrlc קטן מסוג subcellular:: אותות gfp¹² אבל גם עבור כל החלקיקים בגודל זהה subcellular סביב ± 300 μm, כגון אלה שנצפו עם חיים-Act:: gfp^12,14.

למרות ששני הפרוטוקולים הללו מוצגים באמצעות מבחנה בתאי ביצה מחוץ לגופית, רכישת אותות actomyosin יכול גם להתבצע באמצעות רקמות אחרות על אופטימיזציה של מדיה culturing ובהתאם לזמינות של או פלואור מתויג חלבונים עם צבעים מסחריים מתאימים או, למשל, מיקרוזריקות mRNA כדי להשיג פרופילים של ביטוי גנים ארעי. באופן דומה, הפרוטוקול המבוסס על פיג'י להפקת שכבה דקה ממשטח משטח, ניתן ליישם באופן כללי יותר אליפסואיד ורקמות כמו איברים.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא מספק הוראות כיצד לנתח actomyosin ב הסלולר המקומי ובקנה מידה הרקמה בבית הביצה Drosophila ילה . הגישה בקנה מידה מקומי מאפשרת למשתמשים לנתח התנהגות actomyosin מפורטת של עד 15 תאים לכל תא ביצה ודורש רכישה של tlms לתקופה קצרה של זמן (5-10 דקות) באמצעות דימות במהירות גבוהה ומיקרוסקופ קונפוקלית הפוכה. לעומת זאת, קנה המידה של רקמת מספק למשתמשים עם מידע actomyosin ב 50-100 תאים ודורש רכישת TLMs לתקופה ארוכה של זמן (≥ 30 דקות) באמצעות דימות במהירות נמוכה מיקרוסקופ דיסק מסתובב הפוך (ראה איור 2 ו פרמטרים מומלצים בכל קנה מידה בטבלה 1). ההחלטה באיזו מידה לנתח אותות actomyosin תלוי לחלוטין בשאלה המדעית של המשתמש. בדיקה מלווה לקבלת החלטות אלה אמורות לסייע לבצע החלטה זו.

1. סולם הסלולר המקומי (LCS)

הערה: לנתח ולצלם בחדרי ביצה בעלי מבחנה תרבותית, עקבו אחר הפרוטוקול המתואר בקובץ המשלים 1. כדי לנתח TLMs שנרכשו, המשך בפרוטוקול הבא. קישורים לקבצי בדיקה מלווים של TLMs מסופקים בקובץ המשלים 3.

1. עיבוד נתונים של TLMs בסולם הסלולר המקומי (LCS)
   1. תיקון אקונומיקה של TLMs כדי לפצות על התנוונות העוצמה של תוויות פלורסנט
      1. ודא שהיישום העדכני של פיג'י מותקן במחשב שבו נעשה שימוש על-ידי ביצוע ההוראות הבאות: פיג'י ≫ לפתוח את החור (למשל, TestMovie1. Tif מתוך הקובץ המשלים 3).
      2. פצל את ערוצי הצבעים על -ידי לחיצה על > צבע > לפצל ערוצים.
      3. בצע תיקון אקונומיקה בשני הערוצים באמצעות התמונה > התאים ≫ תיקון אקונומיקה > יחס פשוט > רקע עוצמה 0.0.
         הערה: אם מתקבלים תוצאות לא משביעות רצון, חקור אילו שיטות תיקון בתוסף זה מתאימה ביותר (לדוגמה, השתמש בהתאמת היסטוגרמה במקום ביחס פשוט).
   2. פילוח של תא כדי ליצור מסיכת תא עבור TLMs
      1. אם פיג'י כבר לא פתוח, פתח אותו מחדש (וודא שהוא עדכני) לאחר העזרה > עדכון > החיל שינויים > אישור.
      2. אם זה עדיין לא נעשה, להוריד את המאקרו Tissuecellmentמסרט. ijm (מ http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). גרור ושחרר סקריפט זה לתוך פיג'י.
      3. פתח את קובץ ה-. tiff המתוקן של האקונומיקה (ראה סעיף 1.1.1). פצל את הערוצים של הקובץ שתוקן על-ידי אקונומיקה באמצעות תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים.
      4. הפעל את קובץ ה-script שהועלה על ערוץ הממברנה של התא הפעיל של ה-, על-ידי לחיצה על הסמל הפעל בקובץ ה-script הפתוח. הגדר את הטשטוש של גאוס ל- 2.500 ורגישות זיהוי התא ל -1 ולחץ על אישור. על מנת לקבל מסיכת תא נחמדה, אל תשנה פרמטרים אלה לעיל. הגדר את עמידות הרעש המשוערת בין 10 ל-20 עבור הרכישה באמצעות המטרה 63 x ולחץ על אישור.
         הערה: למטרות אחרות, ייתכן שיידרשו פרמטרים שונים. מנקה הרקע בתוך מערכת החומר , העמידות הנמוכה ביותר ברעש.
      5. מסיכת תא שנוצרה מופיעה ב-"מחסנית מנותח" וגם בחלון חדש הנקרא ' שלמחסנית ' (G), ובנוסף, חלון קטן בשם ' הפעולה הדרושה ' מופיע. ממסכת התא ב-, התמקד רק בתאים במרכז ה-, ובחר באלה שיכולים לספק קווי מתאר מלאים ומוגדרים היטב ברחבי ה-.
      6. אם התאים הנבחרים מכילים קווי מתאר של תאים מלאכותיים/מיותרים, השתמש בחלון כלי המיזוג הנקרא פעולה הדרושה ב-, הדבר הנדרש. במקרה האחרון, עקבו אחר ההוראות שבחלון.
         הערה: ודא שקווי המתאר של התא מוגדרים היטב ומתאימים לקרומים התאים האמיתיים בתוך מכשיר שאינו מדויק ככל שניתן להשפיע על הניתוחים הבאים. מנופך ושינויים נוספים, כגון הסרת תאים לא רצויים, ניתן לבצע מאוחר יותר באמצעות הכלי מנהל פני השטח (המתואר בסעיף 1.1.3).
      7. כאשר התאים הנבחרים במרכז מתאימים בצורה יפה לקרומים האמיתיים של התא, שמור את המחסנית כקובץ. tiff לאחר הקובץ ≫ שמירה כ -> tiff.
   3. טעינת מסיכת התא שנוצרה למנהל פני השטח
      1. התקנת מנהל פני השטח תוסף¹⁵ לתוך ההתקנה בשימוש פיג'י. בצע את ההוראות של וויקטורנובה ואח '¹⁶.
      2. מנהל פני שטח פתוח באמצעות תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d).
         הערה: חלון מנהל פני השטח מציג מספר לחצני פעולה בצד ימין וחלון ריק משמאל. כדי לראות את כל לחצני הפעולה, ייתכן שתידרש למתוח את החלון בגובהו/רוחבו. שים לב שמסגרות זמן יופיעו כפרוסות z.
      3. פתח את הקובץ המתאים של מחסנית. tiff למנהל פני השטח על-ידי לחיצה על קובץ > פתוח ובחר את התמונה לפתיחה (לדוגמה, ParticlesStack1. tif).
      4. במנהל פני השטח, לחץ על לחצן ' קרא תמונת חלוקה לרמות ' והגדר את האינדקס של ג'אקארד ל-60%.
         הערה: טעינת הקובץ ParticlesStack1. tif עשויה להימשך עד מספר דקות, בהתאם לעוצמת העיבוד של המחשב.
      5. לאחר הטעינה, כל תא יוקצה עם מספר S ויופיע בחלק השמאלי של חלון מנהל פני השטח.
         הערה: כדי להציג קווי מתאר ושמות תאים עבור כל התאים, סמן את תיבות הסימון הצג הכל והראה תוויות בתחתית החלון של מנהל פני השטח. מומלץ להשתמש בפונקציה זו לאחר שמספרי התאים נבדקו על נכונותם.
      6. לחץ על מספר ה-S הראשון; קו המתאר של התא המיובא מ-ParticlesStack1. tif מופיע ב-. בדוק כל מספר S מיובא עבור איכות החלוקה לרמות של התא ברחבי ה-, והסר תאים לא רצויים המציגים קווי מתאר של תאים שגויים. לשם כך, סמן את קו המתאר של התא ולחץ על הלחצן Delete.
         הערה: ניתן גם לתקן קווי מתאר של תאים מדויקים ולהוסיף קווי מתאר חדשים לתאים. הדבר מתואר בסעיף הדיונים.
      7. שמור את כל התאים המתוקן כקובץ RoiSet. zip על-ידי לחיצה על לחצן שמור לדיסק .
         הערה: אם ההפעלה צריכה להיות מופרעת, ניתן לטעון את הקובץ RoiSet לתוך מנהל פני השטח מאוחר יותר: לפתוח קטע בפיג (קובץ > פתוח) ובחר בחור. מנהל פני שטח פתוח באמצעות תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d). טען את הקובץ RoiSet. zip המתאים על-ידי לחיצה על לחצן הטעינה מהדיסק ובחירת קובץ ה-RoiSet. zip המתאים. בדקו פעמיים שמסיכות התא הטעונות מתאימות ל-"טים" הטעון.
   4. תיקון עבור הסחף רקמות ב-TLMs
      הערה: במהלך זמן הרכישה של TLMs, השפעות הסחף עשויות להיות נצפו עקב סיבוב האפיתל או תנועה בלתי רצויה. בשני המקרים, אנו ממליצים לתקן את כל הסחף כדי לפשט את הניתוח הידני של actomyosin מאוחר יותר. תיקון הסחף נדרש רק עבור ניתוח actomyosin ידני. ערכת לימוד זו מחייבת תוכנה מעודכנת של פיג'י עם התוסף MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) מותקן.
      1. פתחו את מתקן האקונומיקה בפיג באמצעות הקובץ > פתח ובחר את הקובץ המתוקן באקונומיקה שנוצר באמצעות ערכת הלימוד שהוזכרה לעיל.
      2. פצל את הערוצים ובחר באפשרות המזהה את קרום התא באמצעות תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים.
      3. השתמש בפרוטוקול הבא כאשר קווי המתאר של התא אינם חלקים בעליל: תהליך ≫ מסננים > טשטוש לפי עקומת גאוס. הגדר אותו ~ 1 – 2 עבור מטרה 63 x ולחץ על אישור ואז כן. לחץ על תהליך ≫ בינארי > המר למסיכה באמצעות הגדרות ברירת המחדל; לאחר מכן, לחץ על אישור.
      4. טען את התוסף MultiStackReg לאחר התוספים > רישום > multistackreg.
      5. ודא שמחסנית 1 מוגדרת לערוץ קרום התא, פעולה 1 מוגדרת כיישור ושינוי צורה מוגדר כתרגום. בדוק את תיבת הסימון שמור קובץ המרה ולאחר מכן לחץ על אישור.
      6. פתח מחדש את ה-, MultiStackReg Plug-in, וקובץ ההמרה השמור באמצעות הקובץ > פתוח ובחר באפשרות. פצל את ערוצי הצבע באמצעות > צבע תמונה > לפצל ערוצים.
      7. טען את התוסף MultiStackReg על ידי לחיצה על תוספים > רישום > multistackreg. בחרו ' טען קובץ המרה כפעולה 1 '.
      8. השאר שינוי כגוף קשיח ולחץ על אישור. בחרו בקובץ ההמרה שנשמר בעבר ולחצו על ' אשר ' שוב.
      9. מזג את ערוצי התמונות ושמור את ה-"מיזוג" הרשום כקובץ. tiff לאחר התמונה > צבע > למזג ערוצים. שמור את הקובץ על-ידי לחיצה על קובץ ≫ שמירה בשם > Tiff.
         הערה: ישנן דרכים חלופיות כדי לתקן את הסחף רקמות בפיג, כלומר באמצעות תוספים > רישום ≫ Stackreg/תיקון 3d הסחף.
2. ניתוח הפולסים של actomyosin במנהל פני השטח at LCS
   הערה: שלב זה של פרוטוקול מאפשר למדענים לזהות אם פולסים actomyosin נמצאים ברקמה מנותח ולהבין את ההתנהגות המפורטת, כמו גם את הכיווניות של אותות actomyosin.
   1. פתחו את פיג'י וודאו שמסכת התאים המתאימה פתוחה במנהל פני השטח.
      הערה: ודא שפיג'י מותקן ומעודכן ותוסף מנהל פני השטח מותקן (שלב 1.1.3.1).
   2. פתח קשר עם קובץ > פתוח ובחר באפשרות לפתיחה (לדוגמה, TestMovie1_bleach. tif). טען את מנהל פני השטח Plugin באמצעות תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d). טען את מסיכת התא השמורה שנוצרה בערכת הלימוד כאן (לדוגמה, ParticlesStack1 . tif) באמצעות הקובץ > פתיחה ובחירה של מסיכת תא (לדוגמה, ParticlesStack1. tif). טען את אזור הריבית המתאים (ROI, לדוגמה, TestMovie1_RoiSet. zip). ראה איור 3A.
   3. מעבר לערוץ העניין של היחידה הנבחרת.
      הערה: כדי להבדיל בין הערוצים, פעל לפי קוד הצבע המצוין סביב האזור.
   4. במנהל פני השטח, לחץ על לחצן הסטטיסטיקה כדי לקבל את החלון הנקרא ערך אפור ממוצע פרוסה לפי פרוסה (איור 3 ב'). שים לב כי ערכי האינטנסיביות הממוצע/חציון של מאותת actomyosin בערוץ מנותח נתון בתוך קווי המתאר של התא המוגדרים לאורך זמן יוצגו, כמו גם פרמטרים אחרים הקשורים לאזור התא וצורת התא.
      הערה: ערכי האינטנסיביות נמצאים בתוך יחידות בוררויות (A.U.); אזור התא הוא בפיקסלים ויש צורך להמיר לתוך מיקרומטר מרובע.
   5. שמור את הערכים שהושגו כקובץ גיליון אלקטרוני. לחץ על החלון סטטיסטיקה, הקובץ ≫ שמירה בשם.
      הערה: לאחר מכן ניתן לוודא שהושגו ערכים סטטיסטיים מאוחר יותר: פתחו את היחידה לתיקון אקונומיקה בפיג ומנהלת פני השטח הפתוחה. טען את ה-RoiSet. zip המתאים ל-מיקוד על-ידי לחיצה על לחצן הטעינה מהדיסק ופתיחת הקובץ. המסיכה שנשמרה עם קווי מתאר של תאים יועלו ושמות התאים יופיעו בחלון מנהל המשטח השמאלי. לחץ על לחצן סטטיסטיקה עבור ערכים סטטיסטיים.
3. ניתוח ידני של אותות בעלי הסלולר היחידניים ב-LCS
   הערה: פרוטוקול זה מחייב את רוב הריכוז והוא מגזול זמן רב. באופן כללי, ניתן לנתח את האדם בתוך יום אחד. זה לא כולל את הזמן להכנה לטוס לפני הניתוח שלהם, הניתוח עצמו, ורכישת תמונה.
   1. פתח את הטופס הנבחר, המתוקן והרשום (מתוקן להיסחף) ביישום פיג'י עדכני. השתמש בתיקון מלבין ומתוקן להיסחף (לדוגמה, TestMovie1_bleach_reg. tif) כדוגמה לבדיקה.
   2. כוונן את הבהירות והניגודיות כדי לראות את אותות actomyosin בודדים באמצעות התמונה > התאים ≫ בהירות /ניגודיות.
   3. יישר את TLMs באותו כיוון יחסית לציר הרקמה/הגוף. במקרה של תאי ביצה, ליישר את הצד הקדמי של תאי הביצה תמיד לשמאל התמונה/submovie/לפני הניתוח.
   4. חלק את הסרט הנבחר לסרטי משנה קצרים של 30 ולפרוייקט זמן כל אחד מהם. שמור סרטים משניים שאינם מוזמנים ומוקרן בזמן עם שמות מקבילים. . שמור את המקור המקורי
      הערה: ניתן ליצור סרטים משניים מתוך TLMs מקוריים על-ידי מחיקה ראשונה של מסגרות לא רצויות באמצעות תמונה > ערימות > מסיר פרוסה. הגדירו את הפרוסות שיוסרו וקבעו תוספת קבועה. המרה ל-RGB לפני השימוש במסיר הפרוסה כאשר תוספת = 1. כדי להקרין זמן בפרוייקט משנה של 30 s, לחץ על תמונה > ערימות > Z-project > Max עבור המסגרות המוגדרות (פרוסות) ולאחר מכן לחץ על אישור. לדלג על כל שנייה 30 של הסרט submovie כדי למנוע ספירה של אותות actomyosin 2x בשני שלאחר מכן 30 הסרטים המשניים.
   5. מניחים תמונה מוקרן בזמן ליד המקבילה של 30 הסרט המשנה (איור 4A, B). זהה את קו האות בסרט המשנה שמתוכנן בזמן. זיהוי הכיוון של תנועת האות actomyosin (0 ° – 360 °) לאורך קו זה בסרט המשנה המקורי על ידי השמעת ידנית הסרט submovie. השתמש בכלי זווית (בשורת פיג'י) כדי למדוד באופן ידני את כיוון תנועת האות ביחס לציר הרקמה המוגדר או לכלי הזמין דומה.
      הערה: פיג'י פועל רק בקנה מידה של 0 ° – 180 ° (איור 4C), והחישוב מראש של הערכים שהתקבלו על קנה מידה של 0 ° – 360 °. קו איתות תואם למסלול. של תנועת אות אחת לאורך זמן
   6. כדי למנוע כפילות בניתוח של אותות actomyosin, לסמן את קווי האות מנותח בתוך תאים בזמן מוקרן submovie (איור 4B, D).
   7. נתח את כל התאים שנבחרו בסרט המשנה של 30 ושמור את הזוויות שהתקבלו.
      הערה: לנתח רק התאים המשניים cytoplasmic actomyosin בתאי עם קווי מיתאר מוגדרים היטב ברחבי הדרך. לא לכלול תאים בודדים עם פחות מ 15-20 זיהה אותות ב-השלם. התעלם מאותות actomyosin העוברים בין תאים עקב מקורם הלא ידוע. דוגמה לספירת אותות עבור תא אחד שנותח בסרט המשנה של 30 מוצגת באיור 4D.
   8. המשך עד ל-30 הסרטים המשניים הארוכים של היחידה המנותח, ושמור את כל הזוויות הנמדדות של אותות actomyosin של אחד בקובץ הגיליון האלקטרוני.
   9. סיכום כל הזוויות שנמדדו במספר הרלוונטי של TLMs (התלויות בניסוי). התווה את אחוז הכיוון של אותות actomyosin שנותחו, לדוגמה, כדיאגרמת ורד עם טווח של 0 ° עד 360 ° עם תוכנה מועדפת.
      הערה: כדי לקבל תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, מומלץ לנתח חמישה עד עשרה תאי ביצה עצמאיים של כל משלב של תא ביצה.

2. רקמת מאזניים

הערה: לנתח ולצלם בחדרי ביצה בעלי מבחנה תרבותית, עקבו אחר הפרוטוקול בקובץ המשלים 2. כדי לנתח TLMs שנרכשו, המשך בפרוטוקול הבא שלהלן. קבצי מבחנים מלווים של TLMs ממוקמים בקובץ המשלים 3.

1. הוצאת פני שטח סלקטיבית של רקמות אפיתל מעוקל
   הערהפרוטוקול זה מאפשר למשתמשים לחלץ באופן סלקטיבי שכבה דקה של actomyosin ברקמת אפיתל מעוקל לאורך זמן. שלב פרוטוקול זה הוא ידידותי למשתמש ומבוסס על ממשק גרפי אינטואיטיבי. ניתן לנתח בנוחות (לחלץ משטח) מספר tlms. השתמש ב-TestMovie2. czi (מתוך הקובץ משלים 3) כדוגמה של מבחן.
   1. פתח יישום פיג'י עדכני (פיג'י > עזור ≫ עדכון > החיל שינויים > אישור).
   2. ודא כי הקרנת פני השטח של אליפסואיד תוסף¹⁵ מותקנת. עקבו אחרי וויקטנובה ואח'. . ^{שישה עשרה}
   3. פתח HDF5 ולייצא אותו כקובץ XML/על-ידי לחיצה על תוספים ≫ bigdataviewer > ייצוא תמונה נוכחית כקובץ XML/HDF5.
      הערה: הוא נדרש להגדרת נתיב ייצוא. החיסכון עצמו יכול להימשך מספר דקות ותלוי באורך של היחידה.
   4. פתח את הקובץ המיוצא בהקרנת פני השטח של אליפסואיד על-ידי לחיצה על תוספים ≫ במציג bigdataviewer ≫ הקרנת משטח אליפסוID > בחר קובץ XML.
      הערה: חלון חדש עם תצוגות משונן של חדר הביצה ודיאלוג כדי להנחות את המשתמש דרך העיבוד יופיע. פרטים על אופן הניווט בתצוגת הפרוסה ניתן למצוא ב-https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. לחלון הדו שנקרא הקרנת שחלות יש כמה כרטיסיות. בכרטיסיית הדו הראשונה הנקראת תיבה תוחמת, הגדירו את גבולות ה-x ו-y של תא ביצה ביחד עם רוחב z של התיבה התוחמת (כלומר, העומק של מחסנית z/תא ביצה) והקישו set (איור 5a).
   6. כדי להגדיר גבולות, לחצני גרירה לצד x, y ו-z או להגדיר את קואורדינטות המספר בתיבות x, y ו-z. ודא כי הגבולות הם נדיבים מספיק כדי לקבל את החלק של חדר הביצה של עניין לתוך החילוץ פני השטח. החלקים הנבחרים של תא הביצה מודגשים בוורוד.
   7. עבור לכרטיסיה הנקראת בועות חיפוש בחלון הקרנת השחלות. הגדירו את הסיגמא ואת ערך השיא המינימלי; לאחר מכן, הקש מחשב כדי לזהות את אותות actomyosin (איור 5B), אשר יופיע כתמים ירוקים. נסה שוב לבצע שלב זה עם פרמטרים שונים עד שיימצאו מספיק נקודות (סביב 100).
      הערה: סיגמא 1 \ u20123 עם ערך שיא מינימלי 20 \ u2012100 עובד הטוב ביותר כדי לזהות אותות actomyosin של שלב 6 ל-8 תאי ביצה. זיהוי אותות actomyosin הוא צעד מכריע תלוי באיכות האות וגודלה. חשוב לאשר את הגודל הנכון של הכתמים הקיימים. אין כתמים/כתמים ירוקים גלויים בתמונה פירושו שהשלב הבא לא יפעל. דפדף בין מטוסי z שנבחרו כדי לראות כתמים.
   8. כדי לעצב את האליפסואיד, המשך בכרטיסיה הנקראת ' התאם אליפסואיד'. הגדר דגימות אקראיות ל-10,000, מרחק מחוץ לטווח החיתוך אל 1 \ u201210 ולאחר מכן לחץ על חשב (איור 5c).
      הערה: ככל שהמרחק החתוך נמוך יותר, כך האליפסואיד הרצוי יהיה מדויק יותר. לאחר מכן, הכרטיסייה שנקראת הקרנה תיפתח באופן אוטומטי ותאפשר את ההגדרה של הוצאת פני השטח. יש למטב את ההגדרות.
   9. המשך להתקדם עם הכרטיסייה הנקראת הטלה (איור 5d). הגדר מרחק הקרנה מינימלי ומקסימלי (כלומר, הרוחב של האליפסואיד הרצוי). היא מחויבת לקבוע מרחק הקרנה מינימלי ומקסימלי, כך שאזור אליפסואיד הוורוד המוגדר כולל את כל השכבה החיצונית של תא הביצה. הגדירו את מרחק הפרוסה (1 מומלץ).
      הערה: דוגמאות להתאמת אליפסואיד שגויה ומיטבית, וכתוצאה מכך פרמטרי הקרנה שגויים ואופטימליים מוצגים באיור 6A, C. ניתן להגדיר מאוחר יותר את השכבה הבפררית הדקה של הריבית. ודא שהאזור הוורוד של האליפסואיד עם הרוחב המוגדר על תא הביצה גלוי לפני ההקשה על חישוב. חשוב כי האליפסואיד הרצוי (קו יחיד ורוד) מתאים בצורה יפה למשטח האליפסואיד של תא ביצה על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר. אם התאמת האליפסואיד אינה טובה, סדר הגדרות שונות עד להשגת הוצאת המשטח הרצויה.
      1. הגדר רוחב פלט (≥ 800) וגובה (≥ 400) של האליפסואיד. הגדר מתוך איזו נקודת זמן שאליה יש ליצור את החילוץ פני השטח (כלומר, להגדיר את אורך מיצוי המים). בחרו הקרנה כדורית או גליל. היפוך Z וישר Y במידת הצורך.
      2. לחץ לחשב כדי לקבל מיצוי פני שטח עבור שני הערוצים בחלונות חדשים בשם תמונה. כוונן את הבהירות והניגודיות של חלונות התמונה שהושגו כדי לראות את האותות המוקרנת של actomyosin, על-ידי לחיצה על תמונה ≫ התאם ≫ בהירות /ניגודיות.
         הערה: דוגמה להשוואה בין הקרנה שנובעת מהתאמת אליפסואיד שגויה ואופטימלית מופיעה באיור 6B, D.
   10. אם הוצאת פני השטח נראית טוב, שמור את התמונות (שני הערוצים בנפרד) כ-tiff. בנוסף, שמור את קובץ החלון Log לעיון עתידי לגבי אופן החילוץ של פני השטח של תא ביצה מסוים זה.
       הערה: זה מידע חשוב במיוחד אם יש להחזיר את השכבה הדקה המחולץ לצורתו המקורית (למפתחים בלבד).
   11. מזג את הערוצים באמצעות קוד צבע מועדף בפיג.
       הערה: במקרה הצורך, הפרוייקט מחסנית z שנבחרה עם אותות actomyosin. הקרנת השכבות של מחסנית z הנבחרת נדרשת כאשר מוקד הרכישה משתנה מעט לאורך זמן ב-ביצוע. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפרוייקט ברוב אחד עד שתי שכבות z-מחסנית.
   12. שמור את התוצאות כקבצי tiff.
       הערה: דוגמאות הנציג של שכבות דקות (בסיס סלקטיבי משטח הקודקוד) המייצגים את רירן II (MRLC:: GFP) האות מן האפיתל הזקיק של השליטה ו fat2 ביצה מוטציה ניתן למצוא באיור 8.
2. עיבוד נתונים של משטח רקמה מחולץ סלקטיבי
   1. אקונומיקה-תקן את ה-TLMs כדי לפצות על הדעיכה האינטנסיביות של תוויות הפלורסנט.
      1. . פתח את פיג'י פתח את הקובץ (למשל, TestMovie2_extraction. tif מהקובץ המשלים 3) תוך שימוש בקובץ > פתוח. בחר בתמונה כדי לפתוח אותה.
      2. פצל את ערוצי הצבע והמר אותם לתמונות של 16 סיביות, במידת הצורך, על-ידי לחיצה על תמונה > צבע > פצל ערוצים. המר את הערוצים לתמונות של 16 סיביות (מתמונות 32 סיביות) באמצעות תמונה > סוג > 16 סיביות.
      3. בצע תיקון אקונומיקה בשני הערוצים באמצעות התמונה > התאים ≫ תיקון אקונומיקה > יחס פשוט > רקע עוצמה 0.0.
         הערה: אם מתקבלים תוצאות לא משביעות רצון, נדרש לחקור אילו שיטות תיקון בתוסף זה מתאימות ביותר (לדוגמה, השתמש בהתאמת היסטוגרמה במקום ביחס פשוט).
      4. מזג את הערוצים משתי התמונות שתוקנו על- ידי האקונומיקה על-ידי לחיצה > צבע > מיזוג ערוצים. שמור את התמונה הממוזגת כקובץ. tiff על-ידי לחיצה על קובץ ≫ שמירה בשם > tiff.
         הערה: כוונן את הניגודיות והבהירות עבור הערוצים במידת הצורך.
   2. פילוח של תא כדי ליצור מסיכת תא עבור TLMs
      1. אם פיג'י כבר לא פתוח, פתח אותו מחדש (וודא שהוא עדכני על-ידי לחיצה על עזרה > עדכון > החיל שינויים > אישור).
      2. אם זה עדיין לא נעשה כך, הורד את המאקרו מאקרו. ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. גרור ושחרר סקריפט זה לתוך פיג'י. פתח את הקובץ המתוקן באקונומיקה (לדוגמה, TestMovie2_bleach. tif מתוך הקובץ המשלים 3, ראה גם 2.2.1).
      4. פצל את הערוצים של הקובץ המתוקן באקונומיקה על-ידי לחיצה על תמונה > צבע > ערוצים מפוצלים. כוונן את ערוץ הממברנה כדי להבטיח קווי מתאר של תאים ברורים על-ידי לחיצה על תמונה ≫ התאם ≫ בהירות /ניגודיות.
      5. הפעל את קובץ ה-script שהועלה על ערוץ הממברנה של התא הפעיל של ה-, על-ידי לחיצה על הסמל הפעל בקובץ ה-script הפתוח. הגדר טשטוש גאוסיאני ל- 1.500. הגדר רגישות לזיהוי תאים 1 ולחץ על אישור. הגדר עמידות לרעשים מוערכים ל-~ 8 עבור הרכישה של tlms עם המטרה 40x ולחץ על אישור.
         הערה: על מנת לקבל מסיכת תא נחמדה, אל תשנה פרמטרים אלה לעיל. למטרות אחרות, ייתכן שיידרשו פרמטרים שונים. מנקה הרקע בתוך מערכת החומר , העמידות הנמוכה יותר ברעש.
      6. מסיכת תא שנוצרה מופיעה ב-"טים" המנותח וגם בחלון חדש הנקרא ' מחסנית ' (G). בנוסף, מופיע חלון קטן שנקרא ' פעולה '. ממסכת התא ב-, התמקד רק בתאים במרכז ה-, ובחר באלה שיכולים לספק קווי מתאר מלאים ומוגדרים היטב ברחבי ה-.
      7. אם התאים הנבחרים מכילים קווי מתאר של תאים מלאכותיים/מיותרים, השתמש בחלון כלי המיזוג הנקרא פעולה הדרושה ב-, הדבר הדרוש. במקרה האחרון, עקבו אחר ההוראות שבחלון.
         הערה: ודא שקווי המתאר של התא מוגדרים היטב ומתאימים לקרומים התאים האמיתיים בתוך מכשיר שאינו מדויק ככל שניתן להשפיע על הניתוחים הבאים. מנופך ושינויים נוספים, כגון הסרת תאים לא רצויים, ניתן לבצע במועד מאוחר יותר באמצעות הכלי מנהל פני השטח (המתואר במדריך להלן).
      8. כאשר התאים הנבחרים במרכז מתאימים יפה לקרומים האמיתיים של התא, שמור את המחסנית כקובץ . tiff לאחר הקובץ ≫ שמירה כ -> tiff. המשך לבצע את טעינת מסיכת התא שנוצר ואת ניתוח actomyosin מנהל פני השטח כפי שבוצעה בעבר סעיפים 1.1.3 ו 1.2 (המתואר גם בפירוט סעיפים 2.2.3 ו 2.3).
   3. טעינת מסיכת התא שנוצרה למנהל פני השטח
      1. אם מנהל פני השטח תוסף כבר מותקן בכיוונון פיג'י בשימוש, המשך לשלב 2. אם לא, עקבו אחר וויקטורנובה ואח '¹⁶. עבור מפתחים, רק קוד המקור זמין גם כן¹⁵.
      2. מנהל פני שטח פתוח על-ידי לחיצה על תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d).
         הערה: חלון מנהל פני השטח מציג מספר לחצני פעולה בצד ימין וחלון ריק משמאל. כדי לראות את כל לחצני הפעולה, ייתכן שתידרש למתוח את החלון בגובהו/רוחבו. שים לב שמסגרות זמן יופיעו כפרוסות z.
      3. פתח את הקובץ המתאים למחסנית. tif לתוך מנהל פני השטח באמצעות הקובץ > פתח ובחר את התמונה לפתיחה (למשל, ParticleStack2. Tif מהקובץ המשלים 3).
      4. במנהל פני השטח, לחץ על לחצן ' קרא תמונת חלוקה לרמות ' והגדר את האינדקס של ג'אקארד ל-60%.
         הערה: טעינת קובץ מחסנית. tif יכול להימשך עד מספר דקות, בהתאם לעוצמת המחשב.
      5. לאחר הטעינה, כל תא יוקצה עם מספר S ויופיע בחלק השמאלי של חלון מנהל פני השטח (איור 7A).
         הערה: כדי להציג קווי מתאר ושמות תאים עבור כל התאים, סמן את תיבות הסימון הצג הכל והראה תוויות בתחתית החלון של מנהל פני השטח. מומלץ להשתמש בפונקציה זו לאחר שמספרי התאים נבדקו על נכונותם.
      6. לחץ על מספר ה-S הראשון; קו המתאר של התא המיובא מתוך מחסנית. tif מופיע ב-. בדוק כל מספר S מיובא עבור איכות החלוקה לרמות של התא ברחבי ה-, והסר תאים לא רצויים המציגים קווי מתאר של תאים שגויים. לשם כך, סמן את קו המתאר של התא ולחץ על הלחצן Delete.
         הערה: ניתן גם לתקן קווי מתאר של תאים מדויקים ולהוסיף קווי מתאר חדשים לתאים. הדבר מתואר בסעיף הדיונים.
      7. שמור את כל התאים המתוקן כקובץ RoiSet. zip על-ידי לחיצה על לחצן שמור לדיסק .
         הערה: אם ההפעלה צריכה להיות מופסקת, ניתן לטעון את הקובץ RoiSet. zip למנהל פני השטח מאוחר יותר: לפתוח את הקטע בפיג באמצעות הקובץ > פתוח ובחר בחור. מנהל פני שטח פתוח כדלקמן: תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d). טען את RoiSet. zip המתאים על-ידי לחיצה על לחצן הטעינה מהדיסק ובחירת קובץ ה-RoiSet. zip המתאים (לדוגמה, TestMovie2_RoiSet. zip). בדקו פעמיים שמסיכות התא הטעונות מתאימות ל-"טים" הטעון.
3. ניתוח פולסים במנהל פני השטח
   הערה: פתחו את פיג'י וודאו שמסכת התאים המתאימה פתוחה במנהל פני השטח. ודא שפיג'י מותקן ומעודכן ומנהל המשטח (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) מותקן.
   1. פתח קשר עם קובץ > פתוח ובחר באפשרות לפתיחה (לדוגמה, TestMovie2_bleach. tif). טען את תוסף מנהל פני השטח באמצעות תוספים > פילוח > מנהל פני השטח (3d). טען את מסיכת התא השמורה שנוצרה בערכת הלימוד כאן (לדוגמה, ParticlesStack2 . tif) באמצעות הקובץ > פתיחה ובחירה של מסיכת תא (לדוגמה, ParticlesStack2. tif). טען את התשואה המתאימה (לדוגמה, TestMovie2_RoiSet. zip).
   2. מעבר לערוץ העניין של היחידה הנבחרת.
      הערה: כדי להבחין בין הערוצים, פעל לפי קוד הצבע המצוין סביב האזור.
   3. במנהל פני השטח, לחץ על לחצן הסטטיסטיקה כדי לקבל את החלון הנקרא ערך אפור ממוצע פרוסה לפי פרוסה (איור 7b). שים לב כי ערכי האינטנסיביות הממוצע/חציון של מאותת actomyosin בערוץ מנותח נתון בתוך קווי המתאר של התא המוגדרים לאורך זמן יוצגו, כמו גם פרמטרים אחרים הקשורים לאזור התא וצורת התא.
      הערה: ערכי העוצמה הם ב-A.U.; אזור התא הוא בפיקסלים ויש צורך להמיר לתוך מיקרומטר מרובע.
   4. שמור את הערכים שהושגו כקובץ גיליון אלקטרוני: לחץ על החלון סטטיסטיקה, הקובץ ≫ שמירה בשם.
      הערה: ניתן לאמת את הערכים הסטטיסטיים שהושגו מאוחר יותר, כדלקמן. פתח את מתקן האקונומיקה בפיג. מנהל פני שטח פתוח. טען את ה-RoiSet. zip המתאים ל-מיקוד על-ידי לחיצה על לחצן הטעינה מהדיסק ופתיחת הקובץ. המסיכה שנשמרה עם קווי מתאר של תאים יועלו ושמות התאים יופיעו בחלון מנהל המשטח השמאלי. לחץ על לחצן סטטיסטיקה עבור ערכים סטטיסטיים.
      הערה: לגבי ניתוח ידני של אותות הסלולר actomyosin בודדים, לא ניתן לבצע ניתוח ידני של אותות actomyosin בקנה מידה של הרקמה. מיטוב נדרש לניתוח של אותות actomyosin בודדים בסולם למחצה רקמה, כפי שמסומן בסעיף הדיון.

תוצאות

פרוטוקול זה מאפשר למדענים לחקור את ההתנהגות של רשתות actomyosin ברקמות אפיתל. זה אפשרי רק כאשר ניתוח מפורט של התנהגות actomyosin בקנה מידה הסלולר המקומי (כמה תאים) משולב עם ניתוח דומה בסולם הרקמה (תאים רבים). עם זאת, רקמות אפיתל הן לעתים קרובות מעוקל והפקת שכבה דקה של רקמות אלה בעבר ל...

Discussion

שלבים קריטיים ופתרון בעיות לחיתוך ולניתוח של תאי ביצה

אם זבובים רבים מדי ממוקמים לתוך בקבוקון קטן, האוכל לעוף יכול להפוך מלוכלך אחרי 2 – 3 ימים בשל כמויות נרחבות של הזחלים האכלה וזבובים מבוגרים לכודים במזון לעוף. במקרה כזה, להפוך את שאר הזבובים האלה לתוך בקבוקון חדש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 mL Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.