זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

Summary

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.

Abstract

שם היא הגדלת ההתעניינות ביופסיה נוזלי על אבחון סרטן, פרוגנוזה טיפולית ניטור, יוצרים את הצורך של סמנים ביולוגיים אמין ושימושי עבור הקלינית. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לחלץ, הפוכה לתמלל ולהעריך את רמות הביטוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה של חולים עם סרטן המעי הגס (CRC). מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של אי קידוד RNAs של נוקלאוטידים 18-25 אורך לווסת את הביטוי של גנים היעד ברמת translational, לשחק תפקיד חשוב, כולל זו של הפונקציה pro - ו anti-אנגיוגנזה, physiopathology של איברים שונים. miRNAs יציבים ב נוזלים ביולוגיים כגון סרום, פלזמה, ההופכת אותם במחזור סמנים ביולוגיים לקבלת החלטות אבחון, פרוגנוזה וטיפול בסרטן וניטור אידיאלי. במחזור miRNA החילוץ בוצע באמצעות שיטה מהירה ויעילה הכרוכה האורגני והן מבוססי עמודה מתודולוגיות. עבור miRNA retrotranscription, השתמשנו תהליך רב שלבי ומתחשב פוליאדנילציה 3' ו את מצדו של מתאם-5' של miRNAs בוגרת, ואחריו miRNA אקראיים קדם הגברה. אנו נבחר לוח מותאם אישית 24-miRNA להיבדק ע י כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית), זיהה את הגששים miRNA על מערך לוחות מותאמים אישית. ביצענו לרביעיית-PCR צלחת פועל על מערכת ה-PCR בזמן אמת. משק miRNAs על נירמול נבחרו באמצעות תוכנת GeNorm (פס' 3.2). הנתונים נותחו באמצעות ביטוי חבילת תוכנה (v 1.1), בוצעו ניתוחים סטטיסטיים. השיטה הוכיחה להיות אמין וחזק מבחינה טכנית, יכול להיות שימושי להעריך את רמות סמן דגימות נוזלים כגון פלזמה ו/או סרום.

Introduction

CRC מייצג השלישי מרבה אובחן גידול ממאיר, הגורם הרביעי של מוות מסרטן ברחבי העולם. עד כה, bevacizumab (B), נוגדן חד שבטי נגד כלי הדם-צמיחה אנדותל (VEGF), ו ארביטוקס (C) או וקטיביקס (P), נוגדנים חד-שבטיים נגד גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR), אושרו על טיפול השורה הראשונה בשילוב עם משטרי כימותרפיה (CT).

מוטציות בגנים K-RAS ו- N-ראס הם סמנים שימושי קלינית היחיד המסוגל לזהות חולים נוטים פחות תועלת. לא אנטי-EGFR מבוססי למרות מספר מחקרים שנערכו כדי לחפש סמנים ביולוגיים שאינם חזוי של תגובה ל CT מבוסס-B, עדיין יש חוסר משמעותי של סמים יעיל ואמין לשימוש קליני¹.

miRNAs הם קטנים RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) להסדיר את התרגום של היעד גנים, לשחק תפקיד מכריע בתהליכי physiopathological רבים, כולל מופרה carcinogenesis. מולקולות אלה הן מאוד יציב נוזלים ביולוגיים כגון פלזמה/סרום, שתן, ברוק, ההופכת אותם סמנים ביולוגיים חזקים לשימוש עבור דגימה לא פולשנית². באמצעות פאנל של miRNAs מעורב מסלול האנגיוגנזה, כיוונו כדי לזהות חדש במחזור סמנים ביולוגיים מסוגל לחזות תוצאה קליניים בחולים עם גרורות CRC (mCRC) מטופלים עם משטר CT מבוסס-B.

ניתחנו את סדרת 52 mCRC חולים שטופלו CT מבוסס-B בתוך multicenter פוטנציאליים אקראי שלב III למשפט "האיטלקי משפט ב מתקדמים סרטן המעי הגס" (ITACa). בפרוטוקול הנוכחי שאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (Comitato e Etico באזור Vasta Istituto Scientifico Romagnolo לכל הלאו סטודיו e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 674 מס) על 19^th בספטמבר 2007. כל המטופלים נתנה הסכמה מדעת לפני איסוף דגימת דם. עבור כל מטופל, דגימות דם ורידי שנאספו לפני הטיפול ועל ההערכה הקלינית הראשונה (אחרי 8 שבועות) כדי להעריך את הביטוי miRNA בסיסית וויסות שלה במהלך הטיפול ביחס לתוצאה המטופל.

דרך חיפוש של הספרות, בחרנו miRNAs 21 בקורלציה עם תהליך האנגיוגנזה, אשר ידועים להיות לזיהוי בפלסמה אנושית: p יש-מיר-107, יש-מיר-126-3, p יש-מיר-145-5, p יש-מיר-194-5, יש-מיר-199a - 5p, יש-מיר - 200 ב' - 3p, יש-מיר - 20 ב' - 5p , יש-מיר-21-5 p, יש-מיר-210-3 p, יש-מיר-221-3 p, יש-מיר-24-3 p, p יש-מיר-27האוויר - 3p, יש-מיר-29b - 3p, יש-מיר-335-5, p יש-מיר-424-5, p יש-מיר-497-5, p יש-מיר - 520d - 3p, יש-מיר-92a - 3p, יש-מיר-17-5 ו p יש-מיר-155-5. בחרנו גם יש-מיר-223-3 p וטיהרו יש-מיר-484 נורמליזציה אנדוגני^3,4,5,6, צ'ל-מיר-39 מ- C. elegans ספייק-in עבור נרמול אקסוגני. כל הנתונים normalizations בוצעו באמצעות שיטת ̄(ΔΔCt) 2 ̂.

הזיהוי של מחזורי miRNAs מציג קשיים טכניים כי המולקולות נמצאים ברמות נמוכות מאוד בפלסמה הגברה שלהם הוא מאתגר מבחינה כימית בהתחשב הרצף קצר שלהם. מסיבות אלה, בחרנו הליך זה מחשיב החילוץ אורגני עם פנול והן מתודולוגיה מבוססי עמודה סיבי זכוכית. במחזור miRNA החילוץ הוא נושא חם בתחום ביופסיה נוזלי, בחרנו ערכת מסחרי זה הראה לאחד ביותר מבחינת כמות ואיכות של התשואות התאושש^7,8. בחרנו פרוטוקול להיפוך לתמלל miRNAs על ידי התוספת של מתאם 5' ו זנב poly(A) כדי 3' של miRNA בוגרת כדי לשפר את מידת הבררנות וספציפיות של התגובה.

בהתחשב החוסן של השיטה, אנו תוכנן לוחות מותאמים אישית עם קדם הבחינו זונדי RT-PCR להעריך כל דגימה של כפילויות, ניתח 2 חולים בתוך כל צלחת, כפי שמוצג באיור 1.

Protocol

הערה: לבצע את כל הפעולות הבאות תחת ברדס fume סטיריליים על פי התרגול מעבדה טובה (GLP).

1. פלזמה האיסוף והאחסון

1. לאסוף 3 מ"ל של דם היקפיים צינור K3E EDTA.
2. Centrifuge את הצינור בטמפרטורת החדר ב x 1,880 g למשך 15 דקות.
3. לשחזר פלזמה supernatant ב aliquots של 450 µL.
4. לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
   הערה: תהליך הצינור דם היקפיים בתוך שעתיים של אוסף. בעת התאוששות הפלזמה הצינור, נא לא להפריע השכבה לימפוציטים.

2. מיצוי של מחזורי miRNAs מ דגימות פלסמה (טבלה של חומרים)

1. להכין את כל הפתרונות הנדרשים, להפשיר את הדגימות עבור הצעדים החילוץ.
   1. להוסיף 375 µL של מרקפטואתנול הפתרון x denaturating 2 ומערבבים היטב.
   2. להוסיף 21 מ של ACS כיתה 100% אתנול הפתרון לשטוף miRNA אני, לערבב היטב.
   3. להוסיף 40 מ של ACS כיתה 100% אתנול הפתרון לשטוף 2/3 ומערבבים היטב.
   4. לאפשר מסך פלזמה aliquot כדי להפשיר בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להתחיל את השלבים החילוץ.
2. חילוץ אורגני
   1. העברת µL 400 המדגם פלזמה לתוך צינור ללא RNase 2 מ"ל.
   2. להוסיף 400 µL של פתרון x denaturating 2, לערבב על-ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה.
   3. להוסיף 4 µL 1 ננומטר ספייק-אין לערבב על ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה.
   4. הוסף µL 800 של חומצת פנול-כלורופורם.
   5. מערבולת עבור 60 s ו צנטריפוגה במהירות המרבית (≥ 10, 000 x g) למשך 15 דקות.
   6. להעביר את שלב מימית העליון צינור טריים. נא לא להפריע את לאטמוספרה. הערה האחסון התאושש ולמחוק את הצינור המכיל את שלב אי-acqueous.
      הערה: 2 x denaturing פתרון מאוחסן ב 4 ° C, עשוי לחזק בטמפרטורה זו. לפני השימוש, חמים הפתרון 37 ° C, לזעזע מדי פעם במשך 10-15 דקות להיות זהירים כדי למשוך את שלב תחתון המכילים את חומצת פנול-סם הרדמה, לא המאגר acqueous שנמצאת מעל התערובת. מחממים את פתרון • תנאי או נוקלאז ללא מים עד 95 מעלות צלזיוס. יש להיזהר חום אמצעי אחסון נאותים של פתרון (100 µL לכל דגימה + 10% עודף).
3. העשרה RNA קטנים
   1. מוסיפים 1/3 כמות אתנול 100% לשלב מימית מהשלב 2.2.6 ומערבבים היטב.
   2. המקום מחסנית מסנן לתוך צינור אוסף טריים עבור כל דגימה.
   3. להעביר עד 700 µL של lysate שלב 2.3.1 ואתנול לתוך מסנן מחסנית צנטריפוגה ב 10,000 x g ב-30 s.
   4. אם יש > µL 700 של תערובת שמאלה, למקם את פילטרט של צינור טריים וחזור על שלב 2.3.3; חזור עד כל התערובת עבר דרך המחסנית מסנן.
   5. למדוד את הנפח הכולל של הזרימה דרך.
   6. להוסיף נפח 2/3 של אתנול 100% filtrate ולערבב היטב.
   7. הכנס מחסנית המסנן השני צינור אוסף טריים.
   8. להעביר עד 700 µL נפח דגימה לתוך הדיו, centrifuge ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 30 של הזרימה דרך.
   9. חזור על שלב 2.3.8 עד כל התערובת עבר דרך המחסנית מסנן.
   10. חלות µL 700 miRNA שטיפת פתרון 1 הדיו מסנן, centrifuge הדיו מסנן עם הצינור אוסף ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 15 של הזרימה דרך. מקם את מחסנית מסנן בצינור אוסף אותו.
   11. החל µL 500 של שטיפת פתרון 2/3 מסנן מחסנית, צנטריפוגה הדיו מסנן עם הצינור אוסף ב 10,000 x g עבור ביטול ס' 15 של הזרימה דרך. מקם את מחסנית מסנן בשפופרת איסוף טריים.
   12. למקם את מחסנית מסנן בשפופרת איסוף טריים וחזור על שלב 2.3.11 עם 500 µL של שטיפת פתרון 2/3. למחוק את הזרימה דרך ולהעביר את מחסנית מסנן צינור אוסף טריים.
   13. Centrifuge השפופרות עם מכלי מסנן ב x 10,000 g עבור 1 דקות.
   14. להעביר את מחסנית מסנן לתוך צינור אוסף mL 1.5 טריים ומוסיפים µL 100 של פתרון • תנאי טרופה (95 ° C) או נוקלאז ללא מים.
   15. צנטריפוגה ב 10,000 x g ב-30 s כדי לשחזר miRNAs ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
       הערה: התמיסה לבן עשוי בצורה הפתרון לשטוף 2/3. זה עודף EDTA שוחרר מן הפתרון. הימנע ממלאים גבישים אלו במהלך השלבים pipetting.

3. לבצע שעתוק במהופך miRNA קדם הגברה (טבלה של חומרים)

1. ביצוע התגובה פוליאדנילציה
   1. הפשרת כל ריאגנטים בקרח, אז בקצרה מערבולת, צנטריפוגה ספין למטה את התוכן. בנוסף, הפשרה 50% פג 8000, ולאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר.
   2. מכינים את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה 0.5 mL, קבלת נפח סופי של 3 µL של תגובה קוקטייל עבור כל דגימה. השתמש את הכרכים הבאים, בתוספת 10% עודף אמצעי אחסון עבור כל ריאגנט.
   3. להוסיף µL 1.7 RNase ללא מים, 0.5 µL של 10 x Poly(A) מאגר, 0.5 µL של 10 מ מ ATP ו- 0.3 סוף סוף µL 5 תיקים עשויים U/µL האנזים.
   4. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
   5. להעביר µL 2 מדגם מכל קידוח של התגובה צלחת או תגובת הצינור ולהוסיף 3 µL של התגובה קוקטייל. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה ספין למטה את התוכן.
   6. מניחים על הצלחת/צינורות הצנטרפוגה תרמי ולבצע את הפעולות הבאות.
   7. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות (שלב פוליאדנילציה).
   8. דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (stop תגובה), עם אחיזה הבאים ב 4 º C.
2. לבצע את התגובה מצדו.
   1. להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.
   2. להוסיף µL 0.4 RNase ללא מים, µL 3 5 x מאגר ה-DNA ליגאז, 0.6 µL של 25 x מתאם מצדו, 4.5 µL של 50% 8000 פג, µL סוף סוף 1.5 של רנ א ליגאז.
   3. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
   4. להוסיף 10 µL של המיקס כל שפופרת טוב-תגובה המכיל את המוצר עוקב poly(A). מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.
   5. למקם את הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות: הדגירה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, עם קהל מעריצים להחזיק ב 4 º C.
      הערה: 50% 8000 פג הוא בעלי צמיגות גבוהה. השתמש בטמפרטורת החדר, כ רפה בעברית ו dispensing לאט. לאחר כל שאיפה, בכל שלב, להחזיק את plugger 10 s כדי לאפשר הכימית לזרום למעלה ולמטה.
3. לבצע את התגובה שעתוק במהופך.
   1. מכינים את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה, עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.
   2. הוסף µL 3.3 של RNase ללא מים, µL 6 5 x RT מאגר, µL 1.2 של dNTP מיקס (25 מ מ כל אחד), µL 1.5 של 20 x תחל RT אוניברסלי 3 סוף סוף µL של 10 x מיקס האנזים RT.
   3. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
   4. להוסיף µL 15 של המיקס כל שפופרת טוב-תגובה המכיל את המוצר מצדו. מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.
   5. מקום הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי עם ההגדרות הבאות.
   6. דגירה ב 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (שעתוק במהופך).
   7. דגירה ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (stop תגובה), עם אחיזה הבאים ב 4 º C.
      הערה: המוצר RT עכשיו ניתן לאחסן ב-20 ° C, יישאר יציב עד 2 חודשים.
4. לבצע את התגובה מיר-Amp (טבלה של חומרים).
   1. להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה ו-10% נפח עודף.
   2. הוסף µL 17.5 RNase ללא מים, µL 25 של המיקס מאסטר של מיר-Amp 2 x 2.5 µL של 20 x מיקס פריימר מיר-Amp.
   3. בקצרה מערבולת, צנטריפוגה לערבב קוקטייל ספין למטה את התוכן.
   4. עבור כל דגימה, להעביר µL 45 של המיקס התגובה כל טוב של צלחת תגובה חדשה או צינור התגובה. להוסיף 5 µL של המוצר RT כל שפופרת טוב או תגובה. מערבבים מטרף צלחת-1,900 סל"ד עבור 1 דקות או על ידי בקצרה vortexing ו ספין למטה התוכן.
   5. למקם את הצינורות צלחת-תגובה הצנטרפוגה תרמי ולהפעיל כפי שמוצג בטבלה 1.

4. ביצוע PCR בזמן אמת

1. לדלל כל cDNA מדגם 1:10 במאגר טה 0.1 x.
2. לחשב את מספר בארות/משכפל עבור כל דגימה. להכין את תערובת התגובה בשפופרת צנטרפוגה עם אמצעי האחסון הבאים עבור כל דגימה, הוספת 10% נפח עודף.
3. להוסיף 4 µL של מים נטולי RNase 10 µL של 2 x מהר מתקדם מאסטר מיקס (טבלה של חומרים), µL סוף סוף 5 של cDNA מדולל.
4. לערבב על-ידי vortexing, בקצרה צנטריפוגה כדי לסובב את התוכן.
5. העברת µL 19 של תערובת התגובה כל טוב, לאטום את הצלחת, בקצרה צנטריפוגה.
6. מבצע פרוטוקול תרמי (טבלה 2) מערכת ה-RT-PCR.

תוצאות

ניתחנו את פאנל של הקשורות אנגיוגנזה miRNAs במחזור ביחס ההישרדות ללא התקדמות המחלה (PFS), הכולל הישרדות (OS) ותגובות האובייקטיבית לדרג (אור) ב mCRC 52 חולים שטופלו עם טי מבוסס-B הערכת סמנים כזה בדגימות הפלסמה הוא מאתגר בשל קשיים טכניים. השתמשנו בשיטות הוקמה לחילוץ miRNA דגימות פלסמה הח?...

Discussion

miRNAs קטנות ללא קידוד RNAs (18-25 נוקלאוטידים אורך) מסוגל מחייב 3' UTR האזור של המטרה שלהם RNA שליח, עיכוב או זה משפיל. הם ובכך ניתן לראות הרגולטורים ביטוי גנים ברמת translational. בעשור האחרון, מספר miRNAs בקורלציה עם סרטן ייזום ופיתוח, גורם אותם סמנים קליניים שימושי לאבחון, פרוגנוזה וטיפול. מוגן על ידי RNases, miRNAs...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes	Eppendorf	0030 123.328
Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes	Eppendorf	0030 123.344
Rnase-free 20 µL tips	Starlab	S1123-1810
Rnase-free 200 µL tips	Starlab	S1120-8810
Rnase-free 1,000 µL tips	Starlab	S1122-1830
mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit	Thermo Fisher	AM1556
TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher	A28007
100% ethanol anidrous ACS grade	Carlo Erba Reagents	414605
2-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
TaqMan Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher	4444558
TaqMan Advanced miRNA Assays	Thermo Fisher	A25576
7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4406984
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1,000 µL laboratory pipettes
Benchtop microcentrifuge
Vortex
Benchtop heating block
Fume hood
0.2 mL PCR tubes