JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול ואת יישומו של מתיל-Seq, פלטפורמה epigenomic, באמצעות מודל עכברוש לזיהוי שינויים epigenetic הקשורים בחשיפה מתח כרוני. תוצאות מדגימים כי פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש הוא מסוגל זיהוי הבדלים מתילציה הנובעים מחשיפה ללחץ אצל חולדות.

Abstract

כפי הגנומים של מגוון רחב יותר של בעלי חיים הופכים לזמינים, אין צורך להגדיל עבור כלים יכול ללכוד שינויים epigenetic דינמיים במודלים של בעלי חיים אלה. העכברוש הוא חיה אחת בדגם המסוים שבו כלי epigenetic יוכלו להשלים לימודי תרופתי והתנהגותיות רבות לספק מידע מכניסטית תובנה. לשם כך, שינינו SureSelect ללכוד מערכת היעד (המכונה מתיל-Seq) את העכברוש, אשר יכול להעריך רמות מתילציה DNA ברחבי הגנום חולדה. העיצוב עכברוש לפלח היזמים, האיים CpG, חופי האי ואזורי GC-עשיר של כל הגנים RefSeq.

כדי ליישם את הפלטפורמה על ניסוי עכברים, חולדות ספראג Dawley זכר נחשפו מתח כרוני משתנה במשך שלושה שבועות, אחרי אשר נאספו דגימות דם להפקת DNA גנומי. מתיל-Seq ספריות נבנו בין דגימות DNA חולדה על ידי הטיה, מתאם מצדו, היעד העשרה, ביסולפאט המרה ריבוב. ספריות היו וסודרו על פלטפורמת הדור הבא רצפי וניתח הקריאות ברצף היו לזהות את DMRs בין ה-DNA של חולדות לחוץ, unstressed. המועמדים המובילים DMRs היו לאימות באופן עצמאי על-ידי ביסולפאט pyrosequencing לאשר את היציבות של פלטפורמת.

תוצאות מדגימים כי פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש הוא כלי שימושי epigenetic ניתן ללכוד מתילציה שינויים המושרה על ידי חשיפה ללחץ.

Introduction

ההתקדמות תפוקה גבוהה רצף הובילו שפע של רצף גנומית עבור דגם והן הלא-דגם אורגניזמים. הזמינות של רצפים כאלה הנחתה את מחקר גנטיקה, גנומיקה השוואתי ו transcriptomics. למשל, רצפים זמינים גנומית שימושיים מאוד עבור יישור נתונים רצף ניסויים שבב-Seq המעשירים DNA בהתבסס על שיוך היסטון שינויים1, או רצף ביסולפאט, אשר מודד מתילציה DNA על-ידי זיהוי אורציל נוצר ביסולפאט המרה של unmethylated cytosines2. עם זאת, היו עיכובים ביישום של פלטפורמות epigenomic משלבות נתונים זמינים רצף גנטי בעיצוב שלהם עקב מחסור בנתוני מוערת של רצפי תקינה ספציפית אשר יכולים להשפיע על תפקוד הגן.

בפרט, מתילציה DNA הוא אחד השינויים epigenetic למדה נרחב ביותר על ה-DNA זה יכול למנף נתונים זמינים גנומית לבניית פלטפורמת methylomic. דוגמה אחת כזו הוא פלטפורמה מבוססת על מערך אנושי methylome3, אשר כבר בשימוש נרחב בתחומים שונים מאונקולוגיה פסיכיאטריה4,5. למרבה הצער, פלטפורמות דומות עבור מודלים בבעלי חיים שאינם בני אדם הם נדירים, שכן ישנם כמעט לא בשימוש נרחב פלטפורמות אשר מנצלים רצף גנומית בעיצוב הראשונית שלהם.

שיטה נפוצה כדי להעריך את הנוף methylomic של מודלים בעלי חיים שאינם בני אדם הוא ייצוג מופחת ביסולפאט רצף (RRBS)6. גישה זו גוברת על העלות של רצף הגנום כולו ביסולפאט זה, תוך מתן נוף מקיף methylomic, מעניק כיסוי לקריאה-עומק נמוך יותר בשל עלות ומידע מוגבל תפקודית באזורים גדולים של ג'ין עלוב של הגנום2 . RRBS כרוך תקציר הגבלת גודל-מבחר של הדנ א כדי להעשיר עבור מאוד עשיר GC רצפים כגון איי CpG נפוץ נמצאו ליד הגן היזמים, חשב לשחק תפקיד בג'ין בתקנה7. ואילו בשיטה RRBS כבר בשימוש מספר מחקרים חשובים, הסתמכותו על אנזימי הגבלה אינה ללא האתגרים הבולטים ומגבלות. למשל, העשרה של רצפי GC-עשיר RRBS תלויה לחלוטין הנוכחות של רצפים ספציפיים מזוהה על-ידי אנזים הגבלה ובחירת גודל הבאים על ידי אלקטרופורזה. משמעות הדבר היא כי כל האזורים גנומית שאינן מכילות באתרים מגבלת אלה אינם נכללים בעת בחירת גודל. בנוסף, השוואות בין-המינים מאתגרת אלא אם באתרים מגבלת באותו קיימים לוקוסים אותו בין מינים שונים.

גישה אחת כדי להתגבר על המגבלות של RRBS היא להשתמש בשיטת העשרה מנצל רצף גנומית שפורסמו בעיצוב של הפלטפורמה. הפלטפורמה המבוססת על מערך אנושי משתמש הגששים פריימר מתוכנן נגד סחורות ארוזות לצרכן ספציפי להארכת אלל ספציפי (CG לעומת TG לאחר ההמרה ביסולפאט) המטרה חישול, פריימר. העיצוב משקף את רצף גנומית האנושי זמין, לא רק אזורים תקינה תבדוק-השפעול שנרכש שורות מרובות של חקירה, כמו קידוד ו- ENSEMBL8. למרות השימוש רחב בחקירות methylomic האנושי, פלטפורמה דומה אינו קיים מודל בעלי חיים. בנוסף, תבנית המבוססת על מערך המקומות אילוץ משמעותית על שטח זמין עבור מיקום המכשיר. מספר השנים האחרונות, נעשו מאמצים כדי לשלב למטרה-הייחודית המוענקת על ידי לכידת המכשיר ועיצוב התכונה תפוקה גבוהה של הדור הבא רצפי. כזה הביא במערכת העשרה היעד המבוסס על רצף הגנום העכבר (עכבר מתיל-Seq), אשר שימש כדי לזהות הבדלים ספציפיים במוח או glucocorticoid-induced מתילציה9,10. פלטפורמות דומות אחרות דגם וחיות -דגם נחוצים כדי להקל על epigenomic מחקר בבעלי חיים אלה.

. הנה, נדגים את היישום של פלטפורמה חדשנית זו לערוך ניתוח methylomic על החולדה. העכברוש שימש מודל חיה חשוב פרמקולוגיה, חילוף החומרים, neuroendocrinology, ובאופן הפעולה. לדוגמה, יש צורך להגדיל כדי להבין את המנגנונים שבבסיס כי להצמיח רעילות התרופה, השמנת יתר, תגובת המתח או התמכרות לסמים. פלטפורמה תפוקה גבוהה מסוגלת ללכוד methylomic שינויים הקשורים עם התנאים הללו יגביר את ההבנה שלנו של המנגנונים. מאז הגנום העכברוש חסר עדיין ביאור לאזורים רגולטוריות, אנחנו היזמים לא יתיר, האיים CpG, חופי האי11והחלה זוהו בעבר GC-עשיר רצפים לתוך העכברוש מתיל-Seq פלטפורמה12.

כדי להעריך עיצוב מוצלח ויישום של הפלטפורמה SureSelect היעד העשרה (המכונה כללי מתיל-Seq) הגנום עכברוש, אנחנו מועסקים מודל עכברוש של מתח כרוני משתנה (CVS)13 כדי לזהות באופן שונה מפוגל אזורים בין בעלי חיים unstressed, ולחוצה. פלטפורמה העיצוב שלנו, פרוטוקול, והיישום עשויה להיות שימושית עבור חוקרים מי עשוי לרצות לנהל חקירה epigenetic מוטים ומקיף על אורגניזם רצף גנומית של מי שכבר זמין אך נשאר גרוע המבואר.

Protocol

כל הניסויים הושלמו ב בהתאם ותאימות עם כל רגולציה ומוסדיים הנחיות הרלוונטיים, כולל טיפול בעלי חיים מוסדיים, ועד שימוש ג'ונס הופקינס הספר לרפואה של.

1. בעלי חיים

  1. להשיג זכר חולדות ספראג-Dawley גיל ההתבגרות-גיל 4 שבועות. בית החיות בכלובים עכברוש פוליקרבונט בחום- ולספק והלחות מבוקרים חדר במחזור 12 שעות אור, 12 h כהה עם תחילת האור בשעה 0600 ה החיות עם ad libitum גישה למים.
  2. לאפשר חולדות להסתגלות במשך שבוע להפחית את הלחץ הקשורים עם תחבורה. זוג-בית החיות (N = 16) כדי למנוע מתח בידוד, ולהתחיל רוב בגיל 5 שבועות, המשתנה כרונית להדגיש משטר (CVS) למשך 3 שבועות.

2. כרוני מתח משתנה

  1. לנהל את משטר CVS פעם אחת בבוקר (9-11 בבוקר), פעם אחת בצהריים (1-3 PM) בזמנים לא סדיר כדי לשמור את השגרה בלתי צפויות. לשלב לילה לחצים מתון. CVS הטיפול כולל: h 1) 3 ב גליל איפוק; 2) לשחות 10 דקות; כלוב h 3) 3 להטות 4) איטי רועד פלטפורמה; 1 h ו- 5) h 1 בחדר הקר 4 ° C.
    הערה: לחצים לילה כוללים חברתית הצפיפות (5 לכל כלוב), בידוד חברתי, מצעים רטובים, הגבלת מזון, אורות דולקים. לוח זמנים שבועי טיפוסי של משטר מתח ניתנת טבלה 1.

3. האנדוקרינית מבחני

  1. לקבוע רמות של corticosterone (קורט) באמצעות הזנב דם (~ 50 מ"ל) samplings שנאספו באותו זמן (9 בבוקר) פעמיים בשבוע לאורך כל הניסוי, לפני CVS משטר כדי ליצור רמות ההורמונים בסיסית (יום 0), פעם אחת באמצע CVS שבועי (ימים 4,11, ו 18), לאחר כל 7 ימים של CVS (7 ימים ו- 14), ולא בסיום CVS (21 יום). לאסוף דגימות דם לפני הטיפול סטרס יומי.
    1. לאסוף דגימת דם הסופי המטען אחד במהלך המתת חסד (25 יום) עבור ריה והפקת הדנ א הגנומי.
  2. Centrifuge כל דגימות דם (x 600 גרם, 4 ° C, 10 דקות) כדי להפריד בין הפלזמה לבין תאי הדם. Pipet החוצה הפלזמה (תגובת שיקוע) ולאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
  3. הפשרת ולהשתמש הפלזמה כדי לקבוע רמות קורט על ידי רדיו אימונולוגי (RIA). ודא כי 3 בשבוע פלזמה קורט רמות גבוהות את החיות לחוץ כדי לאמת את החוסן של משטר מתח.

4. התנהגות

  1. לאחר הטיפול CVS (ימים 23 – 24), להעריך כל חיה על התנהגות כמו חרדה גבוהות פלוס מבוך (EPM)14.
  2. באמצעות מצלמת וידאו, שיא החיות על המנגנון EPM עבור 300 s והניקוד הזמן בילה במרכז, סגור את הזרועות, בזרועות פתוחות.

5. עיצוב של מתיל-Seq העכברוש

  1. באמצעות הדפדפן הגנום UCSC, להשיג את הציון גנומית יתירים (חולדה הרכבה rn4 נובמבר 2004) CpG האיים, חופי האי (± 1 kb איגוף CpG האיים), היזמים (± 1 kb של כל TSS) של כל הגן RefSeq, רצפים אחרים שעשויים להיות זמינים מן בספרות הרלוונטית.
    הערה: את העכברוש מתיל-Seq, רצפים נוספים GC-עשיר של פלטפורמה מבוססת על מערך מתילציה הקודם נוספה12. עבור אזורים גדול מ- 5 קילו, היו מתחלפים מחוזות 500 bps לטעום ואחריו 1 kbps, זה דילג. עיצוב מתיל-Seq עכברוש הסופי מורכב Mbps 111, סחורות: ארוזות לצרכן 2.3 מיליון; והגודל של אזור ממוצע של 594 bps. מטרות לוקוסים ייחודי 228,800.
  2. הזן רשימה של קואורדינטות גנומית הידור לתוך יעד זמין מסחרית לכידת עיצוב תוכנה עיצוב המכשיר המתאים.

6. בניית הספרייה מתיל-Seq העכברוש מ- DNA גנומי

הערה: כדי למנוע תופעות אצווה, תהליך דגימות מרובים בו זמנית, ולמדרג את תערובות מאסטר בהתאם. תמצית הדנ א באמצעות ערכת חילוץ DNA זמינים מסחרית. עמודה או משקעים מבוססות שיטות הן תשואות דנ א גנומי באיכות גבוהה (יחס 260/280 ~ 1.8). השימוש בשיטות מבוסס-פנול אינם מומלצים. Elute או resuspend DNA במאגר טה נמוך (10 מ מ טה, 0.1 מ מ EDTA, pH 8.0).

  1. הכנת הדוגמא
    הערה: על כל צעד באמצעות DNA-איגוד beads מגנטי, ודא החרוזים שאמבטיה לטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות מערבבים היטב לפני השימוש.
    1. הטיית ה-DNA
      1. השתמש fluorometer כדי לקבוע הראשונית כפול גדילי DNA ריכוז כל דגימה. לדלל > 1 µg של gDNA כדי µL 50 עם מאגר טה נמוך (10 מ מ טה, 0.1 מ מ EDTA, pH 8.0) נמוך מחייב DNA microcentrifuge צינורות.
      2. להטיה דוגמאות שימוש של sonicator איזותרמי (10% מחזור, בעוצמה 5, 200 מחזורים לכל פרץ, 6 מחזורים של 60 s, תדירות גורף, 4 ° C).
      3. להעריך את האיכות של ה-DNA באמצעות מערכת מבוססת אלקטרופורזה המודד DNA הגודל והכמות.
        הערה: כמות ה-DNA מומלץ הוא 1 µg, או 3 µg. אם יש מוגבלת החל חומר, על הסכום הנמוך ביותר הקלט להיות > 500 ng, כמו כמויות נמוכות לרעה ישפיעו על כמות ואיכות ספריות שנוצר.
    2. תיקון קצוות הדנ א.
      1. להשתמש העכברוש מתיל-Seq קיט להכנת המיקס סוף-תיקון מאסטר על קרח. להוסיף µL 52 של שילוב כל דגימה, דגירה ב הצנטרפוגה תרמי ללא מכסה מחוממת (20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, להחזיק 4 ° C).
        סיום-תיקון מיקס מאסטר (לפי דוגמה):
        35.2 µL של מים
        µL 10 סיום תיקון מאגר (10 x)
        µL 1.6 של dNTP מיקס
        1 µL של T4 DNA פולימראז
        2 µL של Klenow DNA פולימראז
        µL 2.2 של T4 Polynucleotide קינאז
      2. לטהר דגימות באמצעות 180 µL של DNA מחייב beads מגנטי ו- 400 µL של אתנול 70% שזה עתה הוכנו עבור דגימה. להוסיף כל מדגם µL 180 של חרוזים, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. גלולה חרוזים, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב 200 µL של 70% אתנול. הסר אתנול וחזור לשטוף פעם אחת.
      3. השתמש צלחת מגנטית הצניפה חרוזים ולהסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר. יבש ב 37 ° C heatblock למשך 3-5 דקות עד בגדר חרוז לגמרי יבש. Resuspend ב µL 44 של מים נטולי נוקלאז ולאסוף כ 42 µL של תגובת שיקוע.
        לנקודת עצירה: אחרי תיקון ה-DNA, יכול להיות אטום ודוגמאות המאוחסנים ב-20 ° C.
    3. אדנילאט 3' מסתיים.
      1. להכין תערובת Adenylation מאסטר על קרח. להוסיף תערובת µL 9 כל דגימה, דגירה ב הצנטרפוגה תרמי ללא מכסה מחוממת (37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, להחזיק 4 ° C).
        מיקס מאסטר Adenylation (לפי דוגמה):
        µL 5 מאגר Klenow
        1 µL של dATP
        3 µL של Klenow DNA פולימראז
      2. לטהר דוגמאות שימוש µL 90 של DNA מחייב beads מגנטי ו- 400 µL של אתנול 70% שזה עתה הוכנו עבור דגימה. להוסיף כל מדגם µL 90 של חרוזים, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. גלולה חרוזים, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב 200 µL של 70% אתנול. הסר אתנול וחזור לשטוף פעם אחת.
      3. השתמש צלחת מגנטית הצניפה חרוזים ולהסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר. יבש ב 37 ° C heatblock למשך 3-5 דקות עד בגדר חרוז לגמרי יבש. Resuspend ב 35 µL של מים נטולי נוקלאז ולאסוף כ- 33.5 µL של תגובת שיקוע.
    4. מאתרים ומפסיקים את המתאם מפוגל.
      1. להכין תערובת מאסטר מצדו על קרח ולהוסיף 16.5 µL של שילוב כל דגימה. דגירה ב הצנטרפוגה תרמי ללא מכסה מחוממת (20 ° C למשך 15 דקות, להחזיק 4 ° C).
        מיקס מאסטר מצדו (לפי דוגמה):
        2.5 µL של מים
        2.5 µL של מתיל-Seq מפוגל מתאם
        µL 10 T4 DNA ליגאז מאגר (5 x)
        µL 1.5 של T4 DNA ליגאז
      2. לטהר דוגמאות שימוש µL 90 של DNA מחייב beads מגנטי ו- 400 µL של אתנול 70% שזה עתה הוכנו עבור דגימה. להוסיף כל מדגם µL 90 של חרוזים, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. גלולה חרוזים, להסיר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend צנפה ב 200 µL של 70% אתנול. הסר אתנול וחזור לשטוף פעם אחת.
      3. השתמש צלחת מגנטית הצניפה חרוזים ולהסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר. יבש ב 37 ° C heatblock למשך 3-5 דקות עד בגדר חרוז לגמרי יבש. Resuspend ב 22 µL של מים נטולי נוקלאז ולאסוף כ 22 µL של תגובת שיקוע. להעריך איכות שימוש של bioanalyzer.
        הערה: אם הסכום הכולל של ה-DNA הוא פחות מ-500 ng, הטיה ותהליך נוספים DNA לפני שתמשיך עם והשלבים הבאים. אם הגודל הממוצע של ה-DNA אינו מעלה על ידי יותר מ 30 bps, בדוק כדי לוודא כי ריאגנטים הם חדשים, כמו T4 DNA פולימראז, Klenow, ו/או T4 ליגאז עשוי להיות זקן.
        לנקודת עצירה: לאחר נבדק המתאם מפוגל, יכול להיות אטום ודוגמאות המאוחסנים ב-20 ° C.
  2. הכלאה
    1. העברת דגימות נמוך צינורות microcentrifuge DNA-איגוד ולהשתמש concentrator ואקום מחומם כדי לצמצם את נפח דגימה פחות מ 3.4 µL. לשקם דגימות 3.4 µL.
      הערה: רכז הדוגמאות כדי כ ~ 3 µL כדי להבטיח דגימות יוסרו מיכשור לפני כל הנוזל מתאדה.
    2. להכין מאגר הכלאה בטמפרטורת החדר, מתיל-Seq תערובת בלוק על קרח. להוסיף 5.6 µL של מתיל-Seq בלוק לערבב כל דגימה, דגירה ב הצנטרפוגה תרמי (95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, להחזיק 65 ° C).
      מאגר הכלאה (לפי דוגמה):
      µL 6.63 של מתיל-Seq Hyb 1
      µL 0.27 של מתיל-Seq Hyb 2
      µL 2.65 של מתיל-Seq Hyb 3
      µL 3.45 של מתיל-Seq Hyb 4
      מתיל-Seq לערבב בלוק (לפי דוגמה):
      2.5 µL של מתיל-Seq אינדקס בלוק 1
      2.5 µL של מתיל-Seq בלוק 2
      µL 0.6 של מתיל-Seq גוש 3
    3. להכין תערובת בלוק RNase המיקס הכלאה ספריית ללכוד. להוסיף 20 µL של מיקס הכלאה של ספריית ללכוד כל דגימה, דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך לפחות 16 h.
      RNase לערבב בלוק (לפי דוגמה):
      µL 0.5 RNase בלוק
      µL 1.5 של מים
      ללכוד את ספריית הכלאה מיקס (לפי דוגמה):
      µL 13 הכלאה המאגר
      2 µL של RNase לחסום מיקס
      5 µL של עכברוש מתיל-Seq ללכוד את הספרייה
      הערה: להשאיר תגובות ב 65 ° C בעת הוספת הכלאה לערבב כדי למנוע מחייב שאינם ספציפיים.
    4. 50 µL aliquot של streptavidin beads מגנטי עבור דגימה לתוך צינור 8-באר החשפנות. רחץ חרוזים עם 200 µL מתיל-Seq מחייב המאגר. השתמש צלחת מגנטית הצניפה חרוזים ולהסיר תגובת שיקוע בין כל כביסה עבור סכום כולל של 3 מנקי. לאחר השטיפה הסופית resuspend streptavidin חרוזים ב 200 µL מתיל-Seq מחייב המאגר.
    5. להוסיף דוגמאות µL 200 של חרוזים streptavidin שטף מגנטי, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות באמצעות מערבל מסתובב. תוך כדי ערבוב, aliquot µL 200 של מתיל-Seq שטיפת מאגר 2 לתוך בארות triplicate של צלחת 96-ובכן לכל דגימה, מקומו הצנטרפוגה תרמית כדי לחמם עד 65 ° C.
    6. לאחר דגירה, גלולה beads מגנטי streptavidin באמצעות לוח מגנטי, resuspend את החרוזים ב 200 µL מתיל-Seq שטיפת מאגר 1. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. להשתמש צלחת מגנטית הצניפה ולמחוק את תגובת שיקוע.
    7. לשטוף חרוזים 3 פעמים עם מתיל-Seq לשטוף מאגר 2: resuspend צנפה חרוז ב 200 µL של המאגר לשטוף 2 (טרום חימם בשלב 6.2.5.), דגירה חרוזי הצנטרפוגה תרמי (65 ° C, 10 דקות), גלולה חרוזים. למחוק את תגובת שיקוע לשטוף אחרי זה באמצעות צלחת מגנטית.
      הערה: לשמור על הכלאה תגובות ב 65 ° C בעת הוספת 2 מאגר לשטוף כדי למנוע מחייב שאינם ספציפיים.
    8. להוסיף 20 µL מתיל-Seq • תנאי המאגר החרוזים שטף, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות שימוש צלחת מגנטית צניפה חרוזים, העברת supernatant צינור רצועת. למחוק את החרוזים.
      הערה: בעת המקננת, להכין ריאגנט המרה ביסולפאט.
  3. המרה ביסולפאט
    הערה: לבצע המרה ביסולפאט של ssDNA eluted בעזרת ריאגנטים המתאימים והוראות ערכה המרה ביסולפאט זמין מסחרית.
    1. להוסיף 130 µL ביסולפאט מוכן ההמרה מגיב תגובת שיקוע מהשלב הקודם. לחלק אחד של תגובות µL 150 באופן שווה לתוך שתי בארות. דגירה ב הצנטרפוגה תרמי (64 ° C עבור 2.5 h, להחזיק 4 ° C).
      הערה: התגובה 150 µL מחולק באופן שווה שתי בארות נפרד כדי להבטיח טמפרטורה הומוגנית. לאחר המקננת עבור 2.5 h, ומיד להמשיך לשלב הבא.
    2. לאגד דגימות ספין עמודות על-ידי הוספת µL 600 מאגר מחייב ולשטוף פעם עם 100 µL שטיפת המאגר. צנטריפוגה עמודות (15,000 x g, 1 דקות) בין כל השלבים המרה ביסולפאט ולמחוק את הזרימה.
    3. דוגמאות Desulphonate על-ידי הוספת µL 200 Desulphonation מאגר לעמודות. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15-20 דקות חוזר צנטריפוגה ולמחוק את הזרימה.
    4. רחץ עמודות פעמיים עם 200 µL מאגר לשטוף. Elute כל דגימה על-ידי הוספת 10 µL מאגר • תנאי לעמודה, המקננת למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, ואני צריך שתוציאו (15,000 x g, 1 דקות). חזור על שלב • תנאי עבור סכום כולל של 20 µL.
    5. להכין את תגובת ה-PCR מאסטר לערבב 1 על קרח. להוסיף µL 82 של שילוב כל דגימה. דגירה ב הצנטרפוגה תרמי עם התוכנית הבאה.
      PCR התגובה מאסטר לערבב 1 (לפי דוגמה):
      30 µL של מים
      µL 50 של מתיל-Seq PCR מיקס מאסטר
      1 µL של מתיל-Seq PCR1 תחל F
      1 µL של מתיל-Seq PCR1 תחל R
      תוכנית הצנטרפוגה תרמי:
      שלב 1, מחזור 1: 95 ° C 2 דקות
      שלב 2, 8 מחזורים: s 95 ° C 30, 60 ° צלזיוס 30 s, s 72 ° C 30
      שלב 3, מחזור 1: 72 ° C 7 דקות
      שלב 4, מחזור 1: 4 ° C החזק
    6. לטהר דגימות באמצעות 180 µL של DNA מחייב beads מגנטי ו- 400 µL של אתנול 70% שזה עתה הוכנו עבור דגימה. להוסיף כל מדגם µL 180 של חרוזים, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. גלולה חרוזים, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב 200 µL של 70% אתנול. הסר אתנול וחזור לשטוף פעם אחת.
    7. השתמש צלחת מגנטית הצניפה חרוזים ולהסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר. יבש ב 37 ° C heatblock למשך 3-5 דקות עד בגדר חרוז לגמרי יבש. Resuspend ב- 21 µL של מים נטולי נוקלאז ולאסוף כ 19.5 µL של תגובת שיקוע.
  4. יצירת האינדקסים
    1. להכין את תגובת ה-PCR 2 מיקס מאסטר על קרח. להוסיף 25.5 µL 2 מיקס מאסטר כדי כל דגימה. מוסיפים 5 µL מסחרי אינדקס תחל כדי דוגמאות בודדות, דגירה ב הצנטרפוגה תרמי.
      PCR התגובה מאסטר לערבב 2 (לפי דוגמה):
      25 µL מתיל-Seq PCR מיקס מאסטר
      פריימר אינדקס משותף מתיל-Seq 0.5 µL
      תוכנית הצנטרפוגה תרמי:
      שלב 1, מחזור 1: 95 ° C 2 דקות
      שלב 2, 6 מחזורים: s 95 ° C 30, 60 ° צלזיוס 30 s, s 72 ° C 30
      שלב 3, מחזור 1: 72 ° C 7 דקות
      שלב 4, מחזור 1: 4 ° C החזק
      הערה: מחזורים נוספים (2-3) עשוי להיות נחוץ אם ריכוז הדנ א ההתחלתי הוא מתחת ערכים מומלצים.
    2. לטהר דוגמאות שימוש µL 90 של DNA מחייב beads מגנטי ו- 400 µL של אתנול 70% שזה עתה הוכנו עבור דגימה. להוסיף כל מדגם µL 90 של חרוזים, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. גלולה חרוזים, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב 200 µL של 70% אתנול. הסר אתנול וחזור לשטוף פעם אחת.
    3. השתמש צלחת מגנטית הצניפה חרוזים ולהסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר. יבש ב 37 ° C heatblock למשך 3-5 דקות עד בגדר חרוז לגמרי יבש. Resuspend ב 24 µL של מים נטולי נוקלאז ולאסוף כ 24 µL של תגובת שיקוע.
    4. להעריך ריכוז וגודל bp בעזרת ריאגנטים זיהוי ה-DNA של רגישות גבוהה bioanalyzer.
      הערה: אם bioanalyzer יצליח לזהות הנוכחות של ספריית ה-DNA, חזור על השלבים הכנה עם ה-DNA נוספים.
      נקודת עצירה: לאחר טיהור, אינדקס עשוי להיות אטום ודוגמאות המאוחסנים ב-20 ° C.
    5. איגוד דוגמאות עבור הפלטפורמה המתאימה הדור הבא רצפי בשימוש.
      1. באמצעות ריכוז הנתונים bioanalyzer, הקובע molarity DNA בהתבסס על גודל הספרייה וכמות בנפח נתון, לדלל עם מאגר טה נמוך (6.1.1.1) ולשלב את כל הדגימות כדי ריכוז סופי של 15 pM.
        הערה: שיטה רגישה יותר לכמת את הספרייה היא PCR כמותי בזמן אמת באמצעות תחל שכוונו המתאמים מחוברים.
      2. להפעיל את הדגימות במאגר על מספר מסלולים שמספיקות בשביל 4 דוגמאות לכל בנתיב ברצף הדור הבא.
        הערה: למשל, אם 16 ספריית דוגמיות יש כבר באופן ייחודי באינדקס, בשילוב, הפעל הספריות מעל 4 נתיבים, שקול ל- 4 דוגמאות לכל ליין.

7. קביעת רצף על ברצף הדור הבא

  1. לשלוח את הדגימות הליבה רצף מוסדיים עבור קיבוץ באשכולות של הספרייה מתיל-Seq, ואחריו רצף על מכונה הדור הבא רצפי.

8. ניתוח לזיהוי DMRs

  1. ליישם ביסמרק15, אשר מפעיל את עניבת הפרפר 2.0 כמו רצף פנימי aligner16,17, ליישור קריאות קלט גולמי כדי הגנום המרה ביסולפאט, פלוס-strand. בעקבות יישור, השתמש את Bismark_methylation_extractor כדי לבצע בקרת איכות ולהקצות ערך מתילציה מוערך כל CpG.
  2. צור רשימה של DMRs עם חבילת BS-Seq18 ב Bioconductor. מסנן DMRs מבוססים על גדול מ- 3 ברציפות סחורות ארוזות לצרכן, לבין ערך-P < 0.05.
    הערה: ליצור רשימה DMR הכולל קואורדינטות גנומית, מרחק אל הגן RefSeq הקרובה, מספר סחורות ארוזות לצרכן בתוך כל DMR, % ממוצע CpG ערך מתילציה לרוחב DMR עבור השוואה שתי הקבוצות (למשל, הדגיש לעומת unstressed), ערך P, ו הערך רוזוולט (שיעור גילוי שקר). השתמש ברשימה DMR, כלומר., קואורדינטות גנומית, לעצב pyrosequencing תחל עבור אימות.

9. אימות על-ידי ביסולפאט Pyrosequencing

  1. העיצוב תחל
    1. עיצוב צבעי יסוד ביסולפאט PCR ו- pyrosequencing. עיצוב שתי ערכות של PCR תחל (בחוץ, מקוננים) כך ה-PCR מקוננים יגביר bps 150-400 של DMR.
      הערה: באופן כללי, תחל מעוצב הם בסיסים לפחות 24 ארוך לפחות 4-5 לא רציף של G (מה. C עבור ומהצמיגים הפוכה) לחשבון עבור מופחתת חישול טמפרטורה מפני אובדן של רצף מורכבות. לאחד תחל מקוננים יהיו התווית על-ידי ביוטין, מטוהרים-HPLC. עם זאת, תחל רגיל אמורה להיות מסודרת הראשון כדי למטב את השלב ה-PCR על-ידי פענוח התגובות ג'ל agarose.
      1. עיצוב pyrosequencing assay תחל כך מטרות biotinylated משלימים את לנטישה של רק 1 – 2 בסיסים במעלה הזרם של סחורות ארוזות לצרכן כדי להיות לבדיקה. עיצוב תחל pyrosequencing מרובים לפי הצורך, כמו כל פריימר pyrosequencing יכול באופן אמין assay 30 bps במורד הזרם.
    2. Rt1-m4, השתמש הבאות:
      rRT1M4 בחוץ – F TGTAYGATTTTGGTTATYGTAAAT
      rRT1M4 בחוץ – R AACTTACAAATTTCACCAACTCA
      rRT1M4 מקונן – F GTGGGTTAYGTGGATAATATATAG
      rRT1M4 מקונן – R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTA
      rRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGAT
      rRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAG
      rRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGAT
      rRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT
  2. להשתמש ערכת זמין מסחרית ביסולפאט המרה של עכברוש דם gDNA.
    הערה: השלבים המרה ביסולפאט הותאמו הערכה זמין מסחרית עם השינויים הבאים: בשלב 1, להוסיף 50 – 100 ננוגרם של דם gDNA ו לדלל עם מים כדי 20 µL. בשלב 9, elute µL 20 לדגימה.
    1. להכין ביסולפאט ריאגנט ההמרה לפי הפרוטוקול של היצרן ומשלבים עם gDNA מדולל. דגירה ב הצנטרפוגה תרמי (64 ° C עבור 2.5 h, להחזיק 4 ° C).
    2. להוסיף מאגר איגוד gDNA שהומר ספין עמודות, צנטריפוגה (15,000 x g, 1 דקות). עמודות לשטוף פעם אחת לאחר מכן להוסיף מאגר Desulphonation העמודות, תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה (15,000 x g, 1 דקות).
    3. רחץ עמודה עם מאגר לשטוף, צנטריפוגה (15,000 x g, 1 דקות). חזור על שלב לשטוף עם צנטריפוגה (15,000 x g, 2 דקות). להוסיף 20 µL • תנאי מאגר, צנטריפוגה (15,000 x g, 1 דקות) כדי elute.
  3. PCR-הגברה
    1. להכין מיקס מאסטר PCR מבחוץ. להוסיף 21.5 µL של מיקס מאסטר gDNA ביסולפאט המרה ל- 3.5 µL ולהפעיל תוכנית הצנטרפוגה תרמי.
      מיקס מאסטר PCR מבחוץ:
      µL 16.25 מים
      2.5 µL פולימראז מאגר [10 x]
      µL 0.5 של dNTP [10 מ מ
      1 µL של פריימר לפנים [מיקרומטר 0.1]
      1 µL של פריימר הפוכה [מיקרומטר 0.1]
      µL 0.25 של הדנ א. אנזימים [5000 U/mL].
      תוכנית הצנטרפוגה תרמי:
      שלב 1, מחזור 1: 94 ° C 4 דקות
      שלב 2, מחזורי 47: 94 ° C 1 דקות, 53 ° C 30 s, 72 ° C 1 דקות
      שלב 3, מחזור 1: 72 מעלות 8 דקות, 4 ° C החזק
    2. להכין מיקס מאסטר PCR מקוננים. להוסיף µL 23 של מיקס מאסטר µL 2 מדגם מתוך ה-PCR מחוץ וחזור התוכנית הצנטרפוגה תרמי PCR מבחוץ. להעריך PCR איכות המוצר באמצעות אלקטרופורזה בג'ל (1 מאגר x TAE, agarose 1% ג'ל).
      מיקס מאסטר PCR מקונן:
      17.75 µL של מים
      2.5 µL פולימראז מאגר [10 x]
      µL 0.5 של dNTP [10 מ מ
      1 µL של פריימר לפנים [מיקרומטר 0.1]
      1 µL של פריימר הפוכה [מיקרומטר 0.1]
      µL 0.25 של הדנ א. אנזימים [5000 U/mL]
      הערה: עבור PCR מקוננים, פארווערטס או פריימר הפוך את חייב להיות biotinylated.
  4. Pyrosequencing
    1. להפוך את תערובת הבסיס המכיל µL 38 מאגר מחייב 35 µL של מים, 2 µL של חרוזים מצופים streptavidin sepharose עבור דגימה. בצלחת 96-ובכן, להוסיף µL 75 של מיקס מאסטר ו µL 5 של מוצר ה-PCR מקוננים. ללחוץ על צלחת מטרף למשך 15-60 דקות.
    2. בעת טלטולים, להוסיף µL 12 של פריימר (0.5 מיקרומטר, מאגר מחזק מדולל ב) לתוך הבארות של צלחת assay pyrosequencing.
    3. לאחר טלטולים, לבצע שטיפת השלבים באמצעות איגוד התגובה שטיפת מאגרים. מניחים בכלי ואקום שוקת מלא במים ולאחר מכן לאסוף דגימות של צלחת. להטביע כלי ואקום מלא למחצה שקתות המכיל 70% אתנול NaOH (0.2 מ'), טריס אצטט מאגר (10 מ"מ, pH 7.4). נתק ואקום ומקום בכלי ואקום בצלחת assay HS להעביר את החרוזים.
    4. מניחים צלחת על חום בלוק, דגירה ב 80 ° C עבור 2 דק אפשר צלחת להתקרר למשך 5 דקות ולאחר מכן להתחיל pyro התוכנית.

תוצאות

הטמעה מוצלחת של פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש תלוי מספר קריטריונים. איור 1 מציג את זרימת העבודה הכוללת של המחקר וסימונים צעדים ספציפיים בקרת איכות (QC) הנדרשים לפני שתתקדמו. אחד הגורמים הראשון שיש לקחת בחשבון הוא החוסן של המודל בעלי חיים, משטר מתח, הקובעות את סדר הגודל של שינויים epigenetic המתרחשות על-פני methylome. מאז עבודתנו בעלי חיים מותנה בהשלמת שלנו התצפית הקודם כי חשיפה corticosterone (קורט) יכול להוביל שינויים ב- DNA מתילציה19,20, משטר מתח כרוני משתנה (CVS) שלנו צריכה להיות של התאבנות מספיק כדי לייצר הדגיש חולדות עם רמות מוגברות פלזמה קורט. משטר CVS שבועי טיפוסי שמוצג בטבלה 1 , כללה לחצים יומית בבוקר, אחר הצהריים, בן לילה את זה כל הזמן משתנות כדי למנוע habituation ונחלשו תגובת המתח. לאורך כל הטיפול 3 שבועות, החיות לחוץ הציג רמות גבוהות באופן משמעותי של רשע פלזמה קורט [ימים 4 – 21, לשלוט: 32.7 3.7 ננוגרם למ"ל, מתח: 103.0 11.9 ng/mL (כלומר SEM), P = 2.2 x 10-4, איור 2 א] על אלו של unstressed, לשלוט בבעלי חיים. באופן עקבי, החיות האלה גם הראו התנהגות כמו חרדה גדולה יותר גבוהות פלוס מבוך (EPM), כפי שמציין את הזמן באופן משמעותי יותר בזרועות סגור של EPM ופחות זמן בזרועות פתוחות (איור 2B). תוצאות אלו מדגימים כי החשיפה CVS הוביל אנדוקרינית משמעותיים ושינויי התנהגות, מוביל אותנו לחקור אם שינויים אלה היו קשורים עם חתימות מתילציה DNA ספציפיים.

אנחנו מדגישים מספר מחסומים המהווים מכרעת לבנייה מוצלחת של הספרייה מתיל-Seq. החל בכמות מספקת של ה-DNA הוא הכרחי, sonication, מרובים כביסה/טיהור, היעד העשרה, ביסולפאט המרה צעדים במרוכז להפחית את כמות ה-DNA בספריה סיים. למרות מספר שלבים הגברה PCR להקל על האובדן של תבנית ה-DNA, מספרי מחזור PCR מופרז יכול להציג את קריאות כפולים גבוה יותר. לצורך המחקר הנוכחי עכברוש מתיל-Seq, שימש 2 גר' gDNA דם לכל חולדה. נציין כי ספריות מתיל-Seq יכולה להתבצע באמצעות המתחילים כמות הדנ א 500 ng. מתחיל קטן יותר חומר מאפשר למשתמשים ליצור ספריות מ- DNA מבודדת על ידי FACS (תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון) או מחט אגרופים, למרות שיש סיכון מוגבר לייצר כמות לא מספקת של ספריות עבור רצף עוקבות. QC מתבצע על ידי אלקטרופורזה של 1 ליטר של המדגם על bioanalyzer, אשר מספק DNA משקל מולקולרי, כמות, ו molarity. שלושה שלבים קריטיים הדורשים את השימוש bioanalyzer הם: 1) בעקבות sonication צעד כדי להבטיח מספיק הטיה של DNA (~ 170 bp, אדום, איור 3); 2) בעקבות צעד מצדו מתאם שצוין על-ידי שינוי בגודל ממוצעת של ה-DNA הוטו (~ 200 bp, כחול, איור 3) כדי להבטיח שלהם הגברה עוקבות מאת PCR; ו 3) בעקבות ספריה הסופי שלב טיהור כדי להבטיח את הכמות והגודל של הספרייה רצף.

R-החבילות של BSSeq BSmooth ב Bioconductor שימשו לניתוח ביסולפאט את רצף נתונים18. החדרים כוללים כלים ושיטות ליישור קוראת את רצף, ביצוע בקרת איכות, זיהוי באופן שונה מפוגל אזורים (DMRs). תוכנה BSmooth הפעלת עניבת הפרפר 2.016,17 כמו רצף פנימי aligner להשיג CpG ברמת מדידה סיכומים על ידי יישור של קריאות קלט גולמי כדי המרה ביסולפאט רצף גנומית. קריאות מיושר ואז מסוננים דרך הליכי בקרת איכות קפדנית המבקשים לזהות רצף שיטתית ושגיאות בסיס-טלפון עשויים להטות ניתוחים במורד הזרם. סדרה של חלקות נוצרות באופן חזותי לסייע בתהליך זה של סינון. מדדי רצף נוצרים גם למידע רלבנטי המסמך, כגון מספר הקריאות מיושר, היעד %, ולפי CpG כיסוי, בין היתר (טבלה 2). לאחר הנתונים מסוננים, באלגוריתם החלקה/נורמליזציה מבוצעת, איפה כל CpG מוקצה ערך מתילציה המשוערת בהתבסס על QC כל קורא מתוך כל דגימה, הערכות מגבולות סחורות ארוזות לצרכן כדי להבטיח קוראים מדויקת יותר של מתילציה מצב אפילו במקרים בהם רצף כיסוי נמוך. ערך זה מספק הערכה מוחלקים של ההסתברות של מתילציה בכל אתר CpG. על ידי השוואת הממוצע של ההערכות מוחלקים מתילציה של כל מדגם בין שתי קבוצות טיפול לבין אזורים גנומית הדירוג מ המעט שונה באופן משמעותי ביותר, נוצרת רשימה של DMRs (טבלה 3).

העליון ש-DMR בין קבוצות לחוץ, unstressed היה ממוקם האמרגן של הגן histocompatibility הגדולות עכברוש Rt1-m4, עם הדגיש חיות מפגין רמות גבוהות יותר של מתילציה מעבר סחורות ארוזות לצרכן כל מבהמות unstressed (איור 4A). כדי לוודא את יישום מוצלח של פלטפורמת מתיל-Seq וניתוח נתונים, תוכננו primers נגד DMR, רמות מתילציה של הדנ א בדם במדגם כולו מתוח, unstressed בעלי חיים (8 וסודרו על ידי מתיל-Seq ו- 8 לא רציף) היו לאומדן ביסולפאט pyrosequencing. תוצאות להדגים עלייה משמעותית מתילציה DNA על פני 10 מתוך 12 סחורות ארוזות לצרכן לבדיקה (שינוי 5.1-10.4% מתילציה, P < 0.037, איור 4B). ניתוח מסלול קג בוצעה על כל אחד DMRs נומינלית משמעותית לזיהוי מסלולים הקשורים עם מתח. באופן עקבי, מסלולים הקשורים DMR מעורבים המחלות הקשורות חשיפה מתח כרוני, כגון סוכרת, מחלות לב וכלי דם, סרטן (טבלה 4). 21 , 22 , 23 להפגין שיוך בין הנתונים epigenetic ומידת החשיפה ללחץ, רמות מתילציה בעשר-CpG הושוו על הרמות קורט כלומר 3 שבועות עבור כל חיה. תוצאות המחקר הראו מתאם צנוע בין הנתונים אנדוקרינית, מתילציה (R2= 0.54, P = 0.001, איור 5).

figure-results-5373
איור 1: בסך הכל סכמטית זרימת עבודה עבור פלטפורמת עכברוש מתיל-Seq. גרם אחד של ה-DNA גנומי המופק מדם הדגיש, שליטה חולדות מעובד תחילה עבור בניית הספריות של מתיל-Seq עבור רצף, ניתוח, וזיהוי המטרה. עוד 100 ננוגרם של ה-DNA עבור אימות עצמאית של המטרות epigenetic שזוהה משמש ביסולפאט pyrosequencing. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5974
איור 2: חשיפה מתח כרוני משתנה (CVS) מובילה לשינויים האנדוקרינית והתנהגותיים אצל חולדות. (א) samplings מרובים של corticosterone (קורט) מדגימים את היציבות של השבוע 3 משטר CVS. נאספו דגימות דם בבוקר לפני הטיפול סטרס יומי. (B) חיות Stressed מבלה יותר זמן בזרועות סגור ופחות זמן בזרועות פתוחות גבוהות ועוד מבוך (EPM). Boxplots עם נקודת נתונים עבור כל חיה מוצגים. מבחן T של סטודנט בוצעה מובהקות סטטיסטית. * P < 0.05, * * P < 0.01, ו * * * P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6761
איור 3: כימות של הוטו, ובין אם-לא מתאם עכברוש דנ א ב bioanalyzer. העקומות אדום וכחול להראות את הכמות והגודל של הדנ א הגנומי (אדום) בעקבות הטיה sonicator איזותרמי, מתאם מצדו, בהתאמה. כל שורה מייצגת דוגמא אחת ואת האדום, כחול עקומות משקפים הן אובדן של DNA במהלך השלבים מספר (end-תיקון, 3'-adenylation וניקוי לדוגמה) להגביר את לחץ הדם גודל בשל מצדו המתאמים. חדות פסגות-25 bp ו- 1500 bp הם סימנים סטנדרטיים נוספו למאגר טעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7491
איור 4: CVS-induced שינויים epigenetic מזוהים על ידי עכברים מתיל-תת סעיף. (א) ניתוח של העכברוש מתיל-Seq נתונים מעורבים האמרגן של הגן Rt1m4 כאזור מפוגל באופן שונה (DMR) בין לחוץ (אדום) וחולדות שליטה (כחול). פלט גרפי עבור Rt1m4 DMR (אזור מוצל ורוד) מציגה כל CpG (קו אנכי אפור), הדגימות ארבעה לכל קבוצה (קווים אדום או כחול), ואת רמת מתילציה % עבור כל חיה (נקודה אדום או כחול). (B) 12 סחורות ארוזות לצרכן בתוך DMR היו אומת על-ידי ביסולפאט pyrosequencing. מהגרפים מיוצגים אומר SEM, בוצע מבחן T של סטודנט מובהקות סטטיסטית. * P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8381
איור 5: ניתוח של רגרסיה ליניארית הראו מתאם צנוע בין % DNA מתילציה-CpG-10 מתוך Rt1m4 ובשבוע 3 מתכוון פלזמה רמות קורט של שניהם הדגישו לשלוט בבעלי חיים (N = 16). נתונים מבעלי חיים לחוץ מיוצגים על-ידי עיגולים אדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

השבועיום 1יום 2יום 3יום 4יום 5יום 6יום 7
AMאיפוקלשחותחדר קרלשחותאיפוקשאכרלשחות
PMשאכרכלוב הטיהאיפוקשאכרחדר קראיפוקחדר קר
בן לילהלהגביל את האוכלרטוב מצעיםבידודאור עלהצפיפותאור עלרטוב מצעים

טבלה 1: זמנים שבועי טיפוסי של משטר מתח משתנה כרוני (CVS).

מדדי רצףלחץ1בקרה1
(n = 4)(n = 4)
לזווג סוף קריאות (לפי)89,290,39780,165,674
סוף לזווג ממופה באופן ייחודי קורא (UMPER)39,200,25535,013,406
יישור קצב/מיפוי יעילות (UMPER /)44%44%
קריאות כפולים (% UMPER)73%65%
UMPER עם מניעת כפילויות10,481,03112,306,018
ממוצע לקריאה עומק כיסוי (x) (ARDC)6 x6 x
סחורות ארוזות לצרכן (N)12,056,87812,056,878
המרכז לקידום פליטים אפריקאים (x) של סחורות ארוזות לצרכן2 x2 x
סחורות ארוזות לצרכן לפחות 10 קריאות (N)481,383595,850
המרכז לקידום פליטים אפריקאים (X) של סחורות ארוזות לצרכן עם קריאות לפחות 101919
על היעד סחורות ארוזות לצרכן (חפיפה מלאה עם בדיקה אזורי היעד)1,923,8722,007,638
המטרה ARDC (x) של סחורות ארוזות לצרכן7 x8 x
על סחורות ארוזות לצרכן היעד לפחות 10 קריאות (N)428,249531,419
ב- ARDC היעד (x) של סחורות ארוזות לצרכן לפחות 10 קורא18 x18 x
המטרה (לכל עם חפיפה זוג בסיסים 1 או יותר עם בדיקה אזורי היעד) (UMPER)8,277,7159,369,523
% על היעד (של UMPER עם מניעת כפילויות)78%77%
המטרה (סה כ בסיסים ממופה) Mb125 mb128 מגה-בתים
על היעד קריאה ממוצע עומק כיסוי (x) (ARDC)9 x10 x
1 מדדי רצף המבוסס על ממוצעים על פני נושאים בכל קבוצה

טבלה 2: קביעת רצף מדדים המתקבל פלטפורמת מתיל-Seq חולדה.

chrהתחלסוףג'יןמרחקareaStatmeanDiffמתחשליטהכיוון
chr201,644,2461,644,390RT1-M4in_gene93.030.220.330.11רווח
chr5160,361,352160,361,564LOC690911in_gene-70.75-0.190.720.91אובדן
chr361,138,28161,138,330RGD156431926556961.790.210.940.72רווח
chr2143,064,811143,065,010Ufm18569-59.48-0.110.130.24אובדן
chr730,764,11130,764,284Ntn4in_gene57.040.210.940.73רווח
chr1712,469,11212,469,218Idnk41996-50.91-0.130.740.88אובדן
chr747,101,72547,101,930Pawrin_gene-50.54-0.120.640.76אובדן
chr576,111,24876,111,822Txndc8151703-50.38-0.110.850.96אובדן
chr1180,640,13280,640,356Dgkgin_gene-50.07-0.160.730.89אובדן
chr871,759,24871,759,411Mir190210226-47.84-0.170.580.75אובדן

טבלה 3: ראש 10 באופן שונה מפוגל אזורים. עבור כל DMR, טבלת הפלט מראה משמאל לעמודה נכון: מיקום כרומוזומלית (chr), מרכזת (התחלה/סיום), ג'ין שם, מרחק שעתוק להתחיל באתר, אזור דיפרנציאלית סטטיסטיקה הדגישה בין ולשלוט קבוצות (areaStat), כלומר מתילציה דיפרנציאלית (meanDiff), כלומר מתילציה רמות על פני כל DMR עבור הדגיש ולשינוי קבוצות הבקרה (מתח/בקרה), וכיוון של מתילציה פקדים.

תנאי המעבר קגספירת ג'ין%ערך-Pבנימיני
סוכרת
סוכרת סוג II120.13.6 x 10-4 9.8 x 10-3
מחלות לב וכלי דם
התכווצות השריר החלק בכלי הדם180.11.6 x 10-3 3.6 x 10-2
Arrhythmogenic חדרית שריר הלב (ARVC)130.14.0 x 10-3 7.1 x 10-2
קרדיומיופתיה מורחבת140.17.6 x 10-3 1.2 x 10-1
נוירון פונקציה
הויסעגט110.11.5 x 10-2 1.4 x 10-1
איתות
מסלול איתות MAPK350.22.4 x 10-4 9.9 x 10-3
מסלול איתות סידן220.11.2 x 10-2 1.4 x 10-1
מסלול איתות כימוקין210.11.2 x 10-2 1.3 x 10-1
סרטן
מסלולים ב סרטן420.34.1 x 10-5 3.4 x 10-3
Glioma150.14.4 x 10-5 2.4 x 10-3
סרטן ריאות תא חדרים-קטן100.17.9 x 10-3 1.1 x 10-1
סרטן המעי הגס130.18.4 x 10-3 1.1 x 10-1
לוקמיה מיאלואידית כרונית120.11.2 x 10-2 1.3 x 10-1

טבלה 4: ניתוח קג מסלול של DMRs זיהה מהחולדה מתיל-תת סעיף.

Discussion

במחקר זה, אנחנו תוכננה ומומשה הפלטפורמה מתיל-Seq הגנום חולדה. על ידי הפגנת השירות שלה עם דגם עכברוש של מתח, אנחנו הראו כי הצינור ניסיוני אנליטיים יכול לספק אזורים מפוגל באופן שונה בין שתי קבוצות השוואה.

כדי להבטיח יישום מוצלח של הפלטפורמה, מספר שלבים קריטיים צריך להיות שנצפו. DNA לאיכות וכמות הראשון, הראשונית יש השפעה משמעותית על האיכות והכמות של הספרייה מתיל-Seq הסופי. השתמשנו fluorometer, במקום ספקטרופוטומטרים, כדי להבטיח מדידה הדנ א שלנו לידי ביטוי כמות כפולה גדילי DNA הנוכחי. Bioanalyzer שימש כדי למדוד את כמות ה-DNA בעקבות הטיה ואחרי מתאם מצדו וגודל מולקולרי. אימות גודל מולקולרי "מפנה" בין השלבים חיוני לאשר הנוכחות של מתאמי בקצוות של כל קטע DNA זה יעבור בתיווך מתאם ה-PCR בשלבים הבאים. כמות ה-DNA שנותרו בסוף השלב מצדו מתאם הוא גם חשוב, מאז לפחות 100 ננוגרם של המוצר הספרייה יש צורך בשלב זה כדי להבטיח כמות מספקת זמין לאחר השלבים ההמרה היעד עושר ולא ביסולפאט. מדידה רגישות גבוהה הסופי בוצע על הספרייה מתיל-Seq נבנה כך בספרייה יכולה לדלל כראוי עבור קיבוץ באשכולות הבאים על הרצפים הדור הבא. לבסוף, ביסולפאט pyrosequencing הועסק שיטה כמותית מאוד עצמאית כדי להעריך את הדיוק של הצינור אנליטית. האימות הסופי באמצעות דגימות המקורי שכפול באמצעות בעלי חיים נוספים הם צעדים חיוניים כדי להבטיח כי הניסוי ניתן לזהות שינויים משמעותיים מבחינה ביולוגית מתילציה DNA.

אנו כוללים גם מספר כללים מנחים במקרה של סטייה מהפרוטוקול או אם אתה נתקל בבעיות. קודם כל, זה אפשרי לאבד יותר מדי דנ א במהלך סוף-תיקון, מתאם מצדו או חרוז מגנטית טיהור צעדים. לחלופין, החל כמויות של הדנ א יכול להיות קטן (< 200 ng) עקב זמינות רקמות מוגבל/ה-DNA או יישום של שיטות שונות העשרה כגון קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא. הגדלת מספר מחזור במהלך השלבים הגברה שני ספריה עשוי להיות מסוגל לפצות על אובדן מוגזם של ה-DNA או נמוך החל כמות ה-DNA לאורך כל פרוטוקול בניית ספריה. עם זאת, לא יותר מאשר נוספים 2-3 מחזורי מומלצים, כמו תבנית מופרז הגברה זה עלול לגרום לעלייה במספר קריאות כפולים להיות רציף. כפילויות אלה לא יכללו במהלך השלב היישור כדי למנוע הטיה בחישובים מתילציה אחוז. שנית, אם הגודל הממוצע של ה-DNA אינו מעלה על ידי יותר מ 30 bps, בדוק כדי לוודא כי ריאגנטים הם חדשים, כמו T4 DNA פולימראז, Klenow, ו/או T4 ליגאז עשוי להיות זקן. החלפת זמינים מסחרית ריאגנטים יכול לשמש.

בנוסף, קיימת אפשרות כי DMRs החזוי אולי לא אמת על-ידי pyrosequencing, שבו הבדלים מתילציה DNA שאינם קיימים או באופן משמעותי פחות מאשר אלה חזה על ידי ניתוח. אימות המסכן של המועמד אזורים היא בעיה נפוצה גם עבור ניתוחים הגנום כולו רבים, כגון מתי pyrosequencing תוצאות לא לאשר מתילציה דיפרנציאלית או גודל האפקט הוא הרבה יותר קטן מאשר זה חזה על ידי הניתוח. BSmooth הוא אחד אנליטית חבילת הזה "מחליק" רמת מתילציה על פני חלון של מספר סחורות ארוזות לצרכן. לניסוי הנוכחי, BSmooth מעורבים DMR רמות מתילציה של מי היו אומת על-ידי ביסולפאט pyrosequencing. עם זאת, ככל הנראה יהיו סתירות בין רמות מתילציה שמנבאת BSmooth ואלה אומתו pyrosequencing. הסתירות נובעים פונקציית החלקת שמעריך את הערכים מתילציה הממוצע על-פני כל סחורות ארוזות לצרכן בתוך DMR, כולל רצופים סחורות ארוזות לצרכן זה עשוי להשתנות מתילציה DNA על ידי יותר מ- 50% או סחורות ארוזות לצרכן ערכיו מתילציה שוחררנו תופיפצה סף תת לקרוא לעומק. R-חבילות כגון MethylKit24 יכול לשמש כדי לזהות חלונות קטנים יותר של סחורות ארוזות לצרכן או אפילו יחיד סחורות ארוזות לצרכן אשר רמות מתילציה לתאם חריפה עם אלה על-ידי pyrosequencing. הטמעת חבילות שונות ובדיקות החזוי אזורים או סחורות ארוזות לצרכן של מתילציה דיפרנציאלי שלהם על-ידי pyrosequencing יבטיח החוסן של נתונים. לחלופין, ספריות מתיל-Seq המקורי יכול להיות מיון מחדש והוסיף בקבצי קריאה כדי להגדיל את עומק קריאה. מאז קביעת רמות מתילציה הם כמותיים למחצה ו מוכתב על ידי מספר הקריאות [(# of CpGs) / (# של TpGs + סחורות ארוזות לצרכן)], הגדלת העומק קריאה עבור CpG נתון יגדיל את הדיוק של ערכו מתילציה אחוז. במחקר זה, שקלנו רק סחורות ארוזות לצרכן ערכיו מתילציה נקבעו על ידי קורא לפחות עשרה והצלחתי קריאה הכולל סיקור 19 x עבור כל CpG.

פלטפורמת מתיל-Seq עכברוש אינה ללא המגבלות. אמנם זה עלות יותר אפקטיבי מאשר רצף הגנום כולו ביסולפאט, זה משמעותית יקר יותר מאשר שיטות אחרות. למרות זאת, מרבית מהעלות היה עבור רכישת נתיבים על הרצפים (sequencer) ולא על מערכת לכידת. בהתאם העומק קריאה הצורך, עם השוואות בין רקמות הדורשים פחות בשל הבדלים גדולים (25 – 70%)12 ב מתילציה DNA, העלות יכול להיות מופחת על ידי ריבוב יותר דוגמאות לכל ליין באמצעות פלטפורמה קיבולת גבוהה יותר. בנוסף, הכנת הדוגמא היא אורכת זמן רב יותר משיטות אחרות. בעוד בדומה גישות אחרות הנפתח המשלבים הדור הבא רצפי, השלבים ההמרה טיהור וניקוי נוסף ביסולפאט להוסיף עומס העבודה. בסך הכל, פלטפורמת מתיל-Seq היא חלופה חסכונית רצף הגנום כולו, ומספק בסיס-זוג ברזולוציה ב. סחורות ארוזות, יותר מ- 2.3 מיליון לצרכן-וזה הרבה יותר מאשר אלה לבדיקה על ידי פלטפורמות מבוססת microarray. עד כה, את האדם זמין מסחרית ועכבר מתיל-Seq פלטפורמות שימשו כדי לתעד את השינויים תלויי-אלכוהול מקוק המוח25,26, גנים התפתחותיות במוח העכבר9, ו דם-מוח מטרות glucocorticoids10. עוד יותר, היכולת למקד אזורים ספציפיים בין רצף זיהוי על ידי אנזימי הגבלה הופך אותו לפלטפורמה אידיאלית השוואות בין-המינים. במחקר זה, תיכננו הפלטפורמה מתיל-Seq העכברוש, אשר תרופתי מטבולית, התנהגותית נסיוניות מבוצעות ללא הסיוע של כלי methylomic הגנום כולו. הנתונים שלנו מראים כי זה יכול לשמש כדי לזהות DMRs במודל של עכברים של מתח, בקורלציה פיסיולוגיים אחרים כגון רמות קורט פלזמה הכללית.

פלטפורמת מתיל-Seq הינו אידיאלי עבור epigenetic ניסויים בבעלי חיים עם הגנום ברצף זה ייתכן שאין מספיק ראיות לתעד אזורים רגולטוריות. כאשר אזורים כאלה נעשים זמינים, אזורים נוספים עשויים להיות אישית מעוצבת, המצורפות לגירסה הנוכחית. יתר על כן, פלטפורמת הינו אידיאלי עבור גנומיקה השוואתי, מאז העשרת היעד אינה מאולצת על ידי אנזים הגבלה זיהוי. למשל, האזור המקדם של הגן בכל עניין ניתן ללכוד ללא קשר אם זה בנמלים אתר הגבלה ספציפית. באופן דומה, ניתן ללכוד כל האזורים תקינה, כגון אלה שזוהו העכבר או בני אדם, אשר נשמרים הגנום של עניין.

Disclosures

כתב היד הוא חלק בפרס בתחרות של Agilent טכנולוגיות.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענק-NIH MH101392 (RSL) וכן תמיכה פרסים וקרנות הבאים: פרס החוקר הצעיר NARSAD, מרגרט אן מחיר החוקר קרן, ג'יימס ווה רוח הפרעות מלומד הקרן באמצעות קרן באוור טי צ'ארלס, בייקר קרן, קרן התאמה הפרוייקט (RSL).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Radioimmuno assay (RIA)MP Biomedicals7120126Corticosterone, 125I labeled
Master Pure DNA Purification KitEpicentre/IlluminaMC85200
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat BathUSA Scientific2510-1102Used with 1.5 mL tubes
Vortex Genie 2Fisher12-812Vortex Mixer
Ethyl alcohol, PureSigma-AldrichE7023100% Ethanol, molecular grade
Centrifuge 5424 REppendorf-Must be capable of 20,000 x g
Qubit 2.0ThermoFisher ScientificQ32866Fluorometer
Qubit dsDNA BR Assay KitThermoFisher ScientificQ32850
Qubit dsDNA HS Assay KitThermoFisher ScientificQ32851High sensitivity DNA detection reagents
Qubit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent KitAgilent TechnologiesG9651AReagents for preparing the Methyl-Seq library
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture LibraryAgilent Technologies931143RNA baits for enrichment of rat targets
IDTE, pH 8.0IDT DNA11-05-01-0910 mM TE, 0.1 mM EDTA
DNA LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431021
Covaris E-series or S-seriesCovaris-Isothermal sonicator
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25)Covaris520045
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade)Quality Biological351-029-721
Veriti 96 Well-Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63880DNA-Binding magnetic beads
96S Super MagnetALPAQUAA001322Magnetic plate for purification steps
2200 TapeStationAgilent TechnologiesG2965AAElectrophresis-based bioanalyzer
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582
D1000 ScreenTape High SensitivityAgilent Technologies5067-5584
D1000 ReagentsAgilent Technologies5067-5583
D1000 Reagents High SensitivityAgilent Technologies5067-5585
DNA110 SpeedVacThermoFisher Scientific-Vacuum Concentrator
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beadsInvitrogen65601Streptavidin magnetic beads
Labquake Tube RotatorThermoFisher Scientific415110QNutator Mixer is also acceptable
EZ DNA Methylation-Gold KitZymo ResearchD5006Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers
Illumina Hi-Seq 2500Illumina-Next-generation sequencing machine
PCR and Pyrosequencing PrimersIDT DNAVariable
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 unitsNew England BioLabsM0267L
Deoxynucleotide (dNTP) Solution SetNew England BioLabsN0446S
Pyromark MD96QIAGEN-Pyrosequencing machine
Ethyl Alcohol 200 ProofPharmco-Aaper11100020070% Ethanol solution
Sodium Hydroxide PelletsSigma-Aldrich2214650.2 M NaOH denature buffer solution
Tris (Base) from J.T. BakerFisher Scientific02-004-50810 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution
PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96)QIAGEN972807Reagents required for pyrosequencing
PyroMark Annealing BufferQIAGEN979009
PyroMark Binding Buffer (200 mL)QIAGEN979006
Streptavidin Sepharose High Performance BeadsGE Healthcare17-5113-01Streptavidin-coated sepharose beads
PyroMark Q96 HS PlateQIAGEN979101Pyrosequencing assay plate
Eppendorf Thermomixer RFisher Scientific05-400-205Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207)
SureDesign WebsiteAgilent Technologies-Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)
UCSC Genome BrowserUniversity of California Santa Cruz-rat Nov 2004 rn4 assembly
Agilent Methyl-Seq ProtocolAgilent Technologies-https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf

References

  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Meissner, A., et al. Genome-scale DNA methylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature. 454 (7205), 766-770 (2008).
  3. Bibikova, M., et al. High density DNA methylation array with single CpG site resolution. Genomics. 98 (4), 288-295 (2011).
  4. Naumov, V. A., et al. Genome-scale analysis of DNA methylation in colorectal cancer using Infinium HumanMethylation450 BeadChips. Epigenetics. 8 (9), 921-934 (2013).
  5. Wockner, L. F., et al. Genome-wide DNA methylation analysis of human brain tissue from schizophrenia patients. Translational Psychiatry. 4, e339 (2014).
  6. Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 33 (18), 5868-5877 (2005).
  7. Smith, Z. D., Gu, H., Bock, C., Gnirke, A., Meissner, A. High-throughput bisulfite sequencing in mammalian genomes. Methods. 48 (3), 226-232 (2009).
  8. Slieker, R. C., et al. Identification and systematic annotation of tissue-specific differentially methylated regions using the Illumina 450k array. Epigenetics Chromatin. 6 (1), 26 (2013).
  9. Hing, B., et al. Adaptation of the targeted capture Methyl-Seq platform for the mouse genome identifies novel tissue-specific DNA methylation patterns of genes involved in neurodevelopment. Epigenetics. 10 (7), 581-596 (2015).
  10. Seifuddin, F., et al. Genome-wide Methyl-Seq analysis of blood-brain targets of glucocorticoid exposure. Epigenetics. 12 (8), 637-652 (2017).
  11. Irizarry, R. A., et al. The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue-specific CpG island shores. Nature Genetics. 41 (2), 178-186 (2009).
  12. Lee, R. S., et al. Adaptation of the CHARM DNA methylation platform for the rat genome reveals novel brain region-specific differences. Epigenetics. 6 (11), 1378-1390 (2011).
  13. Jankord, R., et al. Stress vulnerability during adolescent development in rats. Endocrinology. 152 (2), 629-638 (2011).
  14. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
  15. Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
  16. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  17. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), R25 (2009).
  18. Hansen, K. D., Langmead, B., Irizarry, R. A. BSmooth: from whole genome bisulfite sequencing reads to differentially methylated regions. Genome Biology. 13 (10), R83 (2012).
  19. Lee, R. S., et al. Chronic corticosterone exposure increases expression and decreases deoxyribonucleic acid methylation of Fkbp5 in mice. Endocrinology. 151 (9), 4332-4343 (2010).
  20. Lee, R. S., et al. A measure of glucocorticoid load provided by DNA methylation of Fkbp5 in mice. Psychopharmacology. , (2011).
  21. Bose, M., Olivan, B., Laferrere, B. Stress and obesity: the role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in metabolic disease. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 16 (5), 340-346 (2009).
  22. Brydon, L., Magid, K., Steptoe, A. Platelets, coronary heart disease, and stress. Brain, Behavior, and Immunity. 20 (2), 113-119 (2006).
  23. McKlveen, J. M., et al. Chronic Stress Increases Prefrontal Inhibition: A Mechanism for Stress-Induced Prefrontal Dysfunction. Biological Psychiatry. 80 (10), 754-764 (2016).
  24. Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biology. 13 (10), R87 (2012).
  25. Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Alcohol-dose-dependent DNA methylation and expression in the nucleus accumbens identifies coordinated regulation of synaptic genes. Translational Psychiatry. 7 (1), e994 (2017).
  26. Cervera-Juanes, R., Wilhelm, L. J., Park, B., Grant, K. A., Ferguson, B. Genome-wide analysis of the nucleus accumbens identifies DNA methylation signals differentiating low/binge from heavy alcohol drinking. Alcohol. 60, 103-113 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140DNASeqneuroendocrinology

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved