JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול מפורט מתואר את ההפרדה, זיהוי של אפיון proteoforms דגימות חלבון באמצעות נימי אזור אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS). הפרוטוקול יכול לשמש עבור אפיון ברזולוציה גבוהה proteoforms דגימות חלבון וזיהוי בקנה מידה גדול של proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים.

Abstract

אזור נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS) הוכרה ככלי שימושי פרוטאומיקס מלמעלה שמטרתו לאפיין proteoforms ב proteomes מורכבים. עם זאת, היישום של CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול לו היה מובן את קיבולת טעינה הדגימה נמוך וצר ההפרדה, חלון CZE. כאן, פרוטוקול מתואר באמצעות CZE-MS/MS עם נפח העמסה מדגם בקנה מידה microliter וחלון הפרדה 90-מין עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול. פלטפורמת CZE-MS/MS מתבסס על לינאריות לזיהוי (LPA)-נימי בתזרים electroosmotic נמוך ביותר, שיטה ריכוז מדגם דינאמיים המבוססות על pH-צומת באינטרנט עם יעילות גבוהה של חלבון בערימה, מצופה ההפרדה ממשק זרימה CE-MS נדן שאוב אלקטרו-kinetically עם רגישות גבוהה מאוד, ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים עם גבוה המונית, רזולוציה, מהירות הסריקה. פלטפורמת יכול לשמש האפיון ברזולוציה גבוהה של חלבון שלם פשוט דוגמאות ואפיון בקנה מידה גדול של proteoforms ב proteomes מורכבים שונים. כדוגמה, הוא הפגין הפרדה יעילה במיוחד של תערובת חלבונים רגיל, של זיהוי רגישה מאוד זיהומים רבים באמצעות הפלטפורמה. כדוגמה נוספת, פלטפורמה זו יכול לייצר מעל 500 proteoform ולהפעיל ההזדהויות חלבון 190 מ פרוטאום Escherichia coli ב יחיד CZE-MS/MS.

Introduction

פרוטאומיקס מלמעלה למטה (TDP) שואפת אפיון proteoforms בתוך פרוטאום בקנה מידה גדול. TDP מסתמך על ההפרדה שלב נוזלי יעיל של חלבונים שלמים לפני ניתוח יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (ESI-MS/MS) ספקטרומטריית electrospray בשל המורכבות גבוהה של טווח דינמי ריכוז גדול של פרוטאום1,2 ,3,4,5. אזור נימי אלקטרופורזה (CZE) היא טכניקה חזקה עבור הפרדת מולקולות המבוססת על יחסי גודל לתשלום שלהם6. CZE היא יחסית פשוטה, הדורשים בלבד פתוח צינורי התמזגו סיליקה נימי, על רקע אלקטרוליט (BGE), ספק כוח. מדגם של חלבונים שלמים ניתן לטעון לתוך נימי באמצעות לחץ או מתח, ההפרדה הוא שיזם הטבעית בשני קצוות נימי ב BGE ויישום של מתח גבוה. CZE יכולים לגשת יעילות הפרדה גבוהה במיוחד (> לוחות תיאורטי מיליון) דוגל בהפרדה בין מולקולות7. CZE-MS יש רגישות גבוהה יותר באופן משמעותי מאשר בשימוש נרחב כרומטוגרפיה נוזלית הפוך-פאזי (RPLC)-MS לניתוח של חלבונים שלמים8. למרות CZE-MS יש פוטנציאל גדול עבור בקנה מידה גדול מלמעלה פרוטאומיקס, היישום שלה רחב ב פרוטאומיקס יש כבר מובן מספר בעיות, כולל מדגם נמוך-העמסה חלון צר ההפרדה. המדגם טיפוסי טעינת אמצעי אחסון ב- CZE הוא כ 1% מהנפח נימי הכולל, המתאים לרוב פחות מ- 100 nL9,10,11. החלון ההפרדה של CZE הוא בדרך כלל פחות מ 30 דקות בשל9,זרימה (EOF)10electroosmotic חזק. בעיות אלה מגבילות CZE-MS/MS לצורך זיהוי מספר רב של proteoforms ו- proteoforms שופע נמוך מ פרוטאום מורכבים.

הרבה מאמץ כדי לשפר את הדגימה טעינת אמצעי אחסון מהשיטות CZE באמצעות דגימת מקוון ריכוז (למשל, מוצק-שלב microextraction [SPME]12,13, דגימה משופרת שדה הערימה [פס]9 , 11 , 14, ו pH דינמי צומת15,16,17,18). פס ו pH דינמי צומת הם פשוט יותר מאשר SPME, רק לדרוש הבדל משמעותי בין המאגר מדגם BGE את מוליכות, pH. פס מעסיקה מאגר מדגם עם הרבה מוליכות נמוכה יותר מאשר BGE, שמוביל הערמה של analytes על גבול בין אזור הדגימה את אזור BGE נימי. צומת ה-pH דינמי מנצל פקק מדגם בסיסיים (למשל, 50 מ מ אמוניום ביקרבונט, pH 8), של BGE חומצי (למשל, חומצה אצטית 5% [וי/v], pH 2.4) משני הצדדים של התקע הדגימה. בעת יישום של מתח חיובי גבוה בסוף הזרקה נים, טיטור של התקע מדגם basic מתרחש, תוך התמקדות את analytes לתוך פקק חזק לפני שעברו פרידה CZE. לאחרונה, הקבוצה השמש באופן שיטתי לעומת פס ו- pH דינמי צומת על הערימה מקוון של חלבונים שלמים, הפגינו בצומת pH הדינמי הזה יכול להפיק ביצועים טובים הרבה יותר פס עבור ריכוז חלבונים שלמים באינטרנט כאשר האחסון הזרקה מדגם היה 25% הנפח נימי הכולל19.

יש כבר מועסקים ההפרדה נייטרליים מצופה נימים (למשל, לינאריות לזיהוי [LPA]) כדי להפחית EOF ב נימי, מאטים את ההפרדה CZE והרחבת ההפרדה חלון20,21. הקבוצה Dovichi פותח לאחרונה הליך פשוט להכנת ציפוי LPA יציב על הקיר הפנימי של נימים, ניצול קירור (APS) בתור יוזם ומפתח טמפרטורה (50 ° C) ייצור רדיקלים חופשיים, הפילמור22 . ממש לאחרונה, הקבוצה השמש מועסקים נימי ההפרדה מצופים LPA ושיטת צומת pH דינמי עבור CZE הפרדת חלבונים שלמים, להגיע מדגם בקנה מידה microliter טעינת החלון 90-מין הפרדה19ונפח. מערכת זו CZE פותח את הדלת בפני משתמש CZE-MS/MS פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול.

CZE-MS דורש ממשק רגיש ועמיד מאוד לזוג CZE ל MS. שלושה ממשקים CE-MS כבר מפותחת היטב ממוסחר בהיסטוריה של CE-MS, והם נדן-זרימה co-צירית ממשק23, הממשק sheathless באמצעות טיפ נקבובי כמו פולט ESI24, ו אלקטרו-kinetically נדן שאוב לזרום ממשק25,26. אלקטרו-kinetically שאוב נדן-ממשק-מבוססות זרימה CZE-MS/MS הגיעה למגבלה9זיהוי פפטיד zeptomole נמוך, ההזדהויות פפטיד מעל 10,000 (IDs) של הלה התא פרוטאום יחיד להפעיל14, אפיון מהר של חלבונים שלמים11ולאחר ניתוחים לשחזור ויציבה מאוד של מולקולות26. לאחרונה, את נימי ההפרדה מצופים LPA השיטה צומת pH דינמי, הממשק זרימה נדן אלקטרו-kinetically שאוב שימשו פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול של פרוטאום Escherichia coli (e. coli)19 ,27. פלטפורמת CZE-MS/MS התקרב יותר מ-500 חתימות proteoform יחיד להפעיל19 ו כמעט 6,000 proteoform מזהים באמצעות מצמד עם גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות)-RPLC fractionation27. התוצאות מראות בבירור את היכולת של CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול.

במסמך זה, מתואר הליך מפורט של שימוש CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול. מערכת CZE-MS/MS מעסיקה את נימי מצופים LPA להפחית EOF בנימי, שיטת צומת pH דינמי עבור ריכוז חלבונים, הממשק זרימה נדן אלקטרו-kinetically שאוב עבור צימוד CZE ל MS, orbitrap מקוון המוני ספקטרומטר עבור האוסף של MS ו- MS/MS ספקטרום של חלבונים ו תוכנת TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform זיהוי ואפיון) עבור מזהה proteoform באמצעות חיפוש במסד הנתונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת ציפוי LPA על הקיר הפנימי של נים ההפרדה

  1. רעלני של נימי
    1. ריקון של נימי fused סיליקה (120 ס מ אורך, 50 מיקרומטר בקוטר הפנימי [תעודת זהות], 360 מיקרומטר קוטרו החיצוני [יתר]) במרוכז עם 500 µL של 1 מ' נתרן הידרוקסידי, מים יונים, חומצה הידרוכלורית 1 מ', מים יונים ו LC-MS כיתה מתנול באמצעות מזרק משאבה.
    2. יבש את נימי עם גז חנקן (10 psi, ≥ 12 שעות) ולמלא את נימי עם 50% (v/v) 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate ב מתנול באמצעות מזרק משאבה. חותם בשני קצוות נים עם גומי סיליקה, דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 24 שעות.
      הערה: במהלך שלב זה, הדופן הפנימית של נים זה functionalized עם C = ג ארוכים תוצאות הדגירה בציפוי קפילרי טוב יותר עקב תגובה מפורט יותר.
    3. לחתוך חלק קטן (~ 5 מ מ) של נימי משני הכיוונים עם אבן שהפריד. יש לשטוף את נימי עם מתנול (500 µL) באמצעות מזרק משאבה לנקות את ריאגנטים unreacted. יבש את נימי עם גז חנקן (10 psi, ≥12 h).
  2. הכנת הציפוי LPA
    הערה: הליך זה מבוסס על ג ' ו. et al. 22 עם שינויים מזעריים.
    1. להכין אקרילאמיד פתרון (40 מ"ג של אקרילאמיד ב 1 מ"ל של מים) והפתרון persulfate (APS) אמוניום (5% [w/v] במים).
    2. להוסיף 2-3 µL של הפתרון APS µL 500 של הפתרון אקרילאמיד, מערבולת, את התערובת, דגה זה עם גז חנקן עבור 5 דקות כדי להסיר את החמצן בפתרון.
    3. לטעון את התערובת לתוך נימי pretreated באמצעות ואקום, חותם בשני קצוות נים עם גומי סיליקה, דגירה אותו באמבט מים ב 50 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
    4. הסר חלק קטן (~ 5 מ מ) של נים שני הקצוות עם אבן שהפריד. לדחוף את הפתרון unreacted החוצה נימי עם מים (200 µL), באמצעות המשאבה מזרק.
      הערה: ודא הפולימר דחפתי את נימי עקביות דמוי ג'ל agarose. שלב הדגירה ארוך יותר (עד ~ 45-50 דקות) יכול לגרום ציפוי קפילרי טוב יותר. עם תקופות ארוכות יותר של התגובה, נים עשויים להיחסם, בלחץ גבוה נדרש כדי לדחוף החוצה הפולימר עם מים. משאבת HPLC יכול לשמש למטרה זו.

2. תחריט של נימי עם חומצה הידרופלואורית

התראה: שימוש נהלי הבטיחות המתאים לטיפול פתרונות חומצה הידרופלואורית (HF). כל פעולות הקשורות ל- HF צריך להיעשות בשכונה כימי. לפני כל פעולה הקשורה HF, ודא כי 2.5% סידן gluconate ג'ל זמין לשימוש במקרה של חשיפה. כפפות כפול נדרשים, הכפפות nitrile טיפוסי בתוך, אטומה כבד של כפפות בחוץ. ללבוש חלוק מעבדה ומשקפת בטיחות כימית. לאחר הניתוחים HF, להפריד פסולת מסוכנת נוזלי ומוצק. הפסולת HF נוזלי חייב שבודד מיד עם גבוהה-ריכוז נתרן הידרוקסידי פתרון אחסון זמני לפני איסוף פסולת. פסולת מוצקה HF צריך להיות מאוחסנים באופן זמני במיכל פלסטיק היא רצופה שני עבה גלון אחד ולאטום שקיות פלסטיק, מכסה. גם את הפסולת הנוזלית חייבים להיות מסומנים כראוי.

  1. לצרוב על חלק נימי באמצעות להבה עדינה (למשלכיס קל יותר) כדי להסיר את פוליאימיד-הציפוי החיצוני (1 ס מ אורך) בסביבות 4 ס מ מן קצה אחד של נימי. לנקות בעדינות את החלק השרוף של נים שתמחקי כדי להסיר את פוליאימיד ציפוי לחלוטין.
    הערה: המשיכי בזהירות, כמו החלק של נים ללא הציפוי פוליאימיד יהיה קצת מעורערת.
  2. לקדוח חור קטן בקצה של צינור 200-µL סביב באותו גודל הקוטר החיצוני נימי להחזיק מספיק את נימי במקום, ברגע זה הוא השחיל דרך החור. שרשור סוף נימי שקרוב החלק השרוף דרך החור עד החלק השרוף בצינור.
    הערה: מומלץ לבדוק גודל החור עם סוף נימי מן החלק השרוף כדי להבטיח בגודל הנכון, כמו החלק השרוף של נימי הוא שביר.
  3. להוסיף ~ 150 µL של HF (48-51% פתרון במים) הצינור 200-µL כך הפתרון HF נמצא בערך במחצית את החלק השרוף-נימי. דגירה של נימי בפתרון HF בטמפרטורת החדר למשך 90-100 דקות.
    הערה: מומלץ כי נוצר עוד חור במכסה של הצינור, חפץ קטן (למשל, טיפ קטן פיפטה) משמש להחזיק את הצינור בזמן הדגירה לוקח את המקום. הטיפ פיפטה יכול לשמש כדי לנקב קצף או כמה אחרים פלטפורמה מוצקה שממנו תא התגובה יתלה, יצירת סביבה בטוחה. במקום מגבות נייר מתחת הצינור המכיל HF, בצע את ההליכים נכונה במקרה של דליפה.
  4. הסר את נימי מהצינור ולשטוף החיצוני עם מים יונים כדי להסיר כל HF שיורית.
    הערה: ודא הקוטר החיצוני של נימי-החלק הצר של החלק השרוף עכשיו קטן מ- 100 מיקרומטר, כמו שצריך להיות.
  5. חותכים את חלק חרוט נימי במרכז החלק הצר באמצעות אבן שהפריד כדי לייצר את נימי ההפרדה עם פחות מ-100 מיקרומטר ב יתר בקצה אחד. חותכים נחרטו ללא סוף נימי להשיג הפרדה 1-m נימי.
    הערה: השלך פסולת HF לפי הפרוטוקול כמוסד שנקבעו.

3. הכנת הדגימות

  1. הכנת תערובת חלבונים סטנדרטי
    1. להכין תערובת חלבונים סטנדרטית המכילה ציטוכרום c (Cyto.c, 12 kDa, 0.1 מ"ג/מ"ל) ליזוזים (14.3 kDa, 0.1 מ"ג/מ"ל), β-קזאין (24 kDa, 0.4 מ"ג/מ"ל), מיוגלובין (16.9 kDa, 0.1 מ"ג/מ"ל), קרבוניק אנהידראז (CA, 29 kDa, 0.5 מ"ג/מ"ל), אלבומין שור (BSA, 66.5 kDa 1.0 מ"ג/מ"ל) ב- LC-MS כיתה מים כפתרון מניות.
      הערה: הפתרון מניות ניתן aliquoted מאוחסנת ב- 80 ° C לשימוש.
    2. לדלל את הפתרון מניות לפי פקטור של 10 עם פתרון אמוניום ביקרבונט 50 מ מ (pH 8.0) במים כיתה LC-MS לניתוח CZE-MS.
      הערה: לסנן את הפתרון אמוניום ביקרבונט לפני השימוש עם מסנן ממברנה (למשל, 0.2 µm של קרום תאית חנקתי ו-50 מ"מ קוטר).
  2. הכנת דוגמה e. coli
    1. התרבות התאים e. coli (K-12 MG1655) LB בינוני ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול-225 סל ד עד הערך OD600 מתקרב 0.7. E. coli תאים באמצעותצנטריפוגה (3,283 x g, 10 דקות) לאסוף ולשטוף אותם מספר פעמים בתמיסת באגירה פוספט (PBS) כדי להסיר את המדיום.
    2. להשעות את התאים e. coli במאגר פירוק המכילה אוריאה 8 מ', מעכבי פרוטאז ו 100 מ מ אמוניום ביקרבונט (pH 8.0), ultrasonicate על קרח למשך 15 דקות באמצעות מפצל תא קולי עם קרן גביע עבור פירוק התא מלא.
      1. להגדיר את מחזור (%) 50 ולהגדיר את הפלט שליטה 7 עבור מפצל התא קולי.
    3. Centrifuge lysate ב 18,000 x g עבור 10 דקות לאסוף את תגובת שיקוע וזורקים בגדר. השתמש aliquot קטן של תגובת שיקוע למדידה ריכוז חלבון עם bicinchoninic חומצה (BCA) וזמינותו.
      הערה: את הצרכים lysate אלקליניים לפחות פי שלושה כדי להפחית את הריכוז אוריאה נמוך מ- 3 מ' על מנת להיות תואם וזמינותו BCA. וזמינותו BCA מבוצעת בהתבסס על ההליך של היצרן.
    4. לערבב 1 מ ג של e. coli חלבונים עם אצטון קר עם יחס נפח של 1:4 ולשמור התערובת ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כדי לזרז את החלבונים.
      הערה: לבצע כל ניסויים באמצעות אצטון בשכונה כימי.
    5. ספין למטה זירז חלבונים (12,000 x g, 5 דקות) ולהסיר את תגובת שיקוע. רוחצים את גלולה עם אצטון קר שוב (באותו אמצעי אחסון כמו קודם) את ספין למטה שוב.
    6. הסר את תגובת שיקוע ולאפשר בגדר להתייבש בשכונה כימי לכמה דקות.
      הערה: לא overdry בגדר חלבון.
    7. להמיס את precipitated e. coli חלבונים (מ ג 1) ב- µL 200 של 8 מ' אוריאה ב- 100 מ מ אמוניום ביקרבונט (pH 8.0).
    8. Denature, להפחית ו- alkylate לדוגמה.
      1. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות denature את החלבונים.
      2. להפחית עם dithiothreitol (DTT) על ידי הוספת 2 µL של 1 מ' DTT פתרון (100 מ מ אמוניום ביקרבונט) לתוך הדגימה המקננת המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      3. Alkylate את החלבונים עם iodoacetamide (רשות העתיקות) על-ידי הוספת µL 6 של 1 מ' רשות העתיקות פתרון (100 מ מ אמוניום ביקרבונט) לדגימת, דגירה המדגם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      4. להרוות את רשות העתיקות עודף עם DTT על-ידי הוספת 2 µL של 1 מ' DTT פתרון, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. Acidify הדגימה עם חומצה פורמית (FA) להגיע לריכוז פא סופית של 1% (v/v).
        הערה: הפחתת ו אלקילציה מבוצעות לסייע על התגלגלות של חלבונים על פיצול במורד הזרם. צעדים אלה יאבדו את המידע של איגרות חוב דיסולפידי. אם המטרה היא ללמוד על אגרות החוב דיסולפידי על החלבונים, להימנע הצעדים הללו. זכור כדי להתמודד עם כל הפתרונות חומצה מרוכזת בשכונה כימי.
    9. Desalt הדגימה באמצעות עמודה מלכודת C4 (למשל, 4 מ מ תעודות זיהוי, 10 מ מ אורך, ארוז עם חלקיקים 3-מיקרומטר שיש 300-נקבוביות) עם מערכת HPLC. להשתמש גלאי UV באורך-גל של 254 ננומטר לצורך זיהוי.
      1. הגדר קצב הזרימה ניידים שלב 1 מ"ל לדקה Activate העמודה על ידי שטיפה זה עם 80% (v/v) acetonitrile (לחצן מצוקה), 0.1% פא במים למשך 10 דקות, ו- equilibrate על ידי שטיפה זה עם 2% (v/v) לחצן מצוקה, 0.1% פא במים למשך 10 דקות.
      2. לטעון 500-µg חלבונים אל העמודה ואת desalt על ידי שטיפה אותם עם 2% (v/v) לחצן מצוקה, 0.1% פא במים למשך 10 דקות בקצב זרימה 1 mL/min.
      3. Elute את החלבונים עם 80% (v/v) לחצן מצוקה, 0.1% פא במים למשך 3 דקות בספיקה 1 mL/min. לאסוף את eluate, lyophilize זה עם רכז ואקום.
        הערה: העמודה מלכודת C4 יכול לשמש כדי desalt כמויות גדולות של חלבונים אבל לא נמוך מיקרוגרם של חלבונים בשל אובדן אפשרי מדגם. עבור חומרים חלבונים מוגבל, שקול להשתמש פיפטה טיפים עם C4 מדיה עבור חלבון desalting. יש להיזהר לא overdry את החלבונים, כאשר lyophilizing את הדגימה.
    10. להמיס את µg 500 של חלבונים (בהנחה ללא אובדן מדגם במהלך הכנת המדגם) 250 µL של 50 מ מ אמוניום ביקרבונט (pH 8.0) לניסויים CZE-MS.

4. הגדרת המערכת CZE-MS/MS, ניתוח של הדגימות

  1. הקמה של מערכת CZE
    1. הכן של BGE המכילה 5% או 10% (v/v) חומצה אצטית (pH ~2.4 או ~ 2.2) ב- LC-MS כיתה מים. מכניסים מ ~1.5 ל BGE בקבוקון BGE שתואם עם המגש מאגר של תעשיה CZE.
      הערה: להפוך BGE טריים בכל שבוע שינוי הפתרון BGE בבקבוקון כל יום כדי למנוע כל זיהום.
    2. להוסיף פתרון מדגם (5-200 µL) שפופרת הוספה, להכניס את הצינור הוספה thatmatches המבחנה מדגם עם המגש מדגם של תעשיה CZE.
    3. טען את הדגימה את BGE, ההפרדה נימי תעשיה CZE.
      הערה: השפה המשמשת בדייקנות מפליאה פרוטוקול זה משקף את השימוש מזהמי מזון מסוים אחד (ראה טבלה של חומרים), אך ניתן ליישם את העקרונות autosamplers אחרים.
      1. בחר מדגם לטעון הדף שליטה ידנית של תעשיה CZE. לטעון את המבחנה BGE במגש מאגר של תעשיה, וציין את מעמדה במגש מאגר. לטעון את המבחנה מדגם במגש מדגם של תעשיה, וציין את מעמדה במגש הדגימה.
        הערה: המכשיר יכול להיות מופעל בשליטה ידנית על-ידי לחיצה על התמונה של המכשיר עבור צג המכשיר בדף הכלי העיקרי ולאחר מכן בחירה ידנית תחת שליטה ישירה.
      2. טען את נימי ההפרדה תעשיה CZE, באמצעות נחרטו ללא סוף נימי. לשים את מזהמי מזון למיקום יישור באמצעות שליטה ידנית. שרשור נחרטו ללא סוף נימי לתוך חור המשמש לשמור על ההפרדה נימי עד זה לא יכול להיות משורשרות פיזית נוסף.
        הערה: במקרה זה, בסוף נימי כמעט באותו גובה כמו הסוף של האלקטרודה, µL לפחות 50 המדגם הוא נדרש בבקבוקון מדגם כדי לוודא שבסוף נימי הוא שקוע המדגם במהלך ההזרקה. אם אמצעי האחסון מדגם נמוך (כלומר, 5 µL), הגובה של הזרקת סוף הצרכים נימי יותאם כפי שמתואר בשלב 4.1.3.2.1.
        1. להתאים את הגובה של הזרקת סוף נימי אם אמצעי האחסון מדגם הוא נמוך יותר מאשר 50 µL (כלומר, 5 µL). לעבור את מזהמי מזון המתנה בעזרת שליטה ידנית. הקלד את מיקום הדגימה במערכת והזז את נימי המדגם. דחוף בסוף נימי עוד יותר למטה כדי להגיע לתחתית המבחנה דוגמת הזרקת.
          הערה: במקרה זה, הזרקה מדגם ניתן לבצע עם מדגם של µL רק 5 בבקבוקון.
      3. המשך השימוש של שליטה ידנית, לשטוף את נימי עם BGE למשך 20 דקות, תוך שימוש בלחץ של 20 psi.
  2. הקמה של הממשק CZE-MS
    1. השתלבי זכוכית בורוסיליקט נימי (1 מ מ ביתר, 0.75 מ מ ז, 10 ס מ) שני הפולטים ספקטרומטריית electrospray עם דרך פתח בגוף של 20-40 µm ביתר
      הערה: לשמור על אורך פולט ספקטרומטריית electrospray כ 4-5 ס מ וחותכים אותו עם אבן שהפריד במידת הצורך. להיפטר זכוכית כל הפסולת במיכל החדים. ההגדרות כדי לקבל עצות 20 - 40 µm הם כדלקמן. הגדר את החום כדי 498, המשיכה 5, את מהירות עד 10, העיכוב 150, ואת הלחץ ל-200. בדוק את גודל הפולטים עם מיקרוסקופ לפני השימוש. כוונן את הפרמטרים מעט במידת הצורך.
    2. הר זרם נדן אלקטרו-kinetically שאוב מסחרי ממשק (ראה טבלה של חומרים) בחזית ספקטרומטר מסה. מילוי המאגר מאגר מעטפת עם מאגר המכיל 10% (v/v) מתנול ו- 0.2% (v/v) פא במים כיתה LC-MS.
    3. לשטוף את T בממשק עם מעטפת המאגר באמצעות הפעלת לחץ באופן ידני בעזרת מזרק. החוט בקצה 1-מ מיתר של פולט ספקטרומטריית electrospray דרך צינורות שרוול וחבר פולט עם יציאה אחת של Tבאמצעות התאמה. פשוט לשטוף ה- T ידנית שוב עם מזרק מילוי פולט עם המאגר נדן.
    4. להתאים את המרחק בין הכניסה ספקטרומטר המסה ~ 2 מ"מ עם העזרה של המצלמה שהגיע עם הממשק של דיזה של פולט. החל מתח 2 - 2.2 kV-המבחנה מאגר נדן עבור ספקטרומטריית electrospray. התאם את המתח ספריי כדי להגיע ספקטרומטריית electrospray יציב.
      הערה: אם אין ספקטרומטריית electrospray או לא יציבה ספקטרומטריית electrospray נצפית, בדוק את הממשק כדי לוודא שאין אין בועות גדולות בפולט, ה- T, וכן את הצנרור להשתמש בהם כדי לחבר את המבחנה מאגר נדן, ה- T. המרחק בין הכניסה ספקטרומטר מסה כגדולים של פולט יכול להיות מוערך בערך על-ידי השוואתה עם 1 מ מ הקרוע של פולט. המתח ספריי תלויה בגודל של פולט. עבור 20 - 40 µm פולטי, 2-2.2 kV הוא מספיק טוב. זכור תמיד להיזהר בעת שימוש מתח גבוה.
    5. כבה את המתח ספריי ושרשר בעדינות סוף ההפרדה נימי דרך ה- T לתוך פולט חרוט עד שזה לא יכול להיות דחף נוספת. החל בלחץ נמוך (כלומר, 5 psi) בסוף הזרקת נימי בתהליך זה כדי לוודא שישנם אין בועות נים.
      הערה: נימי מחובר אליו T דרך צנור שרוול ומתאים. להתאים את העמדה של סוף נימי חרוט פולט עם העזרה של המצלמה בתוך 500 מיקרומטר. המרחק יכול להיות מוערך בערך על-ידי השוואתה עם 1 מ מ הקרוע של פולט.
    6. לעצור את הלחץ נמוך בסוף הזרקה נים. לשטוף את פולט קצת עם המאגר נדן. שוב, להחיל kV 2-2.2 ספריי מתח כדי לבדוק את הספריי.
  3. הסידור של שיטה CZE דוגמת הזרקת ההפרדה, שטיפה נימי, מפעילה של ספקטרומטר מסה עבור רכישת נתונים
    1. בחר שיטה חדשה תחת התפריט הנפתח קובץ במסך מכשיר עיקרי ליזום שיטה חדשה.
    2. בחר כניסת SV/EV, מגש כדוגמה, לחץ כמו 5 psi, KV 0, וכן משך כ 95 s עבור זריקת דוגמה.
      הערה: המדגם מוזרק לתוך נימי באמצעות הפעלת לחץ. אמצעי האחסון הזרקה מדגם יכול להיות מחושב בהתבסס על הזמן הלחץ, הזרקת באמצעות החוק של Poiseuille. לדוגמה, 5 psi עבור זריקת דוגמה 95-s מקביל בערך 500 nL נפח העמסה לדוגמה עבור הפרדה באורך 1 מ' צינור קפילר (50-µm זהות).
    3. בחר פרמטרים עבור ההפרדה CZE ולהגדיר פרמטרים עבור מפעילה את חדרי קירור והקפאה.
      1. הגדר כניסת KV לחץ כמו 0 psi, מגש כמו מאגר, InV 30, וכן משך כ 4,200 s לצורך הקמת מכשול ההפרדה של המדגם תערובת חלבונים סטנדרטי. הגדר כניסת InV מגש כמו מאגר, לחץ כמו 0 psi, KV 20, וכן משך כ- 6,600 s לצורך הקמת מכשול ההפרדה של המדגם פרוטאום e. coli .
        הערה: המתח הוחל על ההפרדה ניתן להתאים בהתאם למורכבות הדגימה. לדוגמאות חלבון, 30 kV יכול להיות מיושם כדי להאיץ את הניתוח. לקבלת דוגמאות מורכבות, 20 kV מוחל להאט את ההפרדה ולרכוש עוד ספקטרה MS/MS עבור proteoform חתימות.
      2. כוונן את הפרמטרים עבור מפעילה רכישת נתונים תחת אירועי מתוזמן. להגדיר זמן (s) וגם 0.0 סוג 1 ממסר עבור הפעלה בשלב 1; להגדיר זמן (s) 1.0 סוג 1 ממסר עבור Deactivate בשלב 2.
    4. בחר כניסת KV לחץ כמו 10 psi, מגש כמו מאגר, InV 30, וכן משך כ 600 s עבור שטיפה נימי.
    5. שמור את הקבצים שיטה עבור CZE-MS ו- MS/MS ניסויים.
  4. הקמה של MS ו- MS/MS
    1. הגדר את פרמטרי MS ו- MS/MS לניתוח חלבון שלם באמצעות ספקטרומטר מסה מלכודת פאול-יון (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: השלבים יון חיובי ומצב גבוה יותר אנרגיה collisional דיסוציאציה (HCD) עבור פיצול מועסקים.
      1. התאם את הגדרות הקובץ המנגינה: הפעלת חלבון שלם מצב ולהשתמש בלחץ השמנה של 0.2. הגדר העברת יון נימי טמפרטורה עד 320 ° C ואת רמת RF s-עדשה 55.
      2. לבנות את הקובץ שיטת MS ו- MS/MS.
        1. עבור MS מלא, הגדר את המספר של microscans 3, את הרזולוציה כדי 240,000 (ב מ/z 200), שליטה (קובי) הגברה אוטומטית ערך היעד כדי 1E6 את הזמן המרבי הזרקת 50 מילישניות, טווח סריקה ל- 600-2000 מ/z.
      3. עבור MS/MS, השתמש נתונים תלויי רכישה (DDA) עבור היונים האינטנסיבי ביותר שמונה ב- MS ספקטרום. הגדר את החלון בידוד 4 מ/z והאנרגיה collisional מנורמל (פליטות) ל-20%. הגדר את המספר של microscans ל- 1, את הרזולוציה ל- 120,000 (ב מ/z 200) את ערך היעד AGC 1E5, הזמן המרבי הזרקת 200 ms.
      4. הגדר את הסף העוצמה עבור מפעילה פיצול כדי 1E5 ולהגדיר היונים עם מדינה תשלום גבוה יותר מאשר 5 להיות מבודדים שאין בהם פיצול. להפעיל את היוצאים אל תכלול איזוטופים והגדר החרגה דינמי 30 s.
        הערה: ניתן להגדיל את מספר microscans עבור MS/MS 3. במקרה זה, ניתן להשתמש בשיטה Top3 DDA במטרה לצמצם את זמן המחזור.
    2. הגדר חיבור קווי בין תעשיה לסה נ את ספקטרומטר מסה עבור הפעלה אוטומטית של רכישת נתונים. חבר קצה אחד של חוט ממסר קשר 1 A ממסר קשר 1 B בגב תעשיה לסה נ. חבר את הקצה השני של הכבל כדי להתחיל בו להתחיל ב + בצד ספקטרומטר מסה.
  5. CZE-MS/MS ניסוי וניתוח של הדגימות
    1. להחיל 30 kV באמצעות שליטה ידנית את CE הגעתי לסוף הזרקה מדגם, 2-2.2 kV-המבחנה מאגר נדן באמצעות אספקת כוח חיצוני כדי לבדוק את ההפרדה נימי ומסת ספקטרומטריית electrospray.
      הערה: ההפרדה הנוכחית, במקרה זה, היא סביב 8-9 µA אם חומצה אצטית 5% (v/v) משמש את BGE.
    2. להגדיר את רצף רכישת נתונים במחשב ספקטרומטר מסה על-ידי בחירת רצף חדש.
      1. בחר סוג הדגימה לא ידוע וציין שם קובץ ונתיב. מצביעים על השיטה MS כדי לשמש עבור כל דגימה לפעול תחת כלי השיטה.
        הערה: מכיוון שאין במחשב נפרד לשליטה על תעשיה לסה נ, מיקום הדגימה לא צריך לפרט כאן.
    3. להגדיר רצף ההפרדה CZE במחשב לסה נ כדי לציין את מיקום מאגר, מיקום הדגימה ושיטת CZE. כדי להתחיל רצף חדש, בחרו ברצף תחת התפריט הנפתח ניתוח בעמוד הכלי העיקרי.
    4. הפעל שיטת רכישת נתונים במחשב ספקטרומטר מסה תחילה על-ידי בחירת להפעיל רצף (או להפעיל מדגם יחיד פועל). . אז, להתחיל את הרצף CE במחשב תעשיה לסה נ.
      הערה: כאשר המתח ההפרדה מופעל לאחר הזריקה לדוגמה, אות נשלחת מ תעשיה לסה נ ספקטרומטר מסה על מפעילה את חדרי קירור והקפאה. ההפרדה הנוכחית יקטן בתחילת במהלך ההפרדה עקב הערימה של מדגם צומת pH דינמי. לאחר מכן, הזרם מתאושש בהדרגה.

5. מאגר חיפוש הקבצים גלם שנאספו בתוכנת ה-TopPIC

  1. העברת הקבצים .raw, כולל הנתונים MS ו- MS/MS, מהמחשב ספקטרומטר מסה על מחשב ייעודי לחיפוש מסד הנתונים.
    הערה: קבצים .raw אלה עשויים להיות גדולים, דורשת מחשב חזק כדי להגיע חיפוש מהיר במסד הנתונים.
  2. הורדה חבילת ProteoWizard ו- TopPIC במחשב ייעודי לחיפוש מסד הנתונים.
    הערה: סוויטת ProteoWizard ו- TopPIC הן תוכנות קוד פתוח וניתן למצוא באינטרנט (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; סוויטת TopPIC: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt מסדי נתונים משמשים עבור חיפושים במסדי נתונים, ניתן למצוא באתר האינטרנט של UniProt.
  3. להמיר את קבצי .raw .mzML קבצים עם msconvert, כלי המרה בתבנית של קובץ MS ProteoWizard28. ב- GUI של msconvert (MSConvertGUI.exe), לחץ על לחצן עיון ובחר את הקובץ .raw יומרו. בחר mzML תבנית הפלט ולשמור כל האפשרויות האחרות-ערכי ברירת המחדל שלהן. לחץ על הלחצן התחל בפינה הימנית התחתונה של GUI.
  4. להמיר את קבצי .mzML .msalign קבצים בעזרת הכלי TopFD TopPIC סוויטה29.
    1. GUI של TopFD (topfd_gui.exe), לחץ על לחצן הקובץ ובחר את הקובץ .mzML שנוצר בשלב הקודם. לשמור את ערכי ברירת המחדל של הפרמטרים ולאחר מכן, לחץ על לחצן התחל בפינה הימנית התחתונה של GUI.
      הערה: TopFD ממיר אשכולות איזוטרופי קודמן, פרגמנט monoisotopic ההמונים ומזהה תכונות אפשריות proteoform MS1 נתונים על ידי שילוב קודמן איזוטרופי אשכולות עם ההמונים monoisotopic דומה ושעות ההעברה קרוב. שלושה קבצים ייווצר מן TopFD, כולל קובץ ms1.msalign, קובץ ms2.msalign קובץ .feature. קבצי ה-ms1.msalign וה ms2.msalign מכילים deconvoluted monoisotopic המוני ספקטרה MS1 ו- MS/MS, בהתאמה. קובץ ה-.feature מכיל תכונות proteoform אפשרי.
  5. לבצע חיפוש במסד הנתונים עם TopPIC (גירסה 1.1.3) ב- TopPIC suite30.
    1. GUI TopPIC (toppic_gui.exe), לחץ על קובץ מסד הנתונים ובחר מאגר מידע מתאים לחיפוש.
    2. לחץ על הקובץ ספקטרום ובחר את הקובץ ms2.msalign שנוצר בשלב 5.4.1 כקלט. בחר את הקובץ התכונה MS1 ובחר את הקובץ .feature שנוצר בשלב 5.4.1.
    3. הגדר ציסטאין carbamidomethylation (C57) שינוי קבוע עקב טיפול רשות העתיקות.
      הערה: קובץ טקסט ניתן גם ליצור למגוון שינויים קבועים על ידי עורך טקסט. לאחר מכן, ניתן לבחור את קובץ הטקסט באמצעות לחצן הקובץ לצד שינויים קבועים ב- TopPIC GUI.
    4. בחר בתכונה דמה מסד נתונים , תחת הגדרות החיתוך, בחר רוזוולט (שיעור גילוי שווא) בתפריט הנפתח לצד רמת ספקטרום. הגדר פד 0.01 ברמת ספקטרום, 0.05 ברמת proteoform.
      הערה: TopPIC מספק מספר אפשרויות לסינון התוצאות: ספקטרום ברמת רוזוולט, proteoform מרמה רוזוולט, או את שניהם. פד מחושבת בהתבסס על הגישה המטרה-דמה31.
    5. יוצאים Generating פונקציה מסומנת ומוגדרת לשגיאות (ppm) 15.
    6. תחת פרמטרים מתקדם, בחר 2 עבור המספר המרבי של משמרות המוני בתפריט הנפתח. הגדר את המיסה מקסימום משמרת (Da) של שינויים לא ידוע 500 המחוזי להשאיר את הפרמטרים האחרים ערכי ברירת המחדל שלהן, לחץ על לחצן התחל בפינה הימנית התחתונה של GUI.
      הערה: התוכנה TopPIC יוצר שני קבצי טקסט שנוצר. הקובץ עם הסיומת. OUTPUT_TABLE מכיל את רשימת התאמות ספקטרום proteoform מזוהה (PrSMs), ואת האחד עם סיומת. FORM_OUTPUT_TABLE מכיל את רשימת proteoforms מזוהה. עבור כל PrSM, התוכנה מספקת מידע כללי על המשחק, תבנית פיצול שנצפו, פרגמנט מתאימים יונים, מסה שזוהו משמרות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 מציג תרשים של דינאמיות המבוססות על pH-צומת CZE-ESI-MS מערכת המשמשים את הניסוי. פקק ארוך של המדגם במאגר הבסיסי מוזרק מצופים LPA ההפרדה נימי מלא של BGE חומצי. לאחר החלת מתח גבוה I ו- II, analytes באזור הדגימה תהיה מרוכזת באמצעות השיטה צומת pH דינמי. כדי להעריך את ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי להשתמש CZE-MS/MS עבור אפיון proteoforms דגימות חלבון ברזולוציה גבוהה, זיהוי בקנה מידה גדול proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים. דיאגרמה של מערכת CZE-ESI-MS/MS מוצג באיור1. ישנם ארבעה שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, הכנת ציפוי LPA באיכות גבוהה על הקיר הפנימי של נ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים הקבוצתית של Heedeok הונג-במחלקה לכימיה, אוניברסיטת מישיגן, על בחביבות לספק את התאים Escherichia coli הניסויים. המחברים תודה את התמיכה הלאומית המכון כללי רפואי למדעים, במכון הלאומי של בריאות (NIH) דרך גרנט R01GM118470 (ל X. Liu), R01GM125991 גרנט (כדי ל' א' ו- X. Liu).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Fused silica capillaryPolymicro Technologies106815001750 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pelletsMacron Fine Chemicals7708-10Corrosive
LC-MS grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acidFisher ScientificSA48-1Corrosive
MethanolFisher ScientificA456-4Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSigma-AldrichM6514Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acidAcros Organics423805000Highy toxic
AcrylamideAcros Organics164855000Toxic, health hazard
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678Health hazard, Oxidizer
lysozymeSigma-AldrichL6876
Cytochrome CSigma-AldrichC7752
MyoglobinSigma-AldrichM1882
ß-caseinSgma-AldrichC6905
Carbonic anhydraseSigma-AldrichC3934
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
UreaAlfa Aesar36428-36
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632Health Hazard
IodoacetamideFisher ScientificAC122270250Health Hazard
Formic AcidFisher ScientificA117-50Corrosive, Health Hazard
C4 trap columnSepax Technologies110043-4001C3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
AcetonitrileFisher ScientificA998SK-4Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich1066-33-7
Nalgene rapid-flow filtersThermo Scientific126-00200.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cellsK-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered salineSigma-AldrichD8537
BCA assayThermo Scientific23250
AcetoneFisher ScientificA11-1
HPLC system for protein desaltingAgilient1260 Infinity II
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
CE autosamplerCMP ScientificECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interfaceCMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysisBranson101063196Model S-250A
Vaccum concentratorThermo Fisher ScientificSPD131DDA-115

References

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. TopPIC Suite. , Available from: http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/ (2017).
  30. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  31. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  32. Methods - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/ (2018).
  33. Software - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/software/ (2018).
  34. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  35. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  36. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  37. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  38. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140electrosprayproteoformEscherichia coli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved