JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד לטהר חוץ-תאי מיקרו Rna מאמצעי התרבות התא עבור שיפוצים קלים של ספריית RNA ורצף הדור הבא. מחסומים בקרת איכות שונים מתוארים כדי לאפשר לקוראים להבין למה לצפות כאשר עובדים עם דגימות קלט נמוך כמו exRNAs.

Abstract

RNAs חוץ-תאית, מחזורי (exRNA) מיוצרים על ידי סוגי תאים רבים של הגוף, קיימים רבים בנוזלי גוף שונים כגון, פלזמה, סרום, חלב שתן ורוק. תת-קבוצה אחת של אלה RNAs הן הרגולטורים posttranscriptional – מיקרו Rna (miRNAs). להתוות את miRNAs המיוצר על ידי סוגי תאים ספציפיים, מערכות התרבות במבחנה ניתן לקצור, פרופיל exRNAs נגזר ערכה אחת של תאים. הגורמים המופרש של גזע mesenchymal הם מעורבים שיכוך במחלות רבות ומשמשת כמערכת מודל במבחנה כאן. מאמר זה מתאר את התהליך של איסוף, טיהור של RNA קטנים, ספריית לדור רצף miRNAs חוץ-תאית. ExRNAs ממדיה תרבות שונים מ- RNA הסלולר על ידי כך נמוך דגימות קלט של RNA, שלאיראן נהלים מיטביים. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף כדי exRNA קטן רצף ממדיה תרבות, מציג בקרת איכות מחסומים בכל שלב במהלך טיהור exRNA ורצף.

Introduction

חוץ-תאית ופיזור RNAs (exRNAs) הן נוכח נוזלי גוף שונים עמידים לכיוון RNases1,2. שפע גבוהה, היציבות וקלות הנגישות שלהם הם אטרקטיביים להערכה קלינית סמנים אבחון ו prognostic3. מצב התחבורה עבור exRNAs כוללים חוץ-תאית שלפוחית (EVs), שיוך lipoproteins (כגון ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה; HDL) ואת מתחמי ribonucleoprotein (כגון עם מתחמי Argonaute2)4.

תת-קבוצה של exRNAs הם מיקרו Rna (miRNAs), אשר הם קטנים ללא קידוד RNAs של 22 nt המווסתים ביטוי גנים posttranscriptional. לשעבר-miRNAs היו מעורבים תקשורת ורגולציה של הומאוסטזיס תא5. לדוגמה, ה-HDL מספק לשעבר-מיר-223 לתאי אנדותל להדחיק אדהזיה המערכת מולקולה 1 (ICAM-1) ודלקת6. מעניין, מיר-223 גם נתפסת מועבר על ידי שלפוחית חוץ-תאי של לויקוציטים לתאי סרטן ריאות, תכנות אותם לקחת על פנוטיפ פולשניים יותר7. לפיכך, transcriptome של לשעבר-miRNAs מ בנוזלי הגוף השונים, תא תרבות בינוני ישפרו הבנתנו לשעבר-miRNA איתות.

RNA קטנים רצף (seq RNA קטנים) הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי להבין את transcriptomics של RNAs קטן. לא רק דוגמאות שונות ניתן להשוות בין ביטוי באופן שונה RNAs ידוע, אבל הרומן RNAs קטן גם ועוזרת מאופיין. כתוצאה מכך, זה גם שיטה חזקה כדי לזהות באופן שונה ביטוי miRNAs בתנאים שונים. עם זאת, אחד הקשיים של seq RNA קטנים הוא הקושי ליצירת ספריות seq RNA קטנות של נוזלים קלט exRNA נמוך כמו נוזלים מוחי שדרתי, רוק, שתן, חלב, סרום ומדיה תרבות. פרוטוקול TruSeq RNA קטנים הספרייה במכינה מ אילומינה דורש כ 1 µg של RNA סך באיכות גבוהה ודורשת פרוטוקול NEBNext קטן RNA הספרייה במכינה להגדיר מ ניו אינגלנד Biolabs 100 µg ng-1 /8,רנ א9. לעיתים קרובות, RNA הכולל מדגימות אלו הם מתחת למגבלה זיהוי עבור מכשירים UV-vis קונבנציונלי.

לשעבר-miRNAs נגזר נוזלי הגוף הם סמנים prognostic ואבחון פוטנציאל טוב. עם זאת, על מנת לחקור את ההשפעות פונקציונלי או כדי לקבוע את מקור ספציפי לשעבר-miRNAs, מערכות התרבות תאים משמשים לעתים קרובות במקום. גזע mesenchymal (MSCs) נחקרו בהרחבה כי היו מעורבים שלהם EVs שיכוך במחלות רבות, כולל אוטם שריר הלב, מחלת אלצהיימר, שתל מול מארח מחלות10. כאן, נדגים הטיהור של לשעבר-miRNAs מ MSCs הנגזרות מח העצם (BMSCs) והשלבים ספציפיים השתמשו כדי לייעל הבנייה ספריית RNA קטנים, רצף וניתוח נתונים (איור 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: מדיום הגידול של תא גזע Mesenchymal (MSC מדיה) מוכן מראש כמצוין בטבלה של חומרים.

1. תרבית תאים

הערה: ניתן לקבל גזע אנושי mesenchymal מח העצם, רקמת שומן או מקורות אחרים11. לחלופין, ניתן לקנות hMSCs דרך הספק. BMSCs בשימוש פרוטוקול זה נגזר ממח העצם של חולים, קנה מחברה.

  1. הפשרת עונה 1 פרק 106 BMSCs לתוך בקבוקון T175 המכיל 20 מ של מדיה MSC. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולהחליף את המדיה כל 2-3 ימים עד 80% confluency.
  2. לשטוף את התאים עם 5 מ של 1 x PBS וזורקים את PBS.
  3. לנתק את התאים על-ידי הוספת 5 מ של 0.05% טריפסין-EDTA, המקננת את התאים עבור 5 דקות ב 37 º C. הקש על צידי הבקבוק כדי להקל על ניתוק.
  4. להוסיף 15 מ"ל של מדיה MSC כדי להשבית את טריפסין, לנתק את התאים מן השטח, והוא פיפטה למעלה ולמטה כדי להשיג את המתלים תא בודד.
  5. לאסוף את התאים שפופרת 50 מ ל ו ספין למטה בשביל 5 דקות ב x 300 גרם כדי הצניפה התאים.
  6. Resuspend תאי 1 מ"ל של מדיה MSC ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
    הערה: ראשי אנושיים מוח העצם MSCs ב 80% confluency בבקבוקון T175 הוא בסביבות 2 x 106 תאים.
  7. HMSCs צלחת-2,000 תאים/cm2 בתקשורת MSC טריים ב- 5 מבחנות T175. לגדל את התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 ולהחליף את המדיה כל 2-3 ימים עד 5 מבחנות של 90% confluent T175 מבחנות מתקבלים.

2. EVs ואוסף מולקולות RNA-הקשורים

הערה: EV אוסף המדיה הוא הכין מראש (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco [DMEM] עם 10% סרום שור בעובר [FBS] ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין [P/S]). EV אוסף המדיה מדיה MSC נורמלי, אך המוכנים FBS מדולדל EV מסחרי (טבלה של חומרים). זה כדי למנוע זיהום exRNA שור מ FBS, אשר בדרך כלל מכילה exRNAs המשויך EVs ribonucleoproteins, lipoproteins. הכנה קטנה RNA ספריה, נדרשים exRNAs נגזר 5 מבחנות confluent של MSCs כדי לאפשר בניית ספריה.

  1. לשטוף את התאים 3 x עם 20 מ של PBS לכל T175 את הבקבוק. הוסף 20 מ של EV אוסף המדיה לכל confluent T175 הבקבוק של MSCs, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות.
  2. לאסוף את המדיה ואת centrifuge את המדיה עבור 10 min ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס.
  3. לאסוף את תגובת שיקוע, centrifuge את המדיה עבור 20 min ב 2,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  4. לאסוף את תגובת שיקוע, centrifuge את המדיה עבור 30 min ב 15,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. ואז לאסוף את תגובת שיקוע.
  5. להעביר את המדיה ultracentrifuge צינורות, גלולה את exRNAs במשך 90 דקות ב-100,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. רוטור זווית קבועה משמש כאן ומעוגן בגדר לצד של הצינור. לסמן את הצד של המכסה וצייר מעגל בצד הצינור בו צפוי בגדר.
  6. הסר את תגובת שיקוע, יבש הפנימי של הצינור על ידי היפוך הצינור על נייר סופג ולהשתמש חתיכות קטנות של נייר סופג כדי להסיר את הנוזל בתוך הצינור מבלי לגעת התחתון של הצינור. Resuspend בגדר בμl 200 ל- PBS על ידי vortexing ב-30 s ו- pipetting לאורך 20 x.
  7. להעריך את EVs ואת מולקולות עם nanoparticle מעקב ניתוח (נ) (איור 2).
    הערה: EVs של מולקולות יכול להידרש עם nanoparticle מעקב ניתוח (נ), פיזור אור דינאמי (DLS) או הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)12.
  8. לאחסן את EVs ואת מולקולות ב-80 מעלות צלזיוס עד נוסף במורד הזרם ניסויים.
    הערה: אם EVs עומדים לשמש ללימודי פונקציונלי, 20% גליצרול להתווסף כדי להגן עליהם מפני קריעה. ניתן לאסוף את התאים באמצעות הליכים סטנדרטיים במידת הצורך.

3. EVs ואוסף מולקולות RNA-הקשורים תאים

הערה: EVs ו- RNA הקשורים מולקולות ניתן גם שנאסף מהתקשורת התרבות התא ואילו התאים עוברים התמיינות. הדוגמה מתואר בפרוטוקול מתאר בידול osteoblastic ואוסף exRNA ביום 0 ו- 7 של בידול. אם אין בידול נדרשת, לאחר מכן לדלג על סעיף 3, ללכת בסעיף 4.

  1. להכין בידול osteoblastic מדיה (DMEM עם 10% FBS, 1% P/S, β-glycerophosphate 10 מ מ, 10 nM דקסאמתאזון, 50 μM ascorbate-2-פוספט ו 10 מ מ 1.25-ויטמין-D3) טריים בכל פעם.
  2. לאחר MSCs 80% confluent, לשנות את המדיה MSC בידול osteoblastic מדיה.
  3. לחדש את המדיה בידול osteoblastic לאחר 2-3 ימים.
  4. ביום 5 של בידול, להסיר את המדיה ותרחץ התאים 3 x עם 20 מ של PBS לכל T175 את הבקבוק.
  5. הוסף 20 מ של EV אוסף המדיה המכילה 10 מ מ β-glycerophosphate, 10 ננומטר דקסאמתאזון, 50 μM ascorbate-2-פוספט ו- 10 מ מ 1.25-ויטמין-D3 לכל confluent T175 הבקבוק של MSCs. Incubate התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות על מנת להבטיח המשך בידול תוך איסוף EVs של מולקולות.
  6. לאסוף את המדיה על יום 7 והמשך כדי לבודד את EVs ואת מולקולות כמתואר בצעדים 2.2-2.6.
  7. עבור בקרת איכות, זרע תאים 96-ולס או 6-ולס להעריך בידול באמצעות assay פעילות של phosphatase אלקליין (ALP) או עם תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), בהתאמה.
    הערה: איור 3 הוא דוגמה מציג osteogenic התמיינות של התאים.

4. RNA החילוץ ובקרת איכות

  1. הפשרת דגימות שלב 2.8 על קרח. תמצית ה-RNA באמצעות ערכת בידוד ה-RNA (טבלה של חומרים).
  2. Elute את הרנ א מן העמודה המסופק בערכה בידוד ה-RNA (טבלה של חומרים) בμl 100 RNase ללא מים.
  3. לרכז את הרנ א באמצעות אתנול משקעים על-ידי הוספת 1 μL של גליקוגן, 10 μL של 2 מ' pH 5.5 סודיום אצטט μL 250 של אתנול 99% מראש צונן לתוך μL 100 של RNA מטוהרים.
  4. דגירה בדגימות ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כדי לזרז את הרנ א. גלולה את הרנ א מאת צריך שתוציאו בשביל 20 דקות ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: בגדר הוא לבן עקב משקעים שיתוף עם גליקוגן.
  5. הסר את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר RNA עם 1 מ"ל של 75% אתנול. גלולה את הרנ א שוב במשך 5 דקות ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  6. להסיר האתנול ולהשאיר המכסה של הצינור RNA פתוח למשך 5-10 דקות אוויר יבש בגדר RNA. Resuspend בגדר RNA ב μL 7 RNase ללא מים.
  7. בדוק את איכות ה-RNA ואת ריכוז בעזרת מכונה מבוססי שבב אלקטרופורזה נימי כדי לזהות את הרנ א על פי הפרוטוקול של היצרן לפני הבנייה הספרייה.
    הערה: התפלגות גודל נציג של RNA מוצג באיור4.
  8. תמצית RNA הסלולר באמצעות ערכת טיהור מסחרי (טבלה של חומרים) במידת הצורך.

5. ספריית בנייה ובקרת איכות

הערה: ספריות RNA קטנים בנויים באמצעות ערכות מסחריות (טבלה של חומרים) עם התאמות בשל הרנ א נמוכה קלט. ספריית בנייה מתבצע על הבלוק צוננת.

  1. להרגיע את בלוק חימום עבור 0.2 מ"ל המבחנות על קרח, פיפטה 5 μL של RNA מהשלב 4.6 לתוך 0.2 מ"ל נטולת RNase המבחנות על גוש צוננת.
  2. לדלל 3' מתאמי (1:10) במים נטולי RNase בשפופרת 0.2 מ"ל נטולת RNase PCR. להוסיף 0.5 μL של מתאם מדולל ולערבב עם 5 μL של RNA על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x ו צנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינורית.
  3. דגירה המיקס מתאם ה-RNA ו- 3' ב 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב הצנטרפוגה תרמיות preheated ולאחר מכן מקם את הדגימה בשכונה צוננת.
  4. להוסיף 1 μL מאגר מצדו, 0.5 μL של מעכב RNase ו- 0.5 μL של T4 RNA ליגאז (מחיקה מוטציה) לתערובת מתאם ה-RNA ו- 3'. לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, צנטריפוגה בקצרה.
  5. דגירה הצינור ב 28 ° C עבור h 1 ב הצנטרפוגה התרמי preheated.
  6. להוסיף 0.5 μL של להפסיק פתרון לאמבטיה מדגם עם הצינור שוהה הצנטרפוגה תרמי, לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, להמשיך דגירה-28 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  7. לדלל 5' מתאמי (1:10) במים נטולי RNase בשפופרת 0.2 מ"ל נטולת RNase PCR. להוסיף 0.5 μL של 5' מתאם נפרד ללא RNase 0.2 מ ל PCR צינור חום מתאם 5' ב 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב הצנטרפוגה תרמיות preheated, ולאחר מכן מקם את הדגימה על הבלוק צוננת.
  8. להוסיף 0.5 μL של 10 ננומטר ATP, 0.5 μL של T4 RNA ליגאז כדי 5' מתאם צינור, לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, צנטריפוגה בקצרה לאיסוף הנוזלים לתוך החלק התחתון.
    הערה: לשמור את מתאם 5' ברחוב צוננת ככל האפשר.
  9. להוסיף 1.5 μL של מתאם תערובת 5' לדגימת מהשלב 5.6, לערבב בעדינות על ידי pipetting 8 x לאט. דגירה המדגם ב 28 ° C עבור h 1 ב הצנטרפוגה התרמי preheated.
  10. לדלל RT פריימר 1:10 במים נטולי RNase צינור PCR נטולת RNase 0.2 מ"ל. להוסיף 0.5 μL של פריימר RT מדולל הדוגמה מהצעד 5.9, לערבב בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x לאט, צנטריפוגה בקצרה.
  11. דגירה המדגם-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ב הצנטרפוגה התרמי preheated ולאחר מכן מקם את הדגימה על גוש צוננת.
  12. להוסיף 1 μL של 5 x הראשון מאגר סטרנד, 0.5 μL של מיקס dNTP 12.5 מ מ, 0.5 μL של 100 מ מ dithiothreitol (DTT), 0.5 μL של RNase מעכב, 0.5 μL של רוורס טרנסקריפטאז. לערבב בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x לאט, צנטריפוגה בקצרה.
  13. דגירה המדגם ב 50 ° C עבור h 1 ב הצנטרפוגה התרמי preheated להשיג cDNA.
  14. בוזקים cDNA μL 4.25 מים הנדסה גנטית, μL 12.5 של PCR מיקס, μL 1 של אינדקס פריימר, μL 1 של פריימר אוניברסלי. לערבב על-ידי pipetting למעלה ולמטה 8 x, צנטריפוגה בקצרה.
  15. למקם את הדגימה הצנטרפוגה תרמי ולהגדיר הצנטרפוגה כדלקמן: 98 ° C ל 30 s; 15 מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 ° C 15 s; סוף המחזור עם 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
    הערה: הספרייה מוכן שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
  16. לטהר את ספריית ה-RNA על-ידי הפרדת את הספרייה על ג'ל DNA וחיתוך הג'ל (ג'ל מיצוי) בין 140 bp ל-160 bp וחברת eluting הספרייה של הג'ל בעקבות פרוטוקול שניתנו על ידי ערכת בנייה הספרייה.
    הערה: במחקר זה, הספרייה מוכן מהשלב 5.15 טעון על גבי ג'ל מסחרי (טבלה של חומרים) ואת הספריה בין 140 bp ל-160 bp מטוהר בחוץ על ידי ממוכנת DNA גודל fractionator (טבלה של חומרים) על פי הפרוטוקול של היצרן.
  17. להתרכז לשטוף את הספריה משלב 5.16 באמצעות מבוססי עמודה PCR ערכת טיהור (טבלה של חומרים), elute הספרייה 10 μL נטולת RNase מים סוף סוף.
  18. לטעון μL 1 של הספרייה מטוהרת על גבי שבב דנ א (טבלה של חומרים) כדי לבדוק את גודל הספרייה ע פ הפרוטוקול של היצרן.
  19. למהול 1 μL של הספרייה מטוהרים (1:1000) ב- 10 מ מ pH 8.0 טריס-HCl עם 0.05% polysorbate 20 ולכמת את ספריית מאת qPCR באמצעות ערכת כימות ספריית מסחרי לכמת את הריכוז הספרייה באמצעות הסטנדרטים DNA בערכה.
  20. בריכה שווה כמויות של ספריות בהתאם לדרישות של המכונה רצף, רצף על מערכת רצף תפוקה גבוהה.
    הערה: הקמת ספריה הסלולר RNA יכול להיעשות באמצעות ערכות אותו לפי הפרוטוקול הסטנדרטי של ערכות.

6. ביואינפורמטיקה צינור

הערה: זהו צינור ללא צורך במיקור חוץ ואת התוכניות המשמשות כאן מופיעים ברשימה טבלה של חומרים.

  1. לקצץ משם באיכות נמוכה קריאות מתאם רצפים ולהסיר קריאות raw.
  2. למפות את קריאות נקי סוגים שונים של RNAs.
    1. ביאור tRNAs על-ידי מתן אי-התאמות שני כי הרצפים tRNA שונה במידה רבה לגרום misincorporation הבסיס בתדירות גבוהה על-ידי רוורס טרנסקריפטאז.
    2. ביאור miRNAs על ידי מיפוי אנוש miRNAs מ miRBase v21 המאפשר אי-התאמות אפס. מאז miRNAs כפופים A ו U nontemplated 3' סוף תוספות, רצפים שאינן ממופות הם 3' גזוז של עד שלושה A ו/או T nts אחרי אשר ממופים קריאות אנוש miRNAs ו אחרים miRNAs מ miRBase v21 המאפשר אי-התאמות אפס.
    3. ביאור על אחרים רלוונטיים RNAs קטן (snRNA, snoRNA, שמריהו ו Y RNAs) בכך שהוא מאפשר התאמה אחת.
    4. למפות את קריאות לא ממופים הנותרים RNA ארוכה datasets (rRNA, אחרים RNA Rfam, ואת ה-mRNA) כדי להעריך השפלה.
    5. להוסיף את רצפי הגנום האנושי.
    6. להוסיף את רצפי הגנום חיידקי.
    7. לנרמל את הביטוי miRNA באמצעות הנוסחה הבאה: miRNA נחשב / סה כ נחשב של כל miRNAs ממופה) x 106.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה ממוטבת כדי לאסוף exRNA מתרבות MSC עבור רצף הדור הבא. המזימה של זרימת העבודה באיור 1 בצד השמאל, המחסומים בקרת איכות המתאימים נמצאים בצד הימין.

המורפולוגיה של תאי ביום של אוסף עבור מובחן (אי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור רצף הדור הבא של exRNAs המאפשרת ניתוח דיפרנציאלית ביטוי מדגימות קלט נמוך. הקפדה על פרוטוקול ספציפי לבידוד EV ו exRNA חשוב כי שינויים קטנים אפילו (קרי, השלב ultracentrifugation או שינוי בסוג רוטור) יכולים להשפיע על transcriptome, miRNA רמות13,14'. לפיכך, לל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים על מר קלאוס אוטובוס, גב' ריטה Rosendahl-iNANO לסיוע טכני שלהם. תודה מיוחדת ד ר דניאל Otzen להתרת השימוש שלו ultracentrifuge תכופים. מחקר זה נתמך על ידי קרן חדשנות דנמרק (מסדר פרוייקט).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem CellsATCCPCS-500-012Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKitLonzaPT-3001Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBSGibcoA2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTAGibco25200056
T175 FlaskSarstedt833,912
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Phosphate Buffered SalineSigma806552
UltracentrifugeBeckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap AssemblyBeckman Coulter355618
Beckman Coulter Type 60 TiRotor used here
NucleoCounterChemometecNC-3000Cell Counter
β-glycerophosphateCalbiochem35675Components of the osteogenic differentiation media
DexamethasoneSigmaD4902-25MGComponents of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma49752-10GComponents of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3SigmaD1530-1MGComponents of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini KitQiagen217004miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1514Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAChip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification KitsRocheKK4824Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12)IlluminaRS-200-0012Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin PrepSage ScienceAutomated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification KitQiagen28004PCR purification in step 5.17
FASTX_ToolkitCold Spring Harbor LabTrimming low-quality reads in step 6
cutadaptAdaptor removal in step 6
BowtieMapping of clean reads in step 6
SamtoolsTo make the expression profile in step 6
BedtoolsTo make the expression profile in step 6

References

  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184(2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119(2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292(2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498(2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

mesenchymal145RNAsexosomesribonucleproteinsRnaRNAsRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved