באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

Summary

מדידות של התרופה היעד אירוסין הן גורם מרכזי פיתוח תרופות יעיל ובדיקת בדיקה כימית. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול למדידת סמים-יעד האירוסין באמצעות הדמיה תוכן גבוהה לאגדת microplate תואמי וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA).

Abstract

Quantitating את האינטראקציה של מולקולות קטנות עם המטרה חלבון המיועד שלהם הוא קריטי עבור פיתוח תרופות, היעד אימות ובדיקת בדיקה כימית. שיטות למדוד תופעה זו ללא שינוי של חלבון המטרה או מולקולה קטנה הם יקר במיוחד אבל טכנית מאתגר. וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) היא טכניקה אחת לעקוב אחר היעד האירוסין בתאים חיים. כאן, אנו מתארים עיבוד של פרוטוקול CETSA המקורי, אשר מאפשר למדידות תפוקה גבוהה תוך שמירה על לוקליזציה subcellular ברמה תא בודד. אנו מאמינים שפרוטוקול זה מציע מקדמות חשוב ליישום של CETSA עבור אפיון מעמיק של המתחם-יעד אינטראקציה, במיוחד באוכלוסיות הטרוגניות של תאים.

Introduction

בעת פיתוח תרופות חדשות או כימי הגששים חיוני כמה את התצפיות מהדם או פונקציונלי readout למדידות של תפוסת היעד או אירוסין תאים חיים^1,2,3. נתונים אלה נחוצים כדי לוודא מולקולה קטנה יגיע למעשה המטרה הרצויה שלו והן כדי לאמת את ההשערה ביולוגי מאחורי חלבון המטרה בחירת^4,5. יתר על כן, במהלך פיתוח תרופות, דגם מערכות המורכבות הגוברת משמשים כדי לבחור לאמת חוט המורכב לפני ניסויים קליניים. כדי לאשר תרגום של הביולוגיה על פני המערכות פרה, שיטות איתור סמים-יעד האירוסין וליווי ביולוגיה לאורך כל תהליך הפיתוח זה הם קריטיים.

סמים-יעד האירוסין באופן מסורתי מאתגר כדי לפקח על תאים חיים עם מולקולות קטנות unfunctionalized, חלבונים, במיוחד ברמה תא יחיד עם רזולוציה מרחבית^6,7. אחת השיטות האחרונות כדי לבחון האינטראקציה בין יבוצעו בהם שינויים-תרופות, חלבונים בתאים חיים וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA) שבו הנוצרות על-ידי ליגנד ייצוב של חלבון יליד בתגובה אתגר חום הוא כימות^{8, 9,10}. זו מושגת על ידי לכימות חלבון מסיס שנותרו לאחר חשיפה אתגר חום. חשיפה ראשונית של CETSA, תספיג שימשה למטרות איתור. כדי לאפשר הקרנה קמפיינים ופגע triaging של אוספים מתחם גדול יותר, המאמצים כדי להגדיל את התפוקה של ניסויים CETSA יש להוביל להתפתחות של מבחני הומוגנית, המבוססים על microplate מספר^10,11. עם זאת, מגבלה אחת באמצעות שיטות אלה היא כי הם הם המתאימים ביותר כיום לטיפול המורכב ב השעיות תא האיתור דורש פירוק התא, מוביל לאובדן מידע מרחבי. CETSA יכול להיות מיושם ניסיוניים כמו משמרת הנוצרות על-ידי ליגנד בטמפרטורה צבירת תרמי (T_agg) גם ריכוז אחד של המולקולה קטנה או ריכוז ליגנד לייצב את החלבון בטמפרטורה יחיד. האחרון נקרא במינון איזותרמי התגובה טביעות אצבעות (ITDRF) שמסמלת את התלות של מדידות אלה על תנאי ניסויי ספציפי.

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי למדוד את ההתחייבות היעד באמצעות CETSA ב תאים חסיד על ידי זיהוי נוגדנים (אם) immunofluorescent עם מיקרוסקופ גבוהה-תוכן¹². הליך זה מרחיב את הפלטפורמה CETSA המקורי כדי לאפשר את החד-תאיים כימות של היעד האירוסין עם שימור לוקליזציה subcellular. ראוי לציין, בניגוד לדיווחים קודמים רבים, בהליך זה מתחם הטיפול מתבצע בתאים חסיד חי ללא ניתוק משטח או כביסה לפני האתגר חום, וכך לשמר את האיזון מחייב הוקמה שאנו שואפים למדוד¹³. כיום, השיטה מאומתת עבור מטרה אחת חלבון p38α (MAPK14), תא מספר שורות, אנו מקווים כי על-ידי שיתוף הליך זה הטכניקה שניתן להחילה בהרחבה פרוטאום נמס. אנו צופים כי פרוטוקול זה ניתן להתאים לכל אורך הצינור פיתוח התרופה של ההקרנה, פגע triaging דרך כדי ניטור של היעד האירוסין ויוו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. זריעה של תאים

הערה: לקבלת סקירה כללית של זרימת העבודה ראה איור 1. רשימה מפורטת של נוגדנים וחומרים זמינים את הטבלה של חומרים.

1. לפני זריעה של התאים, לקדוח חורים עם מקדח רגיל במסגרת שחורה 384-ובכן הדמיה assay צלחות כדי להימנע מלהיות לכוד מתחת לצלחת מאוחר יותר במהלך השלב חימום בועות אוויר. כדי להימנע חלקיקי פלסטיק כניסה הבארות במהלך שלב זה וכדי לשמור על תנאים סטריליים, לאטום הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק או לכסות את הצלחת לפני קידוח בשכונה תרביות רקמה. בדרך כלל, די 3 חורים בקוטר 3.5 מ מ בכל צד של הלוח (הקצר).
2. הכן ספסל זרימה שכבתית על ידי ניקוי עם 70% אתנול. בעקבות טכניקות סטנדרטי תרביות רקמה aseptic, להסיר מדיה תא הבקבוק או צלחת. לשטוף תאים עם 5-10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל טריפסין הבקבוקון. דגירה. הבקבוק ב 37 ° C עד לנתק התאים A-431. לספור התאים או באמצעות מונה haemocytometer או תא. הכן תא השעיה של 50,000 תאים למ"ל במדיום תרבות.
3. לוותר על 40 µL תא השעיה (ויתור צפיפות תא הסופי של 2,000 תאים לכל טוב) לתוך כל טוב של צלחת assay באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או pipet רב-ערוצי, בהתאם קנה המידה של הניסוי. בקצרה להעביר את הצלחת מצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה על החלק התחתון של הלוח.
4. כדי למזער תופעות צלחת-קצה, לאפשר את התאים להסתפק בחלק התחתון של הלוח assay 20 דקות בטמפרטורת החדר האחורי של מכסה המנוע זרימה שכבתית. אז, במקום את הצלחת במיכל פלסטיק עם מגבות נייר לחה כדי להבטיח אווירה לח. לפני השימוש, נגב את מיכל פלסטיק עם 70% אתנול.
5. תקופת דגירה בתיבת עם לוחית וזמינותו של 2-3 ימים-37 ° C ו- 5% CO₂ ב חממה humidified המקובלת. לפקח על confluency של התאים עד 50-75%, כפי מוערך על ידי בדיקה ויזואלית עם מיקרוסקופ אור.

2. טיפול מורכבות

1. ביום של הניסוי, תשאף האמצעי בכל טוב בעזרת דסקית צלחת. מניחים את הצלחת על צלחת למכונת הכביסה, בחר את התוכנית השאיפה. אם דסקית צלחת אינה זמינה, ואז הנוזל ניתן להסיר על ידי היפוך לצלחת עם טוויסט יד מהירה על מגש הפסולת או כיור. הסרה מלאה של נוזל חיוני עבור ביצועים טובים. כל נוזל עודף מוסר לאחר מכן על ידי שמרחתי עם מגבות נייר.
2. להוסיף 30 µL של תרכובות מדולל לריכוז הופקעו בינוני התרבות התא באמצעות dispensing אוטומטיות או פיפטה רב-ערוצי בהתאם קנה המידה של הניסוי. מבטיחים להוסיף שלילי (דימתיל סולפוקסיד) ושליטה חיובי (ליגנד ידוע) של כמה בארות שהלוח וזמינותו. מאז זה וזמינותו shift תרמי, זה הכרחי כי ריכוז מתחם חורגת קבוע דיסוציאציה להתבונן ייצוב חלבונים. לפיכך, קו מנחה קשה ריכוז מתחם פי 50 - 100 IC₅₀, אבל יותר פירוט תיאורי עבור ריכוזים במתחם נמצאים במקטע דיון.
   הערה: דימתיל סולפוקסיד והסבילות של הקווים התא צריך להיבדק לפני הניסוי.
3. חותם הצלחת assay שטופלו מתחם עם צלחת לנשימה לאטום, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב חממה humidified במשך 30 דקות.

3. לחמם אתגר

1. ראשית, הגדר את המים הרותחים לטמפרטורה הרצויה. שימו לב כי הטמפרטורה הסופית אליה ניתן להגיע בתוך הבארות של צלחת assay יכול להיות שונה הטמפרטורה הסופי באמבט מים. לחקור את ההיסט מראש עם מד חום דמה צלחת, צמד תרמי. זה בדרך כלל לוקח 30 דקות על האמבטיה לייצב את הטמפרטורה הרצויה.
2. כדי לוודא כי הטמפרטורה הרצויה היא להגיע בתוך הבארות של צלחת assay במהלך השלב חימום, להכין צלחת דמה unsealed המכיל באותו אמצעי אחסון בינוני כמו הצלחת וזמינותו.
3. הסר את הצלחות וזמינותו של החממה. . תוריד את החותם לנשימה, לאטום מחדש את הצלחת assay המכילות את התאים שטופלו מתחם ברדיד אלומיניום דבק חזק על מנת להבטיח כי אין מים לדלוף לתוך הבארות במהלך החימום עוקבות באמבט מים. ודא קדיחת חורים במסגרת צלחת נגיש.
4. הניחו את הצלחת assay ואת את הצלחת דמה באמבט מים עם חלקו התחתון של הלוח לכיוון פני המים כדי לאלץ את כל האוויר שנותרו בחוץ מתחת הצלחות.
5. נטר את הטמפרטורה בתוך הבארות של צלחת בובה חדשה באמצעות מדחום צמד תרמי.
6. מחממים את הצלחת assay באמבט מים במשך 3 דקות. מיד העברה assay וצלחת טמבל אחר המים הרותחים עם מזג חדר מים להתקרר למשך 5 דקות. הצלחת assay מוכן כעת עיבוד נוסף.

4. קיבוע

1. לוותר על µL 10 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA) ישירות לצלחת assay באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
   הערה: כמה כתות ומייצבים מסווגים מסרטנים, צריכה להיות מלווה תקנות הבטיחות מוסדיים.
2. האחות הפתרון PFA ולשטוף את התאים עם 300 PBS µL בעזרת דסקית צלחת. מניחים את הצלחת על צלחת למכונת הכביסה, בחר את התוכנית השאיפה.
   הערה: הליך זה מוטבה באמצעות פרוטוקול גלישה על צלחת למכונת הכביסה בו נוזלי הוא בו זמנית בגליל, הוסר. אם הצלחת מכונת. כביסה או הליך דומה אינה זמינה, הצעד כביסה לחלופין ניתן לבצע באופן ידני.
3. ידני שטיפה הליך: הסר את הנוזל מן הבארות על ידי היפוך לצלחת עם טוויסט יד מהירה על מגש הפסולת או כיור. הסרה מלאה של נוזל חיוני עבור ביצועים טובים. להוסיף µL 80 ל- PBS עם פיפטה רב-ערוצי להפוך את הצלחת שוב כמפורט לעיל, חזור על התהליך הכביסה פעמיים. לאחר שעבר כביסה, כתם את הצלחת נגד מגבות נייר נקי כדי להסיר עודפי הנוזל.

5. permeabilization

1. הוסף 20 µL של 0.1% (v/v) NP-40 לבארות עם pipet רב-ערוצי, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשטוף את התאים באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
2. לחלופין, בעת הצורך, החל אנטיגן אחזור פרוטוקול, למשל:
   1. להוסיף µL 20 1% למען חברה דמוקרטית הבארות עם pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ולשטוף לפי אותו הנוהל המתואר לעיל (שלב 4.2).
   2. מוסיפים 80 μL של גליצין 10 מ מ ב- pH 7.2, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. האחות הפתרון גליצין בעזרת דסקית צלחת על-ידי הצבת מכונת כביסה צלחת ובחירה פרוטוקול השאיפה. עיין בהערות 2.1 ו- 4.2 אם דסקית צלחת אינה זמינה.

6. חסימת

1. להוסיף 15 µL של 1% (w/v) אלבומין שור (BSA) ב- PBS הבארות באמצעות מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה, או ללון ב 4 ° C בחותם צלחת רדיד אלומיניום.

7. נוגדן ראשוני

1. האחות הפתרון חסימה בעזרת דסקית צלחת על-ידי הצבת מכונת כביסה צלחת ובחירה פרוטוקול השאיפה. עיין בהערות 2.1 ו- 4.2 אם דסקית צלחת אינה זמינה.
2. להוסיף 10 µL של נוגדן ראשוני מדולל בהתאם 1% (w/v) BSA ב- PBS כדי הבארות באמצעות של pipet רב-ערוצי. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעה, או ללון ב 4 ° C בחותם צלחת רדיד אלומיניום.

8. משני נוגדן

1. האחות הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף הבארות לפי ההליך כמתואר לעיל (שלב 4.2).
2. להוסיף 10 µL של אלקסה 488 נוגדנים משניים מדולל בהתאם 1% (w/v) BSA ב- PBS. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאטום את הצלחת החותם רדיד אלומיניום דבק כדי להגן מפני אור.
   הערה: להגן על צלחת מאור במהלך זה והשלבים הבאים.

9. גרעיני מכתים ומסיכת תא

1. להוסיף 10 µL של גרעיני צבע מדולל עד 0.05 מ"ג/מ"ל ב- PBS כדי הבארות באמצעות של pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות.
2. האחות של נוגדנים משניים והפתרון Hoechst ולשטוף הבארות באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
3. להוסיף 10 µL של מסיכת תא מדולל כדי 200 ng/mL ב- PBS כדי הבארות באמצעות pipet רב-ערוצי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
4. האחות הפתרון מסכת תא ולשטוף הבארות באמצעות ההליך אותו כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
5. לוותר על µL 60 ל- PBS כדי כל הבארות באמצעות צלחת למכונת הכביסה, מתקן ריאגנט בצובר או של pipet רב-ערוצי, לאטום הצלחות עם רדיד אלומיניום דבק.

10. תמונה רכישה וניתוח

1. ללכוד תמונות ב- imager תוכן גבוהה באמצעות ערוצי פלורסנט 3: דאפי (387/447), ה-GFP (472/520) ו TexasRed (562 624). רוכשים 4 תמונות לכל טוב באמצעות המטרה X 10. שימוש אוטומטי לייזר פוקוס אוטומטי ולהחיל binning 2 במהלך הרכישה. לאחסן תמונות כקובצי tiff בקנה מידה 16 סיביות, אפור יחד עם מטה-נתונים.
2. ניתוח תמונות בעזרת תוכנה הזמינים. זיהוי גבולות התא באמצעות אלגוריתם תא מניה עם דאפי (גרעין) TexasRed (ציטופלזמה).
3. לחלץ את העוצמה הממוצעת עבור כל אורכי הגל רכשה עבור ניתוח נתונים נוסף.
4. לחשב את הגורם-Z כדי להבטיח את היציבות של וזמינותו.
5. לחשב מייצב % באמצעות הנוסחה הבאה: 100 * (1-(עוצמת טוב – שליטה שלילי ממוצע עוצמת טוב) / (ממוצע עוצמת אינטנסיביות שליטה-ממוצע חיובי שליטה שלילי)). הנה שליטה שלילי דימתיל סולפוקסיד והוא בקרה חיובית החומר הפניה. מאז ייצוב המרבי בין תרכובות יכול להשתנות, למעשה להיות גדול מ הפקד חיובי עבור עיקולים ITDRF, עוצמות המזערי והמרבי מייצב עבור כל המתחם משמשים לפעמים במקום ערכי העוצמה של הבארות שליטה .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול המתוארים באיור 1 מתאר את זרימת העבודה הבסיסי עבור הפעלת מבחני CETSA על תאים חסיד עם זיהוי של חלבון מסיס שנותרו על ידי הדמיה תוכן גבוהה. זרימת עבודה זו ניתן להתאים בקלות בכל שלבי ההתפתחות assay על-ידי שינוי הפריסה צלחת של תרכובות או ריאגנטים¹⁴

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כפי שפורט בסעיף התוצאות, ישנם מספר שלבים מרכזיים להליך. ראשית, חשוב לזהות ריאגנט זיקה באיכות גבוהה. אנו ממליצים על הקרנת ספרייה קטנה של נוגדנים עבור כל מטרה רצויה. לאחר שנבחר נוגדן ראשוני, חשוב גם לאמת את המערכת עבור מספר אתרי קישור שונים של חלבון היעד במידת הצורך. הקרנה הנגד של תרכובות מפרי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System