JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המחקר של ביולוגיה אמפיבי מספק מידע רב ערך על תהליכים הרבייה, פיסיולוגיים, embryological והתפתחותיים הנוהגים אורגניזמים של קבוצות מטקתיות רבות. כאן, אנו מציגים מדריך מקיף על מתודולוגיות שונות, כי ניתן להשתמש כדי ללמוד שליטה בשחלות וניטור דו-חיים.

Abstract

שליטה וניטור השחלות בדו-חיים דורשים גישה רבת פנים. ישנם מספר יישומים שיכולים לגרום בהצלחה התנהגויות רבייה ורכישת גמטות ועוברים עבור מחקר פיזיולוגי או מולקולרי. דו-חיים תורמים לאחד-12:45-שליש מחקר בעלי חוליות, והעניין בהקשר זה הוא תרומתם לידיעת הקהילה המדעית של תהליכי הרבייה ופיתוח embryological. עם זאת, רוב הידע הזה נגזר ממספר קטן של מינים. בזמנים האחרונים, ההחלטה של דו-חיים ברחבי העולם דרשה התערבות גוברת של השימור. ההתאוששות בשבי ומושבות הביטחון להמשיך לצוץ בתגובה לסיכון הכחדה לעשות מחקר קיימים יישומים קליניים לא יסולא בפז הישרדות ורבייה של דו-חיים שנערך תחת הטיפול האנושי. ההצלחה של כל אוכלוסיה בשבי מבוססת על בריאותו ועל הרבייה והיכולת לפתח צאצאים בני קיימא המעבירים את הייצוג הגנטי המגוון ביותר של המינים שלהם. עבור חוקרים וטרינרים, היכולת לפקח ולשלוט בפיתוח השחלות ובריאות היא, לכן, הכרחי. המוקד של מאמר זה הוא להדגיש את טכניקות שונות הרבייה בסיוע שניתן להשתמש בהם כדי לפקח, איפה המתאים או הכרחי, שליטה בתפקוד השחלות בדו. באופן אידיאלי, כל בעיות הרבייה והבריאות צריך להיות מופחת באמצעות הטיפול השבוי הנכון, אבל, כמו עם כל בעל חיים, סוגיות של בריאות ופתווגיות הרבייה הם בלתי נמנעים. טכניקות לא פולשנית כוללות הערכות התנהגותיות, בדיקה חזותית מישוש ומדידות מורמטריות לחישוב מדדי מצב הגוף ואולטרסאונד. טכניקות פולשנית כוללות זריקות הורמונליות, דגימת דם וניתוח. שליטה בשחלות ניתן לתרגל במספר דרכים בהתאם ליישום נדרש מינים של עניין.

Introduction

דו-חיים מזוהים זמן רב כמודלים ביולוגיים ורפואיים חשובים על ידי מגוון רחב של דיסציפלינות מחקר. נתונים שהושגו על ידי לימוד מינים מסוימים כגון קסנופוס זריזה ו -X. " הצפרדע המנומרת " (לפני רנא) פיפינס(לשעבר ראנה) והאקלילית (אמליסטומה מקסינום) הוחלו על מספר מינים אחרים של בעלי חוליות, כולל בני אדם. וטרינרי, הגידול וסיוע טכניקות הרבייה כי התפתחה מלמידה אלה דו חיים אחרים לספק סיוע אלה המוטל עם פיתוח טיפול מוצלח, תחזוקה וקיימות של אוכלוסיות נדירות בשבי מיכל בן , מיכל השני , מיכל שלוש , ד.

הריבית היא צובר לשימוש במקביל של באתרו ולשעבר שימור גישות מבוססות כדי להפוך את הגאות של הכחדה עבור רבים בסיכון מינים אמפיבי1,2. מאמר זה מספק את המתודולוגיות זמין כיום כדי לפקח ולשלוט על תפקוד השחלות האמפיבי במיני מודל של אנאנס ו Caudates. בנוסף, טכניקות קיימות לטיפול בפתולוגיה הרבייה המשותפת של החזקת ביצים מוצגת.

כמו בקבוצות מטקמיים רבים, בקרת השחלות האמפיבי כרוכה בסדרה של אינטראקציות מסונכרנות היטב בין הסביבה והפיזיולוגיה. הטמפרטורה ואת photoperiod (המכונה אותות הפרוטמליים) מפוענח על ידי העין ואת המוח שבו הם מומרים במהירות לתוך גנטי, תהליכים הורמונליים מעגליות (האותות האולטימטיבי)3,4. שיטות ניטור ושליטה תפקוד השחלות מכוסה במאמר זה כוללים טכניקות פולשנית ולא פולשנית. טיפול מוסדי בעלי חיים והשתמש הוועדה (IACUC) מחקר ודרישות ההוראה להגדיר טכניקות שאינן פולשני כמו אלה שיגרמו מינימלי לכאב פיזי או מצוקה נפשית לא דורשים תרופות להקלה על הכאב5. כאן, טכניקות שאינן פולשנית כוללות בדיקה חזותית ומישוש, תצפיות התנהגותיות, הערכות מורמטריות ואולטרסאונד. להיפך, הטכניקות של איסוף דם, הורמון הממשל ניתוח (ovariectomy ריתת והסרה של ביצים שנשמרו) מסווגים פולשנית מאז הם עלולים לגרום לכאב או אי נוחות מסוימים ודורשים הרדמה או טיפול בסמים שלאחר פרוצדורליים.

לא פולשנית טכניקות ניטור השחלות ניתן לשלב בקלות את שגרת הטיפול היומי עבור דו-חיים השבויה ביותר. בהתאם למין, השחלות יכולות לעיתים קרובות להיקבע על ידי בדיקה חזותית פשוטה (צפרדע זכוכית). במקרים אחרים, מישוש עשוי להעיד אם נקבה הוא מאפיר. מדדי מערך גוף שונים (bci) כגון משקל, אורך בצורת החוטם האפור (SUL), אורך החוטם (svl) ואינדקס מסה סטנדרטי (smi) זמינים לחיזוי הנוכחות או העדר של ביצים4,6,7, 8,9. עם זאת, טיפול צריך להילקח עם פרשנות של תוצאות כמו רוב לא לשקול גיל, גוף צורה או הרכב (למשל, מים הנשמרים לעומת מסה השחלות או שומן)6. אבחנות הרבייה סופי ניתן להשיג באמצעות אולטרסאונד עם יותר ידע מעמיק שנצבר בנוגע לפיתוח ביצה הזמני של מחזור השחלות4,7. אולטרסאונד גם מספק אמצעים כדי לאשר ולנטר פתווגיות הרבייה משויכים תנאים פיזיולוגיים4,8.

בנוסף למתן מידע בנוגע למצב בריאותי, דגימת דם יכולה לשמש למדידת הורמוני הרבייה. אם הורמון הפרופיל הוא המטרה הסופית, חשוב למנוע השפעות הקשורות ללחץ שעשוי לבלבל את הנתונים סטרואידים מערכתית. בעוד כלי ניטור פוטנציאלי חזק, יש עוד להיות מחקר הוכחת תגובות endocrinological מולדים למינהל הורמון אקסוסוגני במין אמפיבי כלשהו. דם ניתן לקחת בבטחה ממספר אתרים; בצפרדעים זה כולל וריד הבטן הגחוני, מקלעת לשוני, וריד הירך והלב9,10. ב הזנב, הדם נאסף מתוך הווריד האחורי הגחוני. דרגת האיפוק, כמות הריסון הדרושה, הצורך בהרדמה, בעדינות האיבר המכוון, ובגודל הבעל החיים הם גורמים להיחשב בעת בחירת טכניקת איסוף עבור החולה האמפיבי. מאמר זה יציג את הטכניקה של איסוף הדם מן הלסת הראשונה או musculocutaneous ווריד של צפרדעים כפי שתוארה במקור על ידי Forzan ואח '9.

שליטה השחלות הוא מיני ספציפי, וככזה, פרוטוקולי ההורמונים צריך להיבדק ואופטימיזציה. מלבד העונתיות והקשורים הורמון מחזורי במחזור, שליטה השחלות עשוי גם להיות קשור הדוק לגיל, הזמן בילה בשבי וחשיפה לניהול הורמון חוזר, אשר יש מעט מידע בספרות11 , מיכל בן 12 , 13. יישום של טיפולים הורמונים לעורר התנהגויות רבייה, ייצור המשחק, התבגרות וההטלה הפכה להיות גישה נרחבת דיווח לפתרון בעיות הרבייה הקשורים בשבי4, . שמונה,14,15,16 מכיוון שהמנגנונים השולטים ברבייה בעלי החוליות נשמרים במידה רבה, ישנם מספר הורמונים, נוירופפטידים ותרופות מסחריות המשמשות לשימוש תרופתי בקבוצות מיונים אחרות שיכולות לשמש גם באופן אמין במספר מין אמפיבי (שולחן 1). גונדוטרופין משחרר הורמון (gnrh) ו גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) (או וריאציות ממנו, כלומר, pmsg ו-א)17,18, או בנפרד או בשילוב, שימשו בהרחבה בשבי אמפיבי תוכניות רבייה כולל: בוריאל הדרומי של ההר הסלעי (anaxyrusבוריאס בוריאס)4,19,20; הקרפדה, צפרדע גופר sevosa, רנא (לנגורן ואח ', לא פורסם)7; חוף המפרץ ווטרדוג 20; , קרפדת ויומינג. אנקסרוס באקס18 צפרדע השוורים, רנא קטביאנה21; הקרפדה האמריקנית, אמריקה האמריקאית אנאקיורוס22; הצפרדע הדשא, לימסט-מאניאנסיס23; הקוטקי, Eleutherodactylusקי24; הקספוס, קספוס לאוארט25; את פטריית הרעל של גונתר, פסיידופרנה גואנטיי26; הצפרדע הצפון-מנומר, ליטוטים פיפינס; הצפרדע הארגנטינאי, מקושטת בצפרדעים ; הצפרדע הקרה של קראנבאר, ג. קראנלי; האדמה האמריקנית-צפרדע, Odontophrynus אמריקאנוס27; וסלמנדרה האש (Salamandra)228. הורמונים סטרואידים, כמו הפרוגסטרון (P4), מדווחים בדרך כלל פחות אך הפגינו יעילות טובה באמצעות ביוץ ומיקום ההטלה במינים מסוימים של אנאנים16,18,29. Prostaglandins (במיוחד prostaglandins 2-alpha (pgf2α)) מעורבים בביוץ יחד עם קורטיקוסטרואידים30,31,32,34 ולהגיע לרמות גבוהות במהלך שלב31של הovulatory.

ב לימודי חוץ גופית, pgf2α הוא השראה חזקה של ביוץ31, בעוד vivo זה יכול לגרום ההטלה של ביצים שנשמרו רנא מוסקוסה4,30,32. תמציות יותרת ההיפופיזה הם גם השראות יעיל של הביוץ15,16,34; עם זאת, חששות סביב biosecurity ופוטנציאל העברת המחלה הם לעתים קרובות הרתעה מושבות הרבייה בשבי כאשר בהתחשב גישה זו35.

החלק האחרון של מאמר זה פרטי הליכים כירורגיים ומספק גישות חלופיות כדי להרחיב את מחקרי השחלות או סיוע ברזולוציה של הפתווגיות הרבייה. כריתת הovariectomies מבוצעת בדרך כלל דו-חיים כדי לקבל אוציטים למחקר embryological. עם זאת, הוא יכול גם לספק תרופה לשמירת ביצים כאשר אפשרויות אחרות נכשלות. למרות הליך זה הוא פולשני, המחייב הרדמה מלאה חתכים כדי לחשוף את הגושים ביצה, זה לא דורש המתת חסד. יתר על כן, לאחר כריתת הערמונית חלקית, בעלי חיים יכולים לעשות החלמה מלאה ולהמשיך להיות פעיל מחדש לאחר ניתוח8,36.

הפרוטוקולים המתוארים להלן המתאר את שיטות פולשנית ולא פולשנית של שליטה וניטור השחלות ב אנאנס ו Caudates. המינים הספציפיים שנבחרו להמחיש טכניקות באנאנים כוללים R. רירית ו -X. זריזה. נטוריוס מאקולוסוס, נ. בארי, נ. אלבאמזיס, ו -A. מקסינום מהווים את המינים המשמשים לתיאור דומה בטכניקות של הקותמרים.

Protocol

הליכים סלמנדרה אושרו על ידי גן החיות של סינסינטי & גן בוטני (C, g) טיפול מוסדי והשתמש הוועדה (IACUC) פרוטוקולים 11-106, 13-110, 14-133, ו 15-138. כל ההליכים הצפרדע והקרפדה אושרו על ידי סן דייגו גן החיות העולמי (SDZG), טיפול מוסדי והשתמש הוועדה (IACUC) פרוטוקולים: 15-001, 16-005 ו 18-003.

הטיפול בבעלי חיים אושר על ידי הוועדה האתית של המוזיאון הלאומי לתולדות הטבע (פריז) (מוזיאון הלאומי היסטייר נטורל-מקסיקו דה ז'Plantes (MNHN)), בהתאם להנחיות המוסדיים והלאומי (ועדת השירות המאוחד, הוראת האיחוד האירופי, 2010/63/האיחוד האירופי, החלטת ההסכם לא. C75-05-01-2 עבור האמנה האירופית לבעלי בעלי חוליות המשמשים למטרות נסיוניות ומדעיות אחרות. כל הפרוטוקולים המשמשים במחקר זה אושרו תחת התייחסות מספר 68-037.

1. לא פולשנית טכניקות ניטור השחלות

  1. בדיקה חזותית ומישוש
    1. החזיקו את אנמין הנשי באחת משלוש הדרכים המתוארות להלן.
      1. אבטחו את רגלי הצפרדע או הקרפדה באמצעות הטבעת והאצבע הקטנה, תומכים בצד הקטן (בטן) של גוף הצפרדע באמצעות המדד והאצבע האמצעית והצד הגחוני עם האגודל (איור 1A).
      2. החזיקו את הצפרדע או הקרפדה ביד הדומיננטית עם אגודל על הבטן ושאר האצבעות מאבטחים את גב החיה. השימוש ביד הבלתי שלטת מניח את הבטן של בעל החיים, להרגיש אם יש החלקה העורי (איור 1B).
      3. הנח את הבטן של הצפרדע או הקרפדה על כף היד, זרועות קדמיות מכוסה מעל האצבע המורה ואגודל על גבו העליון.
    2. מכיוון שהקותמרים מימיים לחלוטין בטבע, בצעו בדיקה חזותית באחת משתי השיטות המתוארות להלן.
      1. מעבר בעל חיים למיכל נפרד של 4 L המכיל מי טנקים. החזיקו את המיכל (המכסה מאובטח) למעלה ולהאיר פנס בצד התחתון כדי להמחיש את הנוכחות/העדר של ביצים.
      2. בMS222 (0.5 g/L; טריקיין מתיונין, באגירה עם 0.5 מ' נחקו3). לאחר האינדוקציה, לסובב את החיה על גבו ולבחון את הבטן.
  2. הערכות מורמטריות
    1. לאנס מעוז
      הערה: הרדמה אינה נדרשת.
      1. באמצעות מחוגות, למדוד את החיה מקצה הפה, לאורך מרכז הגוף לקצה הזנב כדי להשיג SUL ו-SVL (איור 2A, B).
      2. אריזה של מכולה מפלסטיק בקנה מידה מדויק דיגיטלי. מניחים את בעל החיים במיכל מגובה ומשקלו (איור 2C).
      3. לבעלי חיים גדולים יותר, כמו צפרדעי השוורים, או בעת קבלת משקולות בשדה, השתמשו בקנה מידה תלוי (איור 2D).
      4. כמו במינים רבים של אנמין, הבחנה את הנקבות המבוגרות של הזכרים בגודלם הגדול יותר והעדר האגודלים (איור 3).
      5. חשב את מצב הגוף, כהערכה בסיסית של הבריאות הכללית על-ידי הנוסחה הבאה:
        האינדקס של פולטון: K = אורך המסה3
        הערה: האינדקס של פולטון משתמש במאזן מימדי של אמצעי אחסון הקשור למסה ולאורך שבו 3 הוא המעריך המתייחס לגודל מסה ואורך isometrically.
    2. מתמרים
      1. . לפני הצבת החיה הלא מורדם בפנים לטפל לא להחדיר מים עודפים (איור 2D) ולפעול במהירות כמו בעלי חיים מפרישות ריר כתגובה לחץ להיות מרוסן.
      2. השג מדדים מבוגרים על ידי השתק אנשים בתנוחה ישרה בתחתית שקית פלסטיק מחדש הניתן לאיטום או במיכל פלסטיק נפרד שיכול להכיל מורחבות הרחבה.
      3. מדדו את אורך הגוף בעזרת מחוגה (איור 2E).
      4. מדידת מזונבת מקצה של חוטם לקצה של זנב (svl) כדי לפקח על הצמיחה.
  3. תצפיות התנהגותיות
    1. להתבונן פיזית בעלי חיים בזמן אמת או להשתמש במצלמת וידאו כדי להקליט התנהגות.
    2. הקלטת תצפיות על בעלי חיים לסווג התנהגויות ולבנות ethogram (איור 4).
    3. סיווג התנהגויות רבייה
      הערה: איור 4 מציין סוג אחד של התנהגות הרבייה שנצפתה ב-אנאנס.
  4. אולטרסאונד
    הערה: מתמר אולטרה סאונד של בחירה, במקרה זה, 7.5 mHz ליניארי או multi-תדירות (10-6 mHz) מיקרו קמורה, מומלץ Necturus ו 10 mhz בדיקה ומסיס מים, ג'ל ללא מלח עבור R. מוסקוסה. ביצוע אולטרסאונד על סלמנדרות עשוי לדרוש הרדמה (ראה סעיף 1.5 להוראות).
    1. לאנס מעוז
      1. לבצע אולטרסאונד על מוסקוסה באמצעות שני אנשים (איור 5a).
      2. האדם הראשון: החזיקו את החיה בידו הדומיננטית והחילו את מסיס המים, ג'ל חופשי מלח לבטן החיה.
      3. האדם השני (אולטרה-sonoגראפר): לקחת את 10 מגה הרץ בתוך היד הדומיננטית ולהחיל אותו על הבטן מוודאים לעשות קשר טוב בין הגשוש ו ג'ל.
      4. השקופית פנימה מתחת לבור הזרוע לכיוון מרכז הבטן של החיה באמצע כדי להמחיש את כל השחלה.
      5. במיוחד סונגרפר: להשתמש ביד לא דומיננטי להקפיא מסגרת ללכוד את התמונות הרצויות באולטרסאונד.
      6. לסווג את השלב של מחזור השחלות על ידי מערכת הדירוג שהוקמה עבור הסוג4 (שולחן 2, איור 5B-F).
      7. לשטוף כל ג'ל מחוץ לחיה בסוף ההליך.
    2. מתמרים
      1. העברת מיכל לא מורדם ל 4 מיכל מלבני L מלא 2 ליטר של מי טנקים.
      2. מזער את תנועת בעלי החיים על ידי הפעלת אורות החדר ו/או ספל יד אחת מעל ראשו של בעל החיים.
      3. מקמו את התמר במרחק של 1-2 ס מ מקיר הגוף.
      4. לאתר את הלב ברמה הגגלית קו האמצע כדי forelimbs ולאחר מכן לעבור מתמר קרוב ולבדוק את רקמת השחלות7.
      5. לסווג את הנקבות לפי ציון מערכת שהוקמה עבור הסוג4 (איור 6a, B, C).
      6. להשיג מדדים מדויקים של ביצים בשלב באמצע עד מאוחר-gravid על ידי לכידת תמונות כאשר הגוף של בעל החיים הוא בזווית אל התמר (כלומר, לא ליניארי, אבל בקשת קלה; איור 6B). אחרת, זקיקי החפיפה מקשים עליך להבדיל בין גודל ביצה ליחיד.
  5. אינדוקציה והתאוששות מהרדמה
    1. לאנס מעוז
      1. בMS222 (0.5 g/L; טריקיין מתיונין (0.5 M נחקו3) כמתואר בעבר.
      2. השתמש ברפלקס הצתה כאינדיקטור עיקרי למידה שבה החיה הפכה להיות מורדם. אובדן מוחלט של רפלקס ממחיש מצב של הרדמה עמוקה.
      3. הסר את בעל החיים מן ההרדמה המבוססת על מים (MS-222) לאחר רפלקס הצתה אובד.
      4. מניחים את החיה על רטוב (עם מגבת נטול הרדמה עם מים מנטול כלור).
      5. הקפידו לשמור על החיה לחות במהלך ההליך הכירורגי כולו.
      6. צינורות דו-חיים קטנים עם קטטרים גומי אדומות, שפופרות לא כבולות או כבלי אזיקים קלאסיים מאובחנות ללא מנפח את השרוול.
      7. לספק זרימה נמוכה של חמצן (0.5-0.75 L/min) עם 0.5-1% isofלוריאן.
      8. אבל לשמור על זרימת. החמצן לדקה אחת
      9. שוטפים את החיה ומשכלים את החיה ביסודיות במים מנטול הרדמה למשך 2 דקות.
      10. לשים את החיה בכמות רדודה של מים דה כלור או על מגבת רטובה.
      11. הערכת ההתאוששות של בעל החיים על ידי משיכת בעדינות של הגפיים האחוריות להאריך. כל התכווצות של האיבר מציינת את רפלקס הנסיגה.
      12. עקוב אחר מחוונים אחרים של שחזור כגון התנועה (גרון) ורפלקס הצתה.
      13. לשקול את האמפיבי התאושש כאשר כל הרפלקסים חזרו, ואת שיעורי הלב והנשימה חזרו לערכים טרום הרדמה.
    2. מתמרים
      1. בשנת MS222 (0.5 g /L של טריקאין מתיונין, באגירה עם 0.5 M נחקו3, (MS222) במיכל מלבני 4 L.
      2. מניחים אבן אוויר (1 אינץ ') ומשאבת האוויר לתוך המיכל ולהפוך אותו לזרימה מתמדת כדי לספק חמצן הולם.
      3. כאשר פונקציית הגפה ורפלקס הגישה אבדו, להסיר את החיה מן ההרדמה המבוססת על מים (MS-222) ולשים את החיה על רטוב (עם מים ללא הרדמה מנטול כלור) מגבת.
      4. לשמור על העור וגיל לחות עם בקבוק לחיצה של מי טנקים.
      5. כדי לשחזר את בעל החיים, מקום בזהירות אותו בצד למטה ב 4 L פלסטיק מכולה מלאה 2 L של מי טנקים עם אבן האוויר.
        הערה: השחזור מתחיל עם גיל מהבהב, ואחריו את היכולת להזיז את זנבו ולהניע קדימה ולבסוף תנועה תפקודית של גפיים.
      6. החזר את בעל החיים למיכל הדיור המקורי שלו ולנטר היטב את 24 ה-h הבא.
        הערה: שיטות אחרות של הרדמה לחיות דו-חיים ואלה מתוארות ברייט וויטאקר8.

2. שיטות ניטור פולשנית ושליטה

הערה: הליך זה הותאם מ-Forzán et al.10.

  1. החזיקו את הצפרדע ביד הדומיננטית, ומייבשים את הצד החזק של הצפרדע במטלית סטרילית או גזה.
  2. יבש את הפנים כדי למנוע מהדם לפזר את העור יותר מדי.
  3. הכנס את המחט (26 G 1/2 "ו -27 G 1/2"), עם שיקוע פונה כלפי מעלה, דרך העור שבו העור הרים סביב העין ואת הרכס הלסת העליונה נפגשים כדי ליצור את הנקודה של משולש (מיתאר צהוב) (איור 7A) גישה לבנה facialis ליד האחוריים של האוראוברוב
  4. ניקוב וריד הפנים מתחת לעין הימנית ומעל רכס הלסת העליונה, החל בין 1-2 מ"מ חזרה מקו האמצע של העין (איור 7A).
    הערה: לצפרדעים קטנות יותר (תחת 20 גר'), הזיזו את נקודת הכניסה קרוב יותר למיקום מתחת לקו האמצע של העין.
  5. לאפשר לכוח הכבידה לסייע לזרימת הדם לתוך הצינור. דם צריך לזרום מיד לאחר ניקוב (איור 7B, ג).
  6. בסימן הראשון של זרימת הדם, מניחים את קצה הצינורית המיקרומטוקריט באתר הניקוב ואוספים 1-2 מיקרומטוקריט מלאים בצינורות של דם וצינורות מניחים לנפחים המתאימים לאוסף (איור 7B, C).
  7. אם הדם לא זורם בקלות, או עוצמת הקול נמוכה מאוד, להזיז את החדרת המחט מעט או להכניס את המחט לתוך הצד השני של הפנים.
  8. להפסיק דימום על ידי לחיצה גזה בחוזקה לאתר הניקוב עבור לפחות 20 s.
  9. השאירו את הצפרדע מחוץ למים במשך 10 דקות כדי לאשר את האתר ניקוב לא נפתח מחדש.
  10. השתמשו במחט חדשה ובצינורות מיקרומטוקריט חדשים לכל צפרדע שנדגמו.

3. אינדוקציה הורמונלית

  1. הכנה להורמונים
    1. הכינו זריקות הורמונים מיד לפני השימוש כדי להבטיח אפקט מקסימלי.
    2. בחר הורמון מהבחירה המפורטת בטבלה 1.
    3. לקבוע את ריכוז ההורמון להיות מוזרק באמצעות μL או mL/g של משקל הגוף16.
    4. לדלל את ההורמון באחד הבאים: מים, פוספט באגירה מלוחים (PBS), תמיסת מלוחים של התמיסה האמפיבי (סארס) או תמיסת מלח.
    5. אין לחרוג נפח הזרקה של 200 μL עבור צפרדעים במשקל 30-70 g ו 300 μL עבור צפרדעים במשקל 80-110 g (התבוננות אישית)16.
    6. לצורך החזקת החיה במהלך מינהל הורמונלי של כל בעל חיים החל 10-100 g, השתמש בכל השיטות המתאימות להחזקה המתוארת בסעיף 1.1.
  2. לאנס מעוז
    1. חישוב הריכוז הנדרש לכל אדם באמצעות גרם לחישוב משקל גוף (g/משקל הגוף).
    2. רק לפני ההנהלה, מהווים מחדש. מדלל בחירה סטרילית
    3. ודא שלא נותרו בועות במזרק לפני ההזרקה.
    4. החזיקו את בעל החיים בצורה מאובטחת ביד הלא-דומיננטית והחזק את הזריקה בידו הדומיננטית.
    5. ניהול הזרקה על פי מפרט הורמון. הזריקות הנפוצות ביותר באנאנים הם תת עורית, פנים הצפק או שרירי פנים (איור 8).
    6. מנהל זריקות IP בחלק התחתון של הבטן או בחלק התחתון של הצד האחורי של הגוף ליד הרגל האחורית (איור 9).
    7. ניהול זריקות פנים-שרירים רצוי לתוך הרגליים האחוריות.
  3. מתמרים
    1. מהווים מחדש את הורמון הבחירה במים סטריליים על פי גרם לכל שיטת משקל הגוף המתואר לעיל.
    2. במקרה של Necturus, להשתמש במינונים של 1.7-2.3 μg משקל גוף/g.
    3. הסר Necturus מחדר הרדמה ומקום על משטח 45 ° מכוסה עם כירורגי.
    4. מקמו את בעל החיים. עם הצבעה למטה
    5. גישה רביע אחורי של הבטן (caudal של הרגל האחורית) בזווית 15-20 °. להיזהר לא להחדיר אוויר לתוך המזרק.
    6. הכנס (IP) באמצעות מזרק אינסולין ו 27-30 גרם מחט.
    7. הכנס את ההורמון באמצעות מזרק אינסולין ו 27-30 גרם מחט.

4. כירורגיה

  1. הכנה כירורגית כללית ופרוצדורה
    1. כדי לשמור על הליכים אספטי, השתמש בניקוי וילונות פלסטיק סטרילי כדי לבודד את האתר כירורגי. להפחית אידוי על ידי שמירה על העור המקיף לח.
    2. מויסטן כל חומר שייצור קשר עם העור של בעל החיים עם מים סטריליים. לעשות חתך העור עם להב מספר 15 או מספר 11 האזמל.
      הערה: שילוב של פלדה קרה, ניתוחי רנטגן או לייזר דיודה. הומוסטזיס בהליך מדמם קל ניתן להשיג על ידי אלקטרוקאוטר או לייזר דיודה.
    3. השתמש כותנה משופעת חניתות או מכשיר כדי לאפשר את היישום של לחץ מקומי לכלי קטן לעקוב אחר אובדן דם.
    4. השימוש כותנה משופעת חניתות או מכשיר כדי לנהל חללים סגורים קטנים במקום ריבועי גזה רגיל.
    5. השתמש במיקרו-מכשירים, כגון כלי לרפואת עיניים, עם עצות קטנות ביותר, כאשר מבצעים ניתוח על בעלי חיים שמשקלם פחות מ-1 ק"ג.
    6. השתמש בפלסטיק, שמירה עצמית מחדש (למשל, מפסק הכוכב הבודד) כדי להתאים בגדלים שונים של חתכים.
    7. השתמש בטרקטורים לצורך שימוש בחתכים קוקומאריים.
    8. השתמש במכשור הגדלה במידת הצורך לביצוע ניתוח בחולים קטנים יותר.
      הערה: משככי כאבים נדרשים עם כל הליך כירורגי בדו-חיים. כישלון בניהול כאבים הולמים במהלך הניתוח שויך להחזר מושהה של פונקציות נורמליות. יתר על כן, כאבים בפוטנציאל ההשפעות של תרופות הרדמה (שולחן 3)34.
  2. לאנס מעוז
    1. פעם אחת X. זריזה כבר מורדם כמתואר בשלב 1.5.1, למקם את החיה בתוך שכיבה (איור 10א, ג).
    2. הכן את השדה כירורגי על ידי ניגוב גזה סטרילי לח עם לדלל povidone-הפתרון יוד (1/10) באתר עבור 10-15 s או 0.75% כלורהקאיטין פתרון באתר כירורגי עבור לפחות 10 דקות לפני הניתוח35.
    3. הפוך את החלק 3 מילימטר העור החתך באמצע קוסום (בין הכתפיים ואת cloaca) עם קו מודגש אחד עוזב חתך נקי באמצעות לא 15 או no. 11 אזמל.
      הערה: ניתן להשתמש בלייזר דיודה גם עבור חתכים בעור.
    4. העלה את קרום הבטן, לבצע וחתך ולנתח בזהירות באמצעות לא 15 או no. 11 אזמל. (איור 10B, ד).
    5. משכי את החתכים הקואומאריים בעזרת העפעף (או כל ציוד מתאים).
    6. בלו חלק ממסת ביצה מבלי לנפח את כלי הדם.
    7. עבור כריתת משתנים מוחלטת, צרוב את כלי הדם שמסביב על ידי אלקטרוקאולטרי או דיודה לייזר (איור 11).
    8. באמצעות תפר מונופינט, סגרו את החתך הצ עם דפוס תפר מקוטע.
  3. מתמרים
    1. . פעם אחת מקסינום מורדם, מניחים אותו בתוך שכיבה לרוחב ימין, עם האיבר האגן השמאלי פשוט להציב נגד בסיס הזנב.
    2. הכן את שדה כירורגי aseptically על ידי הצבת גזה סטרילית לח עם לדלל povidone-יוד פתרון (1:10) באתר עבור 10-15 s. לחילופין, השתמש גזה סטרילי ספוג ב 0.75% כלורהקדין ומקום באתר כירורגי לפחות 10 דקות לפני הניתוח (איור 12a)36,37 .
    3. ציירו קו בין הכתף לגפיים האחוריות כדי לחלק את הגוף לשלושה חלקים שווים (איור 12B).
    4. לעשות את החתך בין החלק השני והשלישי.
    5. החזיקו בשריר הבסיס והתרחקו ממעיים קואוממית.
    6. בעדינות לכפות המטונתונים קטנים דרך השרירים הקולומאית ולתוך חלל קולוממית.
    7. משכי את החתכים הקואומאריים בעזרת העפעף (או כל חומר מתאים) (איור 12C).
    8. עבור כריתת משתנים מוחלטת, צרוב את כלי הדם שמסביב על ידי אלקטרוקאולטרי או דיודה לייזר (איור 12D).
    9. באמצעות תפר מונופינט, סגרו את החתך הצ עם דפוס תפר מקוטע.

תוצאות

בחינה מורמורזה ורבייה

ויזואליזציה של מעמד הרבייה הנשי בדו-חיים משתנה בהתאם למין. השיטה האפקטיבית ביותר היא אולטרסאונד; עם זאת, מינים מסוימים עשויים להראות דרגות שונות של השקיפות של העור שלהם (איור 13A, B, C). בדיקה חזותית יכול לעתים קרובות בבירור להמחיש את ההבדלים בין gravid לבין נקבה לא gravid כאשר העור הוא חצי שקוף כפי שנצפתה ב n. האלבאמזיס ו -n. מאקולוסוס (איור 13 א, ב); או שקוף מומחש על ידי הצפרדע זכוכית (איור 13C). צבע העור הכהה הבחין על הבטן של N. בארי אוסרת על הערכה זו להתבצע. ב -R. מוסקוסה, העור אינו שקוף אך הבדלים בולטים יכולים להיות מזוהים בין נקבות בהשוואה לאלה שההטלה לאחרונה משום שהעור רפוי, והחיה נראית רזה יותר (הקו הצהוב) בהשוואה ל נקבה כי הוא gravid (הקו הכחול) (איור 13D). עם ניסיון המטפל יכול להכיר את עצמם עם ההבדל בין נקבה גדולה לבין gravid אחד, אבל אישור של שלב gravid ידרוש אולטרסאונד. מדדי מסת הגוף בדו-חיים יכולים להיות מחושבים באמצעות מספר נוסחאות אך היישום שלהם ככלי ניבוי עבור רבייה הוא שויכוח. במקרה של ר' מוסקוסה, הקשר בין האינדקס, הבריאות ומצב הרבייה של פולטון, נותר ברור.

התנהגות הרבייה ואולטרסאונד

התוצאות שלנו מראות כיצד לאפיין התנהגויות רבייה ב -R. מוסקוסה לחיזוי ההטלה (איור 4). מספר שלבים הנמשכים מכמה שעות עד מספר שבועות כוללים, חיזור שבו זכר פעיל רודף נקבה (איור 4A), הזכר עולה ומתפסי בחוזקה על גבו של הנקבה, כינה אמפיקסוס (איור 4a). לאחר המפשט, הזוג יכול להישאר אמפילקסוס עבור 1 – 5 שבועות והזוג יציג התנהגויות אחרות בנוסף ampלקסוס. Amplexus קסוס היא התנהגות פעילה מאוד הכוללת את הזכר לסחוט את הנקבה באופן רך שאיבה (איור 4C); הנקבה נעה מסביב ומתחילה להציג התנהגויות מעמד יד לסירוגין (איור 4 ד, ה); וקרוב יותר לזמן ההטלה, הנקבה, בתנוחת כף יד, תישען מול משטחים שהיא יכולה לתקוע ביצים על בעוד הזכר משאבות את הבטן במרץ (במקרה זה ניתן גם להתבונן הנקבה לשפשף את הבטן כלפי מטה מתחת את זרועה בורות לעבר הקלואקה. זו עשויה להיות דרך מכנית שבה לדחוף ביצים למטה ההטלה (איור 4F, G).

מחקר זה ממחיש כיצד אולטרסאונד יכול לספק מידע שעליו לוודא מעמד הרבייה ב נקבה R. מוסקוסה ונטוריוס . ארבעה שלבי פיתוח מיוצגים ב -R. מוסקוסה (איור 5c, D, E, F) ומאופיינים באופן דומה בנטוריוס 4 (איור 6a, B, C). בנוסף, ביצים שיורית יכול להיכשל להיות גורשו מוביל החזקת ביצים (איור 5g, איור 15a, ב). שלב 1 מראה שחלה ישירות לאחר ההטלה שבה קשה לדמיין זקיקים (איור 5C). שלב 2 מיוצג באמצעות מראה של נקודות הדגניים (פלאקס לבנות) התפזרו ברחבי השחלה (איור 5D). שלב 2 ו-3 מיוצגים על ידי יותר, הנקודות המעוגניים מעוגל עם מרכזים כהים המייצגים מדיום לזקיקי גדול (איור 5E, F). משנת 2013-2017, נטוריוס הנקבה השבויה נבדקו על בסיס חודשי בדיקת אולטרה סאונד. במהלך כל הבחינות הוקצו ציון ציונים בהתאם לקריטריוני הרבייה שנקבעו לסוג (שולחן 2). אחוז הנקבות לפתח ביצים חדשות בכל שנה בממוצע 88.2 ± 3.01% (טבלה 5). בזמן שפיתוח הביצית היה גבוה, ההטלה לא הובטחת (איור 16). רוב הנקבות שעברו ההטלה הופקד על השלמה מלאה של ביצים, בעוד כמה אנשים הפקידו רק חלק מהביצים שפותחו. אלה R. מוסקוסה ו necturus הנקבות עם שמרו ביצים במקביל עם רווח נוזלים בחלל הגוף היו מוגדלים ויזואלית עם טלאים אדומים על העור עקבי באמצעות כלי דם פרץ (איור 14a, B ) . מידת החזקת הנוזלים ניתן להעריך עוד יותר באמצעות אולטרסאונד (איור 15B). בשני המינים, שמרו ביצים שעברו שמעברה או שלקחו מראה הדוק יותר (איור 14C, D, איור 15a).

מינהל הורמון

בהתאם לעומק של סוג ההזרקה את זווית ועומק של המחט ישתנו. עבור רוב הזריקות את העומק של המחט לא צריך להיות יותר מ 1 -2 מ"מ עמוק כאשר עובדים עם מינים כגון R. מוסקוסא אבל ישתנה בזווית החדירה. הזרקת פרוגלנדין נדרשת החדרת מחט פנים-שרירית (im) בזווית ב 90 °, לתוך הרגל האחוריות של R. מוסקוסה בזמן הזריקות פנים-צפק (ip), עם עומק דומה לזריקות פנים-שריריות, היו מנוהלים באזור ה חלל קולוממית ב 45 ° (איור 10). המינהל של האמפיפלקס לא היתה השפעה משמעותית בהגדלת מספר הביצים שהופקדו על ידי נשים שטופלו בהורמון הורמונלי בהשוואה לפקדים (P = 0.547), וגם לא היו כל הבדלים במספר העוברים אשר ביקעו (P = 0.673) או שרדו לראשן (P = 0.629) (טבלה 4). בדרך כלל, אחוז הנקבות ההטלה ירד מ 80% ב 2011 ל 28% ב 2014. מספר הנקבות ההטלה ב 2015 היה גבוה באופן משמעותי מ 2013 (P = 0.0002), 2013 (P = 0.0001) ו-2014 (P = 0.0026) אבל לא ב2011 (P = 0.0885), מחדש את הרעיון כי נשים ממין זה לא להתרבות מדי שנה וכי פרוטוקולים הורמונליים דורשים reaffirming . אני מבין עבור הנקבות R. מוסקוסא עם סימנים של החזקת ביצים, זריקות פנים שריריות של pgf2α היה 60% שיעור הצלחה בגרימת גירוש של ביצים ביטול. עם זאת, ב 1 של 5 הנקבות הזריקו, PGF2α לא היה מספיק כדי לגרום לגירוש מלא וכמה ביצים נשארו בתוך הנקבה עד העונה הרבייה הבאה. שבעה עשר הנקבות הנטוריוס קיבלו לידי (gnrh) ו -13 קיבלו הזרקה מזויפת של מים סטריליים כדי לשמש כשליטה (שולחן 5). בסך הכל, שבע נקבה Necturus (n = 4 אלבאמזיס, n = 2 באלה, n = 1 maculosus) המשיך ההטלה 11 מצמדים מלאים שיוחסו שני gnrh שטופלו (n = 6) ושליטה (n = 5) אנשים. שלוש נקבות (n = 2 באלה, n = 1 מאקולוסוס) ההטלה חמש מצמדים חלקיים (איור 13). תופעה זו לא היתה משויכת לטיפול הורמונלי אקסוגני כמו שלוש הנקבות שליטה באופן דומה הופקד מצמדים חלקיים (שולחן 5). מיקום ההטלה התרחש במשך חמש שנים (3/31-5/7) במהלך ה37 (שולחן 5). לא היה כל הבדל (P = 0.194) בשערי ההטלה בין לבין לבין לבין לבין לבין הטיפול (41 ± 13.08%, טווח 17-67%) ושליטה (66.75 ± 11.79%, טווח 50-100%) נקבות. לנשים שהופקדו ביצים בממוצע 7.44 ± 1.41 (טווח 3-13) ימים שלאחר ההזרקה. בהינתן הטבע המים המלא של מינים וחוסר יכולת לרסן באופן ידני ללא הרדמה היה צורך להבטיח רמת הרגעה מתאימה לפני ביצוע זריקות הורמון IP (ראה סעיף 3.2 להוראות על הרדמה).

איסוף דם, הרדמה וניתוח

טכניקת דגימת הדם במאמר זה נלקחה מפורזאן ואח '. 201310 והוכיחה דרך יעילה לאסוף דם מ -R. מוסקוסה עם החלטיות ומתח מינימלי. באמצעות צינורות microמטוקריט, כ 35-45 μl של פלזמה או סרום ניתן לאסוף לכל 70 μL של דם שלם (איור 7). נפח אוסף מירבי ב -R. מוסקוסה היה 1 צינור מיקרומטוקריט מלא לכל 10 גרם של צפרדע, עד 4 צינורות לכל צפרדע עבור צפרדעים 40 g ויותר. זה היה נפח אוסף שמרני של 0.7 mL לכל 100 g, 70% של המלצה מקסימלית של 1.0 mL לכל 100 g (המותאם מאלאנדר ו פריי, 2008)13.

הרדמה וניתוח בדו-חיים מדווחים לעתים נדירות אך חשוב לציין כי מינונים ויעילות ישתנו באופן ספציפי מינים. ב להפציץ למשל, MS222 יש השפעה נמוכה מאוד, אפילו עם מינונים גבוהים (1 g/L) ואילו ב קרפדות בוריאל, Anaxyrusבוריכ בוריאס, 1 g/l הוא מהיר (עניין של דקות) ולטווח ארוך (3 + h) (Calatayud, התבוננות אישית). ב -R. מוסקוסה, ההרדמה דורשת מנות שדווחו לקידוח ובעלת השפעה וזמני החלמה דומים. לא נדרש בדרך כלל לפני ההרדמה משום שהגרון שלהם נשאר סגור בחוזקה אפילו בהרדמה כללית. עם זאת, אם נחשב הכרחי, במיוחד אם הליך ההרדמה היא לכלול ניתוח celomic, בעלי חיים יכולים להיות מאוהים 24 שעות לפני הרדמה.

במהלך הניתוח, רפלקס הצתה הוא האינדיקטור העיקרי שהחיה הפכה להיות מורדם. רפלקס הצתה הוא היכולת והמידה של הקלות שבה חיה יכולה לחזור לתנוחה זקופה לאחר שהניחה על גבו. אובדן הרפלקס מרמז על. שלב קל של הרדמה מישור כירורגי מצוין על ידי אובדן רפלקס הנסיגה אשר כולל משיכת קלות על האיבר כדי ליישר אותו ואת החיה לא להיות מסוגל לסגת אותו7. ניתוח הרבייה אין מכשולים מוחץ וחולים אמפיבי בעיקר לרפא היטב הסובלנות אובדן דם יותר מאשר בעלי חוליות גבוהות יותר. כירורגיה צריכה להימשך במהירות, לאורך כ -15 דקות מתחילתו ועד סופו. שלבים צריך להיות מתוזמן בערך כדלקמן: < 1 דקה עבור החתך הראשוני ו < 2 דקה עבור החדרת כריתת ומחק, < 2-3 דקות עבור בידוד לכל שחלה ו< 1 דקה עבור תפר או לצרוב את העור תפר < 4 דקות. זמן ההתאוששות הכולל לאחר הניתוח עם פרוטוקולים MS222 הם כ 45 דקות, אבל זה יכול להיות מינים ספציפיים. בשנת A. בורבוראס ו R. זמני התאוששות של מוסקוסה יכולים להיות ארוכים יותר, עד 1 – 2 h. בעת ביצוע ניתוח, יש לנקוט בטיפול כדי להימנע מפגיעה בריאות, במערכת העיכול או בשלפוחית השתן, ולא לפגוע בבלוטות המאקרוסקופיות, בלבבות הלימפה ובכלי הדם, במיוחד בווריד האמצע. בהתאם לעונה, הנוכחות של גופים שמנים גדולים יכול להפוך ויזואליזציה של איברים אחרים קשה. לאחר שהיה ער בעליל, תגובות של בעל חיים לגירוי גפיים, כגון התנגדות למתיחה עדינה של איבר גב או מהבהב כאשר האזור סביב העין הוא גירוי (התבוננות אישית), מסווגים כתגובות נסיגה. רפלקס הצתה יחד עם מחווני שחזור אחרים, כולל, רפלקסים משיכה ותנועות מלבני, הם אינדיקטורים חשובים של התאוששות.

ניהול
שם משותףיניםורמוןהליךמתחם הטרמהמינון הטרמה שדווחמספר מינונים לטרמהעיתוי (שעה לפני מינון ovulatory)מורכבים לovulatory/ההטלה הסופינותפניה
קרפדת פורטו-ריקנילמור PeltophryneGnRH & hCGIPhCG1.5 IU/g2hCG-48GnRH HCG GnRHa + hCG0.2 μg; 4 IU; 0.5 μg + 4 IUCalatayud et al לא פורסם
צפרדע הר צהוב רגלייםרנא מוסקוסהאמפיפלקס, LutIPGnRHa (des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9-GnRH)0.4 μg/g124GnRH + MET1 x 0.4 μg/g + 10 μg/gCalatayud et al, 2018
PGF2αIMPGF2α5 ng/g148PGF2α5 ng/g
קרפדה מצויהאנקסרוס בוריאס בוריאסhCG, GnRHIPhCG3.7 IU/g296, 24hCG + GnRHa13.5 IU/g + 0.4 μg/gCalatayud et al, 2015
צפרדע צפון קריקטאקוריס קרפיטהאמפיפלקסנוסף למים (10 מ"ל)לאלא0נהGnRH + MET0.17 μg + 0.42 μg/μlסניידר ואח ', 2012
צפרדע הנמר הצפוניליטוטים מפיפינסאמפיפלקסIPלאלא024GnRH + MET1 x 0.4 μg/g + 10 μg/gטרודו ואח ', 2010
צפרדע בקרניים ארגנטינאיכורנייםאמפיפלקסIPלאלא024GnRH + MET1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g
צפרדע בעלת קרנייםקרנורייםאמפיפלקסIPלאלא024GnRH + MET1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g
צפרדע יבשהאמריקאנוס OdontophrynusאמפיפלקסIPלאלא024GnRH + MET1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g
דאופקי גופררנא sevosahCG, GnRHIPhCG3.7 IU/g296, 24GnRH + hCG1 x 0.4 μg/g + 13.5 IU/gגרהאם ואח ', 2018
מצויEleutherodactylus קידגים, עופות, יונקים & GnRH (ד-אלה, דה-ואללה, ת. ע.), hCGSC. אני מבין  מלון היכל; . אני מבין מלון זה; hCGלא0נה. אני מבין  מלון היכל; . אני מבין מלון זה; hCG7μg, 33 μg; 28μg; 7μg, 20μg; 5, 10, 15, 20 μg; 165 IUמיכאל ואח ' 2004
הפטרייה של גונתרפסבדו גרעיניGnRHמיכל ברכה0.4 μg/g126GnRHa עם או בלי פריים0.4 μg/gשאילה 2010
מאמתים צפרדעהפסדסופית מאשרלוקרויןSCלוקרוין1 μg126לוקרוין5 μgביירן & סגילה, 2010
צפרדע צפון מאמתיםפסדפרפרינה פנגאילאניגנהה גנrh (ד-אלה, דה-מלין, ת. ע.)TAלאלא0נהמיכל ברכה0.5-2.0 μg/gסגילה ואח ', 2017
חוף המפרץהנטוריוס הסותם[des-Gly10, D-Ala6]-ליילב-לחות מלוחים אצטט מלח מימהIPלאלא0נהמיכל בגין100 μg/500 μLהסטופס ואח ', 2014
צפרדע בדרום פעמון/צפרדע מקרקרתליטוריה raniformisדס-Gly10, D-Ala6SCלאלא0נהדס-Gly10, D-Ala650 μgמאן ואח ', 2010
הקרפדה של פאולראנאקרוס בנוליאניGnRH, hCG, P4IPhCG3.7 IU/gבראון ואח ', 2006
אקאווטל (סלמנדרה מקסיקנית)אמייסטומה מקסימפנוןממריץ זקיק הורמוניםIMלאלא0נהFSH400IUטרוטייה וארמסטרונג, 1974
הצפרדע האפריקנית שקרעהקסנופוס לאסטזה& hCG P4הוספת מים; IPPMSG, hCGמרcec, 2016
סלמנדרה נמראמסטומה תיגריניתhCG, LH
קרפדת ויומינגאנאקרוס בקסטריhCG, GnRHa, P4IPhCG + GnRHa100 IU + 0.8 μg172hCG + GnRHa100 IU + 0.8 μgבראון ואח ', 2006
צפרדע הנמר הצפוניליטוטים מפיפינסתמצית יותרת הבלוטת (PE), P4, טסטוסטרון (T), corticosterone [ג], אמפיפלקס, דופריסיים (D)SC, IPלאלא0נהPE, PE + T, PE + P4, PE + C; אמפיפלקס, GnRH + D~ 100 IU (לאחר) ב-1 מ ל; PE + 0.002 μg/μL; PE + 0.01 מ"ג/50mL; PE + 0.1 מ"ג/50mL; 0.4 μg/g + 10 μg/g;  0.4 μg/g + Dרייט, 1961; פורט, 2000; טרודו ואח ', 2013
צפרדע יבשהLymnodynastes מטנסיסתמציות יותרת הבלוטת, hCG, GnRHa, PZIPמיכל ברכה0.9-1.2 μg/g + PZ 10 μg/g120PE PE + hCG; GnRH + PZPE vol; PE vol + 100 IU hCG; GnRH (0.9-1.2 μg/g) + PZ (10μg/g)בסדר, 2018
צפרדע ירוקה ופעמון הזהבליטווניה אוראהGnRHIPמיכל ברכה10 μg172GnRHa + hCG20 μg + 300 IUבסדר, 2018
צפרדע גדולה מסורגיםמיקפרזה fasciolatusמ& hCG PMSGSCPMSG, hCG50 IU & 25 IU; 1x100 IU2 2PMSG-144 & 96;  מיכל ה, hCG-24hCG100IUבסדר, 2012
עבור פרוטוקולים ומינים נוספים ראה רייט ויטאקר, 2001

טבלה 1: מין אמפיבי וחלק מההורמונים האקסוגניים שנבדקו עליהם כפי שדווחו בספרות. גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG); הורמון משחרר גונטרופין (GnRH); הורמון משחרר הורמונלי (לוקיב); האותיות m, a ו-f מייצגות ' יונקים ', ' העופות ' ו'דג '; גונדוטרופין בהריון מארה (PMSG); פרוגסטרון (P4); הורמון מגרה זקיק FSH); תמצית יותרת הבלוטת (PE); טסטוסטרון (T); corticosterone (ג). היריבים דופמין המפורטים כוללים: דופריסיים (ד); פיימוזידה (עמ'); טוקלופראמיד מיד (MET). אמפיפלקס הוא שם שניתן לתרכובת המורכבת מחומר GnRH ו-Metoclopramide27. Lucrin הוא מסחרית GnRH אגוניסט זמין עם המרכיב הפעיל להיות אצטט Leuprorelin. ד , מיכל סבן , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 26 , בן 27 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45

כיתהמעמד הרבייהתיאור/
0לא גראפה. אין ביצים גלויות
1הגרף המוקדםביצים גלויות (1-2mm בגודל) אין קו הד ברור המשויך ביצה.
2גרף מינוניביצים 2-3mm בגודל, קו אקו שונים הקשורים עם כל ביצה.
3גרף מאוחרביצים 4-5mm בגודל, קווי האקו עדיין גלוי, מסומן עלייה במראה anechoic של ביצה.
4שמרו ביציםדרגות שונות של חומר הדגניים המצויים במבנה ביצה פנימי, לוקחים צורה אמורפית. חלקם עשויים להיות הד מאוד משויך החזקת נוזלים בחלל הגוף.

שולחן 2: ציון מערכת המשמש לציון מצב הרבייה של הנקבה השבויה Necturus ו רנא מוסקוסה על ידי בדיקת אולטרה סאונד.

סמיםמינון ומסלולהערות-הפניה
בופרינורפין50 מ"ג/Kgמחקר ניסיוני בסלמנדרה אדומה מזרחית הבחין (Notophthalmusמנומר). כאבים צריכים להינתן. לפני הניתוח (Koeller, 2009)
Butorphanol1 – 10 מ"ג/ק"ג (IM או תאיים). יש כאלה שונים מסוימים מומלץ להתחיל ב 1 מ"ג/ק"ג.
Butorphanol0.5 mg/L (אמבטיה)מחקר ניסיוני בסלמנדרה אדומה מזרחית הבחין (Notophthalmusמנומר). (Koeller, 2009)
פנטניל1 מ"ג/ק"גכאבים > 4 שעות, נגד נלוקסן (סטיבנס, 1997)
מלוקסיעם0.1 עד 0.2 מ"ג/ק"ג (IM)(מיניטר, 2011)

שולחן 3: פרוטוקולים לחוסר כאבים בדו-חיים.

רנא מוסקוסה
שנה20142015
לא ♀1818
פיתוח ביציות61%94%
שליטה ♀46
אמפיפלקס ♀47
הודעה ממוצעת על היום10.510.9
קצב מיקום ההטלה (אמפיפלקס)22.20%33.33%
תעריף מיקום ההטלה (בקרה)22.20%38.88%

שולחן 4: השוואה בין הפרמטרים הרבייה בין אמפיפלקס שטופלו לעומת שליטה נקבה בשבי רנא מוסקוסה ב 2014 ו 2015.

נקטורייוס sp.
שנה1234מיכל 5
לא ♀67777
פיתוח ביציות83%100%86%86%86%
♀3מיכל 5360
שליטה ♀22306
יום הפוסט-לאחר לאובידיוסמיכל 575.5 (טווח 3-8)13n/a
שיעור ההטלה60%2067%17n/a
תעריף מיקום ההטלה (בקרה)50%50%100%n/a67%
* n = 1 ♀ אין פיתוח ביצה

שולחן 5: השוואה בין הפרמטרים לרבייה בין לוקן (בנין) -טיפול ושליטה (מים סטריליים) נקבה בשבי נקטורייוס משלושה מינים במשך חמש שנים של זמן (2012-2017).

figure-results-23391
איור 1: שלוש שיטות של החזקת צפרדע. (א) נוהל 1. (ב) נוהל 2. (ג) נוהל 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-23819
איור 2: הערכות מורמטריות. (א, ב) SVL/SUL (C, D). משקל, ר. מוסקוסה וד. נקטוריוס. (ה). מדידת גודל עם מחוגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-24301
איור 3: הדימורפיזם המיניים מאופיינת ברפידות אגודל בוגרים של גברים מוסקבה בהשוואה לנקבות. (א) נקבה (ב) זכר. הפאנל התחתון מראה את אורכו של זכר לעומת נקבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-24838
איור 4: אפיון התנהגויות רבייה המובילות לתנוחת ההטלה בח מוסקוסה (א) חיזור. (ב) אמקסוס. (ג) זכר סוחט נקבה בעוד באמקסוס. (ד, ה) . נקבה במעמד יד (F, G) . התכווצויות שבטן ומיקום ההטלה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-25422
איור 5: אולטרסאונד מבוצע על R. מוסקוסה A-B עם מעמד הרבייה לפי שלב התפתחותי4. (א, ב) ביצוע אולטרסאונד על רנא מוסקוסה. (ג) כיתה 0. (ד) כיתה 1. (E) כיתה 2. (ו) כיתה ג. (G) כיתה 4 (ovulated ושמרו ביצים) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-26070
איור 6: תמונות אולטרה סאונד של Necturus. (א) כיתה 1. (ב) כיתה 2. (ג) כיתה 3 ביצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-26520
איור 7: אוסף הדם בח מוסקוסה. (א) אוסף דם על ידי שתיל את הורידים האחוריים את הווריד הפנים ממש מעל לקו הלסת באמצע המסלול. (ב, ג) דם משתחרר אל פני השטח של העור ונאסף עם צינור נימי היפרניזד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-27047
איור 8: שיטות הזרקה בדו. בהתאם לעומק של סוג ההזרקה את זווית ועומק של המחט ישתנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-27434
איור 9: הזרקה הורמונלית ב-R. מוסקוסה. אינדוקציה של מיקום ההטלה על ידי טיפול הורמונלי של רנא מוסקוסה נקבות הזריקו עם הperitoneally-הפנים האמפיפלקס. ניתן למצוא שחלות בחלל הקואומית נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-27926
איור 10: הכנה לפני הניתוח. (א) הכנת כירורגיה של האזור הכירורגי באמצעות מדלל povidone-תמיסת יוד (1/10), הטרכיצפאלוס מחדש. (ב) חתך האזמל הנקי באמצעות חתך העור של קסנפוס לייזר, או (C), בחיתוך בלייזר-דיודה, ליטוטים. (ד) הימנע מפגיעה בעורק האמצע והגחוני, הטראכילוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-28600
איור 11: כריתת האואסטקטומיה בקסנפוס לאוזה. (א) לחשוף ולהזיז גופים שמנים גדולים כדי לחשוף את מסת הביצה. (ב) בבלו חלק ממסת ביצה מבלי לנפח כלי דם. (ג) מצרוב את כלי הדם המקיפים על ידי אלקטרוקואטרי לניתוח מוחלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-29167
איור 12: הכנה טרום-כירורגית וכריתת הערמונית בתוך מקסינום. (א) גזה סטרילית ספוגה ב-0.75% כלורהקטין החלה על האתר הכירורגי (ב). קו בין הכתף לגפיים האחוריות מחלק את החיה לשלושה חלקים שווים והנקודה הכחולה מסמנת את האתר על החתך. (ג) למשוך את החתכים קוקוממית עם מחדש עפעף. (ד) עבור כריתת משתנים מוחלטת, מצרוב את כלי הדם שמסביב על ידי אלקטרוקאטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-29894
איור 13: הערכה חזותית של שלבי הרבייה. (א, ב) הערכות חזותיות של שלב הרבייה דרך עור חצי שקוף, Necturus. (ג) עור שקוף, הרמאואטוראצ'יום (צפרדע זכוכית). (ד) הערכה חזותית של R. מוסקוסה לפני (ימין, שורה כחולה) ולאחר ההטלה (קו שמאל-צהוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-30514
איור 14: שימור ביצים. (א, ב) רנא נשית מוסקוסה עם מקרה חמור של שימור ביצים. (ג) אולטרסאונד מראה הdegenerating הישן, ביצים (למעלה) וביצים גדולות יותר (הלוח האמצעי והתחתון) ovulated ולכוד בתוך קוסום. (ד) נשמר ביצים שאוחזרו על ידי החשפנות ידני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-31124
איור 15: תמונות אולטרסאונד של ביצים שנשמרו Necturus כי (א) הפכה האקו המראה (מעגל) היו קשורים (ב) החזקת נוזלים בחלל הגוף (חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-31603
איור 16: אחוז הנטוראוס השבויה שבהטלה מצמדים מלאים או חלקיים (2013-2017) בהשוואה לאלה שלא המריאו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

טיפול ישיר, תצפית חזותית ואמצעים מורמטרים מספקים שיטות שאינן פולשנית והם הקריטריונים הראשונים הערכה לקביעת שלב הרבייה הנשית. עם זאת, מחקר זה מראה כי שחלות gravid לא יכול תמיד להיות מזוהה באופן אמין על ידי מישוש. בהתאם מינים, שחלות gravid יכול לפעמים להתגלות חזותית דרך חצי שקוף (איור 13a, B) או עור שקוף לחלוטין על הצד הגחוני של בעל החיים (איור 13a). נקבות שסיימו את ההטלה יכול להראות שינויים ברורים למראה שלהם בהשוואה לנקבות gravid (למשל, עור רופף ואובדן של עד 30% ממסת הגוף שלהם, איור 13D). במהלך הרבייה, זכרים ונקבות יציגו התנהגויות מסוימות המספקות מידע על קירבה לביוץ וההטלה. במקרה של ר. מוסקוצה מצביע על כך שנקבה קרובה לתנוחת ההטלה מתחילה עם הנקבה הנכנסת לעמדות הידיים.

היישום של טכנולוגיית אולטרה סאונד כדי אנאנים ו Caudates מאפשר אבחנה של נוכחות או העדר של ביצים, אם ההטלה היה קשור עם שחרור מלאה או חלקית של ביצים מפותחות. כך, שיטה זו מספקת הערכה מלאה ומדויקת יותר של מצב הרבייה מבלי להיות מוגבל לקביעת מעמד gravid/non-gravid באמצעות טכניקה ויזואליזציה המשתנה על ידי שקיפות העור בבטן, או עקביות באפידרמיס בין הזן האמפיבי השונה. ניתן לבצע אולטרסאונד בקלות יחסית ובמעט מתח לבעלי חיים (איור 5 ואיור 13) וניתן להשתמש בו לאפיון מחזורי הרבייה ולקביעת מצב הרבייה4. חשוב להכיר את המינים; עם זאת, מחקר זה הראה כי Necturus ו -R. מוסקוסה לשתף סימנים התפתחותיים שכיחים דפוסי הרבייה שלהם ומאפשר סיווג דומה של הרבייה (איור 5). באמצעות טכנולוגיה זו יש כעת ראיות כי התפתחות ביצה גבוה בשבי Necturus ו R. מוסקוסה ושני המינים הללו בעקבות דפוס עונתי. למרות שהסיבות לתופעות אלה אינן ידועות ודורשות חקירה נוספת, ללא שימוש באולטרסאונד, מספר תחומים של תפקוד לקוי של השחלות, כגון החזקת ביצים ומיקום ההטלה החלקי, לא היתה מזוהה. יישומים עתידיים לטכניקה זו ישמשו כדי לקבוע אם יש לבחור את הנקבות להתרבות בכל שנה נתונה והאם תושלם ההטלה.

פרוטוקול לאיסוף דם, כגון זה המוצג ב -R. מוסקוסה, שהוא גם יעיל וגורם למצוקה מינימלית לבעל החיים, הוא אופטימלי ללמוד פרופילי הורמונים בשבי ובעל אנאנים שנתפסו בפראות (Calatayud, לא פורסם). עד כה, לא קיים מידע בנוגע לפרופילי ההורמונים השנתיים של מוסקוסה השבויה, ולכן אין ידע על האופן שבו ההורמונים משפיעה על בריאותם והרבייה שלהם. יתר על כן, עם ראיות כי נשים ממין זה לא יכול להיות מגדלים שנתיים, פרופיל הורמונלי יהיה שיטה נוספת למעקב אחר מחזורי השחלות. יחד עם אולטרסאונד, ניתוח הורמון עלול להוביל לחיזוי טוב יותר של מה הנקבות יהיו מוכנים מיקום ההטלה. יתרה מזו, בשנה האחרונה תועדו שני מקרים של אינטרסקס באוכלוסיית השבויה ר. מוסקוסה . בנוסף לכך, התפתחות רפידות האגודל נרשמה על כמה מהנקבות המייסדות הבוגרות יותר. הסיבות לכך הן כרגע בחקירה אך תוצאות ראשוניות מרמזות שהוא עשוי להתייחס לשינויים ברמות הטסטוסטרון (Calatayud, לא פורסם). מחזורי הורמונלי הבחנה אצל נקבות בגילאים שונים יסייעו לנו להבין מדוע הנקבות יכולות לפתח מאפיינים מיניים משניים הקשורים לגברים, ואם זה צפוי באוכלוסיה מזדקנת.

טיפול הורמונלי אקסוגני שימש להתגבר על תפקוד הרבייה לעתים קרובות נתקל דו-חיים בשבי. עם זאת, עבור אוכלוסיית מוסקוסה והנטוריוס במחקר זה, לא הבדלים משמעותיים בתנוחת ההטלה בין הורמונים שטופלו ושליטה התגלו במשך תקופה של 2 ו -5 שנים של זמן, בהתאמה. הדבר עשוי להצביע על כך שפרוטוקול ניהול הורמון, מינונים, הטרמה ושילוב הורמונלי שימוש לא היה מספיק עבור המינים. ניתוח מקרוב של היסטוריית הרבייה הפרט הנשי מציע R. מוסקוסא לא יכול לחוות רבייה שנתית, אשר יכול גם להסביר את חוסר ההשפעה ההורמונלית שנצפו בנקבות מטופלים. מכיוון שאחוז מסוים של נקבות בעקביות דילג על הרבייה בכל שנה, הבנת ההיסטוריה הטבעית של המינים יכולים לעזור לקבוע אם יש צורך בהורמונים אקסוגניים וכאשר הם יכולים להיות יעילים ביותר. ההליכים המתוארים במאמר זה ניתן להחיל על מספר מינים, (טבלה 1) והם עבור אנאנים החל 5 g כדי 150 g; בעלי חיים גדולים יותר עשויים לדרוש מזרקים שונים ומאבחנים מחט. המיקום של הזריקה משתנה עם כמה הורמונים הדורשים פנים שרירי, פנים הצפק, תת עורית או הזרקה בתוך עורי (איור 7).

כירורגיה למטרת כריתת אונוקטומיה היא שיטה נפוצה המשמשת במינים אמפיחיים שונים כדי להשיג אוציטים למחקרים embryological. בנוסף, ניתן לציין את האונוקטומיה עבור בקרת אוכלוסיה וסוגיות רפואיות כגון שימור ביצים. במקרה של כריתת המוח החלקית שבה, הקציר oocyte מבוצע למטרות מחקר, ניתוח חייב להבטיח כי החיה נשאר רבייה. המינהל של PGF2α הראה כמה הבטחה בפתרון החזקת ביציות ב נקבה R. מוסקוסא. בכמה אנשים, PGF2α מעורר הסרה מלאה של ביצים שנשמרו בעבר, אבל באחרים רק התצהיר חלקית התרחש בדרישה להתפשט ידנית כדי להסיר את כל הביצים. בעוד PGF2α עשוי לשמש כחלופה לניתוח עבור החזקת ביצים ב -R. מוסקוסה, יכולתה לתקן את התנאים הפתולוגיים דומים בדו חיים אחרים ידרשו אימות ספציפי למינים. כאשר התערבות כירורגית מאושפזת עבור החולה אנין או Caudate, יש צורך להבטיח מטוס מספיק של הרדמה לפני שנעשו חתכים. מיומנויות תצפית נבונה נדרשות כדי להעריך ולנטר את תגובות התגובה הנורמטיבית וההתאוששות כמתואר במחקר זה עבור כל אחד מהטקא. ברגע שאחד מכיר את האנטומיה הספציפית, גישה כירורגית מתאימה, הומוסטזיס, מניפולציה רקמות עדין וניהול מתאים postאופרטיבית, ניתוחי הרבייה להוות מכשולים מוחץ.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

נטלי Calatayud רוצה להודות לד ר ברברה דוראנט על הדרכה וסיוע באולטרסאונד ולחקור את הג דה איממובלס, דרום אמריקה (EISA) לצורך הענקת סיוע כספי לתפקיד עמיתי למחקר ב-SDZG. תודות ד ר קיילי קיין על הערות על כתב היד, כמו גם על הסוקרים הרשמיים (מי שהם לא יהיו). תודות ג'ונתן דיין שלנו 2018 בחור הקיץ שלנו, סן דייגו גן החיות המכון לחקר שימור לספק תמונות (איור 1A, B). מוניקה סטופס מרחיבה את ההערכה לאגודת גני החיות והקרן לשימור האקווריומים ולקרן דיסני ברחבי העולם למתן תמיכה כספית להקמת אוכלוסיית הנטוריוס השבויה. בנוסף, התקבלה התמיכה גם באמצעות תרומות פרטיות מעורך הדין האמפיבי גב' איריס דה לה מוטי. תודה, מוענק למר כריסטופר דזמור וד ר מארק קמפבל על תרומתו המשמעותית למחקר.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical SystemsGE medical systemsGE logiq Book XPUltrasound
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convexGE medical systems8C-RS (10 MHz)Ultrasound probe
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle)Mettler Electronics Corp CASonigelUltrasound gel (water soluble, salt-free)
Hormone
Gonadotropin releasing hormoneBACHEM4012028synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate
abbreviation: GnRH
Lutenizing hormone releasing hormoneBACHEM, Sigma-Aldrich4033013;     L1898synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt;
[D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate
abbreviation: LHRH
Human chorionic gonadotropinBACHEM, Sigma-Aldrich4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU)
abbreviation: hCG
Prostaglandin 2αSigma-AldrichP40424;synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris;
abbreviation: PGF2α
Follicle-stimulating hormoneSigma-AldrichF4021, F8174synonym: porcine, sheep
abbreviation: FSH
ProgesteroneSigma-Aldrich46665;      P7556synonym: Vetranal; P4 water soluble
abbreviation: P4
Pituitary extractnasynonym: Check papers for amphibian species derivation
abbreviation: PE
Pregnant Mare Serum GonadotropinProspec;       Lee Biosolutions; Sigma-AldrichHOR-272;    493-10; 9002-70-4synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin
abbreviation: PMSG
MetaclopromideSigma-AldrichM0763synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide
abbreviation: MET
LucrinBACHEM; Sigma-Aldrich4033014;   L0399synonym: Leuprorelin acetate
abbreviation: Lucrin
LutalysePfizersynonym: PGF2α - Dinoprost tromethamine
abbreviation: Lut
PimozideSigma-AldrichP1793synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one
abbreviation: PZ
Amphiplexsee abovesynonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide
abbreviation: GnRH + MET
OvopelOvopelnasynonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg)
abbreviation: Ovo
OvaprimPentair aquatic eco-systemsOva10synonym: Salmon gonadotropin + domperidone
abbreviation: Ova
DomperidoneSigma-AldrichD122synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine
abbreviation: DOM

References

  1. Conde, D. A., Flesness, N., Colchero, F., Jones, O. R., Scheuerlein, A. An emerging role of zoos to conserve biodiversity. Science. 331 (6023), 1390-1391 (2011).
  2. Conde, D. A., et al. Zoos through the Lens of the IUCN Red List: A Global Metapopulation Approach to Support Conservation Breeding Programs. PLoS ONE. 8 (12), e80311(2013).
  3. Morrison, C., Hero, J. -M. Geographic variation in life-history characteristics of amphibians: a review. Journal of Animal Ecology. 72 (2), 270-279 (2003).
  4. Calatayud, N. E., Stoops, M., Durrant, B. S. Ovarian control and monitoring in amphibians. Theriogenology. , 70-81 (2018).
  5. National Research Council. Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook. , (2010).
  6. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  7. Graham, K. M., Langhorne, C. J., Vance, C. K., Willard, S. T., Kouba, A. J. Ultrasound imaging improves hormone therapy strategies for induction of ovulation and in vitro fertilization in the endangered dusky gopher frog (Lithobates sevosa). Conservation Physiology. 6 (1), coy020(2018).
  8. Wright, K. M., Whitaker, B. R. Amphibian Medicine and Captive Husbandry. , Krieger Publishing Company. (2001).
  9. Forzán, M. J., Vanderstichel, R. V., Ogbuah, C. T., Barta, J. R., Smith, T. G. Blood collection from the facial (maxillary)/musculo-cutaneous vein in true frogs (family Ranidae). Journal of Wildlife Diseases. 48 (1), 176-180 (2012).
  10. Allender, M. C., Fry, M. M. Amphibian hematology. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 11 (3), 463-480 (2008).
  11. Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (3), 64-67 (2007).
  12. Jorgensen, C. B. External and internal control of patterns of feeding, growth and gonadal function in a temperate zone anuran, the toad Bufo bufo. Journal of Zoology. 210 (2), 211-241 (1986).
  13. Jørgensen, C. B. Growth and reproduction. Environmental Physiology of the Amphibians. , 439-466 (1992).
  14. Vu, M., Trudeau, V. L. Neuroendocrine control of spawning in amphibians and its practical applications. General and Comparative Endocrinology. 234, 28-39 (2016).
  15. Clulow, J., Trudeau, V. L., Kouba, A. J. Amphibian declines in the twenty-first century: why we need assisted reproductive technologies. Reproductive Sciences in Animal Conservation. , 275-316 (2014).
  16. Kouba, A., et al. Assisted reproductive technologies (ART) for amphibians. Amphibian Husbandry Resource Guide. 2, 60-118 (2012).
  17. Clulow, J., et al. Optimisation of an oviposition protocol employing human chorionic and pregnant mare serum gonadotropins in the Barred Frog Mixophyes fasciolatus (Myobatrachidae). Reproductive Biology and Endocrinology. 10 (1), 60(2012).
  18. Browne, R. K., Seratt, J., Vance, C., Kouba, A. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri). Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 34(2006).
  19. Calatayud, N. E., et al. A hormone priming regimen and hibernation affect oviposition in the boreal toad (Anaxyrus boreas boreas). Theriogenology. 84 (4), 600-607 (2015).
  20. Stoops, M. A., Campbell, M. K., Dechant, C. J. Successful captive breeding of Necturus beyeri through manipulation of environmental cues and exogenous hormone administration: a model for endangered Necturus. Herpetological Review. 45 (2), 251-256 (2014).
  21. Mc Creery, B. R., Licht, P. Induced ovulation and changes in pituitary responsiveness to continuous infusion of gonadotropin-releasing hormone during the ovarian cycle in the bullfrog, Rana catesbeiana. Biology of Reproduction. 29 (4), 863-871 (1983).
  22. Johnson, C. J., Vance, C. K., Roth, T. L., Kouba, A. J. Oviposition and ultrasound monitoring of American toads (Bufo americanus) treated with exogenous hormones. Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 299, 301(2002).
  23. Herbert, D. Studies of assisted reproduction in the spotted grass frog Limnodynastes tasmaniensis: ovulation, early development and microinjection (ICSI). , (2004).
  24. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2, 6(2004).
  25. Ogawa, A., Dake, J., Iwashina, Y., Tokumoto, T. Induction of ovulation in Xenopus without hCG injection: the effect of adding steroids into the aquatic environment. Reproductive Biology and Endocrinology. 9 (1), 11(2011).
  26. Silla, A. J. Effects of luteinizing hormone-releasing hormone and arginine-vasotocin on the sperm-release response of Günther’s Toadlet, Pseudophryne guentheri. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 139(2010).
  27. Trudeau, V. L., et al. Hormonal induction of spawning in 4 species of frogs by coinjection with a gonadotropin-releasing hormone agonist and a dopamine antagonist. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 36(2010).
  28. Krause, E. T., von Engelhardt, N., Steinfartz, S., Trosien, R., Caspers, B. A. Ultrasonography as a minimally invasive method to assess pregnancy in the fire salamanders (Salamandra salamandra). Salamandra. 49, 211-214 (2013).
  29. Browne, R. K., Li, H., Seratt, J., Kouba, A. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 3(2006).
  30. Bramucci, M., et al. Different modulation of steroidogenesis and prostaglandin production in frog ovary in vitro by ACE and ANG II. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 273 (6), R2089-R2096 (1997).
  31. Gobbetti, A., Zerani, M. Possible roles for prostaglandins E2 and F2α in seasonal changes in ovarian steroidogenesis in the frog (Rana esculenta). Journal of Reproduction and Fertility. 98 (1), 27-32 (1993).
  32. Gobbetti, A., Zerani, M., Carnevali, O., Botte, V. Prostaglandin F2α in female water frog, Rana esculenta: Plasma levels during the annual cycle and effects of exogenous PGF2α on circulating sex hormones. General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 175-180 (1990).
  33. Guillette, L. J. Jr, Dubois, D. H., Cree, A. Prostaglandins, oviducal function, and parturient behavior in nonmammalian vertebrates. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 260 (5), R854-R861 (1991).
  34. Clulow, J., Mahony, M., Browne, R., Pomering, M., Clark, A. Applications of assisted reproductive technologies (ART) to endangered anuran amphibians. Declines and Disappearances of Australian Frogs'. Campbell, A. , 219-225 (1999).
  35. Browne, R. K., Wolfram, K., García, G., Bagaturov, M. F., Pereboom, Z. Zoo-based amphibian research and conservation breeding programs. Amphibian and Reptile Conservation. 5 (3), 1-14 (2011).
  36. Chai, N. Surgery in amphibians. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 19 (1), 77-95 (2016).
  37. Gentz, E. J. Medicine and surgery of amphibians. Ilar Journal. 48 (3), 255-259 (2007).
  38. Snyder, W. E., Trudeau, V. L., Loskutoff, N. M. 168 a noninvasive, transdermal absorption approach for exogenous hormone induction of spawning in the northern cricket frog, Acris crepitans: a model for small, endangered amphibians. Reproduction, Fertility and Development. 25 (1), 232-233 (2012).
  39. Kouba, A. J., et al. Emerging trends for biobanking amphibian genetic resources: the hope, reality and challenges for the next decade. Biological Conservation. 164, 10-21 (2013).
  40. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2 (1), 6(2004).
  41. Fort, D. J. Frog reproduction and development study 2000 rana pipiens reproduction and development study. , Environmental Protection Agency. (2003).
  42. Clulow, J., et al. Differential success in obtaining gametes between male and female Australian temperate frogs by hormonal review: A Review. General and Comparative Endocrinology. 265, 141-148 (2018).
  43. Trottier, T. M., Armstrong, J. B. Diploid gynogenesis in the Mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  44. Marcec, R. M. Development of assisted reproductive technologies for endangered North American salamanders. , Mississippi State University. (2016).
  45. Wright, M. L. Melatonin, diel rhythms, and metamorphosis in anuran amphibians. General and Comparative Endocrinology. 4, (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147Circadian

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved