JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את המדריך מיון ההליך כדי לבודד את הנוירונים fluorescently שכותרתו יחיד ואחריו במבחנה מבוסס-תמלול mRNA הגברה עבור רצפי RNA תא בודד גבוה-עומק.

Abstract

רצפי RNA בתא יחיד (RNA-seq) הוא כעת כלי מיושמים באופן נרחב assaying ביטוי גנים. פלטפורמות זמינים מסחרית של רצפי RNA בתא יחיד לעבד תאי כל קלט ללא אבחנה. לפעמים, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) משמש במעלה הנהר כדי לבודד אוכלוסיה ספציפית עם תוויות של ריבית. מגבלה של FACS הוא בצורך מספר גבוה של תאי קלט עם שברים שכותרתו באופן משמעותי, אשר אינה מעשית עבור איסוף והגדרת פרופיל נדיר או בדלילות שכותרתו נוירון אוכלוסיות מהמוח העכבר. כאן, אנו מתארים שיטה עבור באופן ידני איסוף דליל fluorescently שכותרתו נוירונים יחיד של טרי הפומבית רקמת מוח העכבר. תהליך זה מאפשר לכידת נוירונים התווית על-ידי יחיד עם טוהר גבוהה ושילוב הבאים עם במבחנה הגברה מבוססת-תמלול פרוטוקול ששומרת יחסי התעתיק אנדוגני. אנו מתארים שיטה הגברה ליניארי זוגי המשתמשת מזהים ייחודיים מולקולה (UMIs) כדי ליצור ספירות mRNA בודדות. שני סיבובים של הגברה תוצאות ברמה גבוהה של זיהוי גנים לכל תא ותא.

Introduction

רצפי RNA בתא יחיד (RNA-seq) הפכה מחקרים transcriptomic. בעוד RNAseq תא יחיד בקנה מידה גדול יכול להתבצע תוך שימוש במגוון טכניקות, כגון טיפות1,2, מיקרופלואידיקה3, nanogrids4, microwells5, לרוב השיטות לא ניתן למיין את סוגי תאים מוגדרים זה בטא fluorophores מקודדים גנטית. כדי לבודד אוכלוסיה בחר תא, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) משמש לעתים קרובות כדי למיין תאים עם תוויות במצב תא בודד. עם זאת, FACS יש הגבלות מסוימות ומחייב שלבי עיבוד הדגימה מוקפד. ראשית, מספר גדול של תאי קלט הם בדרך כלל צורך (לעיתים קרובות מספר מיליון תאים לכל mL), עם חלק קטן משמעותית (> 15 – 20%) המכיל את האוכלוסייה עם תוויות. שנית, ההכנות התא עשויים לדרוש מספר סיבובים של צפיפות שלבים הדרגתיים צנטריפוגה כדי להסיר שבר גליה, פסולת, ובתצורות תא כי אחרת עלול לסתום את התא חרירים או זרימה. שלישית, FACS מעסיקה בדרך כלל מכתים, destaining צעדים חי/מת מכתים (למשל, 4 ′ 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), propidium יודיד (PI), צבעי Cytotracker), אשר לקחת את הזמן נוספים. רביעית, כמו כלל אצבע על שני צבעים מיון (כגון דאפי חלבון פלואורסצנטי ירוק/אדום (GFP/RFP)), בדרך כלל שני מדגמים ובקרת אחד נדרשים, הדורשים דוגמה ללא תווית יעובדו בנוסף המתח העכבר הרצויה. חמישית, סינון מבוצעת לעיתים קרובות מספר פעמים לפני ובמהלך מדגם מיון באופן יזום למנוע שורות מדגם סתומות מכשיר FACS. שישית, זמן חייב להקציב ב כיוונוני FACS הנפוץ לאתחל, לייצב את זרם נוזלים, לבצע כיול droplet. שביעית, שליטה דגימות מופעלים בדרך כלל ברצף לפני באוסף הדגימה בפועל כדי להגדיר פיצוי מטריצות, כפיל דחייה, הגדרת שערים, וכדומה משתמשים גם לבצע צעדים שש ושבע עצמם מבעוד מועד או לדרוש סיוע של טכנאי במקביל. לבסוף, פוסט-FACS, לעיתים קרובות ישנם צעדים כדי להבטיח כי רק תווית יחידה תאים הם נוכח כל טוב; לדוגמה, על-ידי בדיקת דגימות בתוך מלכודת הקרנה גבוהה-תוכן כגון imager צלחת מהיר.

כדי לעקוף את השלבים שפורטו לעיל ולהקל יחסית מהיר, ממוקד רצף של אוכלוסיה קטנה של נוירונים שכותרתו fluorescently יחיד, אנו מתארים ידנית מיון הליך ואחריו שני סיבובים של רגישות גבוהה חוץ גופית בתוך פרוטוקול הגברה, נקרא שעתוק הפריה כפולה עם ספירות מוחלטת רצף (DIVA-Seq). דור הגברה RNA ספריית cDNA המותאמים מ. Eberwine et al. 6 והשמשוני. et al. 7, עם שינויים מסוימים כדי להתאים interneurons העכבר שיש כרכים הסלולר קטן יותר; יתר על כן, מצאנו גם כי זה שהנשק של נוירונים כפירמידה סינאפסות.

Protocol

כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על-ידי IACUC קר ספרינג הרבור מעבדה, ניו יורק (IACUC #16-13-09-8).

1. מיון ידני של העכבר Fluorescently שכותרתו נוירונים

  1. למשוך 10 – 15 מיקרומטר קוטר יציאה באמצעות ההגדרות הבאות של פולר נימי זכוכית microcapillaries (ראה טבלה של חומרים): חום: 508, משיכה: ריק, ול: ריק, זמן: ריק.
  2. לצרף צינורות סיליקון גמיש 120-150 ס"מ (~0.8 מ מ בתוך קוטר) 0.2 µm polyvinylidene difluoride (PVDF) ממברנה מזרק מסנן, שסתום אבובים דו-כיוונית באמצעות מחברי צינורות מתאימים.
  3. הכנת 500 מ"ל צוננת (4 ° C) מלאכותי השדרתי (כלנית חדד, טבלה 1), חמצן על ידי חמצן 5% פחמן דו-חמצני מאוזן מבעבעים דרך airstone למשך 15 דקות, או עד הפתרון מנקה לגמרי.
  4. הכן 100 מ של כלנית חדד עם קוקטייל של חוסמי פעילות בתוך 150 מ"ל (טבלה 1).
  5. הכן 100 מ של כלנית חדד עם 1 מ"ג/מ"ל סטרפטוקוקוס שבר הרביעי פרוטאז בתוך 150 מ"ל (טבלה 1).
  6. להכין 100 מ של כלנית חדד עם 1% פתרון סרום שור עוברית (FBS) בתוך 150 מ"ל, חמצן עם 5% פחמן דו-חמצני מאוזנת חמצן דרך airstone.
  7. לנתח את המוח של עכבר לאללה על-ידי פתיחת הגולגולת עם מספריים קטנות, חילוץ בעזרת מלקחיים בסדר ללא פגיעה בקליפת המוח טריים.
    הערה: עכברים של כל זן, גיל ומין ניתן להשתמש לפי הצורך. אין להקפיא את המוח או לבצע מיון ידני על עכברים מוזרק עם וירוסים או אחרים מסוכנים/מדבקים.
  8. שמור את המוח חנה המבר צוננת ולא מחומצן, עוזב עם airstone מחובר לחמצן איזון 5% פחמן דו-חמצני במהלך כל השהות חלוקתה.
  9. מקם את המוח צ'אק vibratome וחותכים מקטעים הילתית או הווריד ב 300 עובי מיקרומטר. לאסוף כמה שיותר חלקים לפי הצורך כדי לקבל מינימום של ~ 10 – 50 תאים עד כמה מאות תאים עם תוויות. לשים פרוסות על בעל פרוסה מרושת כותנה, ממוקמים בתוך גביע אז הם שטופים חנה המבר מחומצן.
  10. להעביר טריות פרוסות לתוך גביע המכיל כלנית חדד עם חוסמי פעילות של רחוב למשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר. שמור מבעבע חמצן באמצעות airstone.
  11. לעבור את הפרוסות גביע המכיל כלנית חדד עם הפתרון פרוטאז לבצע קלה לעיכול בטמפרטורת החדר: 20 – 30 דקות לבעלי P4-14 או עד 45 – 60 דקות לבעלי P28-56. שמור חמצן מבעבע.
  12. לשטוף כלנית חדד עם פרוטאז על-ידי הזזת פרוסות בחזרה. הספל המכיל כלנית חדד עם פעילות פתרון חוסמי למשך 5 – 10 דקות בטמפרטורת החדר. שמור חמצן מבעבע.
  13. לעבור מקטעים בודדים 100 מ מ פטרי המכילות כלנית חדד עם 1% FBS בטמפרטורת החדר. תחת טווח לנתיחה פלורסנט, אזורים microdissect ושכבות עניין שיש מינימום של 10 – 50 תאים (עד כמה מאות). לבצע את microdissection עם זוג מלקחיים בסדר או על-ידי הצמדת 22-28 גרם מחטים הזרקת על גבי עץ מחזיקי (נתח קצבים).
  14. באמצעות פיפטה של פסטר, להעביר את החלקים microdissected צינור microfuge 2 מ"ל המכיל ~0.8 מ ל 1% FBS בפתרון כלנית חדד.
  15. Triturate הרקמה ביתור בצינור microfuge בטמפרטורת החדר. להפוך את שלוש ארוכי גבעול פסטר פיפטות עם הפחתת קטרים היציאה על ידי גלגול אותם על להבה פתוחה. לבצע משיכות ~ 10 עם כל פיפטה, התחלה עם הגדול ואת הסיום עם הקטן ביותר.
  16. לוותר על התאים dissociated לתוך צלחת פטרי 100 מ מ המכיל חנה המבר מחומצן (צלחת פטרי יכול להיות מצופה דק עם 5 מ מ 1% אגר או תרכובת-1:10 ברור סיליקון יחס, במידת הצורך). לשמור בטמפרטורת החדר.
  17. רגע ~ 5-7 דקות עבור התאים בהדרגה ליישב, ולאחר מכן לבחון את האות ה-GFP/RFP תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
    הערה: תאים בודדים, פסולת, גושים קטנים יהיה גלוי בהיר-שדה (BF).
  18. לבחור 10 – 15 GFP/RFP תאים בכל פעם באמצעות פיפטה נימי (מתוך שלב 1.1) המחוברים לצנרת סיליקון גמיש (0.4 – 0.8 מ"מ קוטר פנימי) ונותנות את התאים לתוך צלחת פטרי 100 מ מ המכיל טריים חנה המבר מחומצן.
  19. על ידי חסימת בסוף השסתום אבובים עם הלשון, מקם את נימי קרוב התא של ריבית. לכידת תאים באמצעות פעולה נימי על משחרר את הבלוק, במהירות לחסום שוב כדי למנוע חדירה פיפטה את עודפי הנוזלים. לוותר על התאים על 100 מ מ צלחת פטרי עם חנה המבר מחומצן טריים על ידי פיצוץ בעדינות, תוך התבוננות על הטיפ נימי תחת קרינה פלואורסצנטית אופטיקה של המיקרוסקופ לנתיחה. במטרה לאסוף ~ 100 – 150 תאים הכולל.
  20. חזור על שלב 1.19 פעם או פעמיים ויותר (תלוי פסולת), העברת סך של ~ 50 – 75 תאים חדש 100 מ מ פטרי, מוודא כי מזהמים כגון פסולת הן מינימליות ב אופטיקה חדות (DIC) התערבות דיפרנציאלית בהיר-שדה.
  21. לבסוף, בעזרת פיפטה microcapillary טריים בכל פעם, בחר תא בודד יותר בנפח 0.5 µL, לגרש אותו לתוך צינור microfuge יחיד 0.2 מ"ל (או רצועה אחת של 8 צינורות microfuge 0.2 מ"ל) המכיל µL 1 מדגם מאגר אוסף עם תחל N10B1-N10B96 (טבלה 2). שבור את הקצה פיפטה בצינור microfuge כדי להבטיח התא במאגר של אוסף. למחוק את מדי סוכר.
  22. להקפיא את התאים על ידי לשים צינורות על קרח יבש ואחסונם לטווח ארוך במקפיא-80 ° C עד שיהיו מוכנים להיות מעובד עבור הגברה RNA.

2. הגברה RNA בסיבוב הראשון

הערה: ההליך הבא היא רצועת יחיד של שמונה 0.2 מ"ל microfuge צינורות. קנה המידה התגובות לפי הצורך.

  1. לסנתז את קווצת הראשון של cDNA (בסיבוב הראשון).
    1. חום רצועות מהשלב 1.22-70 הלעפה תרוטרפמט למשך 5 דקות ולאחריו הלעפה תרוטרפמט 4 עבור 5 דקות; חזור על פעמיים.
    2. להרכיב על קרח רוורס טרנסקריפטאז (RT) סינתזה מיקס/הראשון-strand מאסטר אב לערבב בעזרת מרכיבים הבאים (ראה טבלה של חומרים): 10 x הראשון-strand מאגר (2 µL), dNTP מיקס (4 µL), RNase מעכב (1 µL), אנזים (1 µL).
    3. בקצרה centrifuge רצועת על צנטריפוגה שולחן כדי לאסוף את הכל בתחתית. לשמור על הקרח.
    4. להוסיף 1 µL של RT סינתזה מיקס/הראשון-strand מאסטר מיקס מאסטר הצינורות לעיל (נפח כולל של 1 µL דוגמת המאגר מאוסף תא + µL 1 של RT = µL 2/צינור). מערבבים היטב בעזרת pipetting. בקצרה ספין לאסוף את התוכן המלא בתחתית ולשמור אותו בקרח.
    5. דגירה את הצינור לעיל/s ב 42 מעלות צלזיוס במשך שעתיים בתוך תנור אוויר. לשים הצינורות על הקרח מיד כדי לסיים את התגובה והמשך לשלב השני-strand סינתזה.
  2. לסנתז את חוט השני-cDNA (בסיבוב הראשון).
    1. להפוך סטרנד השנייה מאסטר מיקס (80 µL) על הקרח לפי הסדר הבא צינור 1.5 mL: נוקלאז ללא מים (63 µL), 10 x השני מאגר סטרנד (10 µL) dNTP מיקס (4 µL), ה-DNA פולימראז (2 µL), RNaseH (1 µL). מערבבים את החומרים היטב על ידי vortexing, ולאחר מכן spin כדי לאסוף בתחתית ולשמור על קרח.
    2. להתחיל הצנטרפוגה תרמי, להפעיל את התוכנית הבאה מראש מגניב היחידה, להיות מוכן להתחיל שלב 2.2.3 (מכסה חום = כבויים; 16 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, להחזיק 4 ° C), וישהה ב-16 ° C
    3. מוסיפים 80 µL פס (או µL 10/צינור) של השני סטרנד, מאסטר מערבבים היטב עד כל שפופרת של רצועת לשמור על הקרח. להעביר את הרצועה הצנטרפוגה תרמי ולחדש את שלב 16 ° C יזם מעל. דגירה רצועת עבור 2 h ב-16 ° c
    4. לאחר השלב השני-strand סינתזה, במקום הצינורות על קרח כדי להמשיך לשלב הבא של טיהור cDNA.
  3. לטהר cDNA נטושים כפול (בסיבוב הראשון).
    הערה: כל centrifugations מבוצעות ב g x ~ 8,000 בטמפרטורת החדר. לחרוג 16,000 g x כדי למנוע נזק הדיו מסנן.
    1. להפעיל חימום µL 100 של נוקלאז ללא מים עד 50 – 55 ° C לשימוש מאוחר יותר בבלוק חימום יבשים. לחרוג 58 ° C כדי למנוע דנטורציה חלקית של cDNA.
    2. להוסיף µL 250 cDNA איגוד מאגר צינור 1.5 מ. בדוק אם פוחת משקעים במאגר, ואז לחמם את בופר עד 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות מחדש להתמוסס פוחת משקעים.
    3. העבר cDNAs רצועה 8-צינור יחיד אל המאגר איגוד cDNA. לשלב את התאים בשלב זה עבור נוסף במורד הזרם תהליכים (8 תאים צינור 1). לערבב ביסודיות על ידי pipetting 2 - 3 פעמים, כקבוצה – עלים 3 - 4 פעמים. ספין לאסוף את התוכן בחלק התחתון.
    4. מכניסים את מחסנית מסנן cDNA לשטיפת צינורות (מתוך ערכת שעתוק (IVT) במבחנה ) בחוזקה. להוסיף את התערובת מעל למרכז של המסנן. צנטריפוגה ב 8000 g x ~ 1 דקות, או עד שזה דרך המסנן. למחוק את הזרימה דרך ולהחליף את צינור שטיפה.
    5. להוסיף 500 µL שטיפת מאגר הערכה IVT העמודה.
      הערה: ודא שאתנול הזאת נוספה למאגר לשטוף קודם לכן.
    6. צנטריפוגה ב 8000 g x ~ 1 דקות, או עד שזה דרך המסנן. למחוק את זרימה דרך וצנטריפוגה שוב ב 8000 g x ~ 1 דקות לרוקן את המחסנית.
    7. להעביר את המסנן cDNA שפופרת • תנאי cDNA (1.5 mL ללא נוקלאז הצינור). µL 8.5 של מים נטולי נוקלאז מראש ומחוממת חלות על המרכז של המסנן. לחכות 2 דקות, צנטריפוגה ב g 8,000 x ~1.5 דקות.
    8. Elute שוב עם 8.5 µL של מים נטולי נוקלאז ומחוממת מראש והמשך מיד IVT בסיבוב הראשון.
      הערה: כפול גדילי cDNA שחזור נפח יהיה ~ 16 µL.
  4. לבצע לתגובה שעתוק (IVT) במבחנה לייצור RNA (ארנה) מוגבר של cDNA (בסיבוב הראשון).
    1. הגדר את התנור אוויר הכלאה 37 מעלות צלזיוס.
    2. להכין את תערובת הבסיס IVT בקרח לפי הסדר הבא: כדי µL 16 של cDNA eluted גדילי כפול מ שלב 2.3.8, להוסיף 4 µL של פתרון T7 ATP (75 מ מ); µL 4 בפתרון T7 CTP (75 מ מ); µL 4 בפתרון T7 GTP (75 מ מ); µL 4 בפתרון T7 UTP (75 מ מ); µL 4 T7 10 x תגובת המאגר; µL 4 של תערובת אנזימים T7. מערבבים היטב, ספין, לחיצה ארוכה על קרח.
    3. להוסיף µL 24 של המיקס מאסטר IVT כל שפופרת המכילה µL 16 של cDNA. מערבבים את התוכן על-ידי pipetting בעדינות וביסודיות. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14 שעות.
      הערה: הדגירה עבור < 12 h השלכות חמורות על התשואה.
    4. להוסיף מים ללא RNase להגדיל את נפח כדי 100 µL ולעצור את התגובה IVT מטופלים 60 µL של הלא-diethyl pyrocarbonate (לא DEPC).
  5. לטהר את ארנה.
    הערה: כל centrifugations מבוצעות ב g x ~ 8,000 בטמפרטורת החדר. לחרוג 16,000 g x כדי למנוע נזק הדיו מסנן.
    1. להפעיל חימום ~ 200 µL של נוקלאז ללא מים עד 50 – 55 ° C לשימוש מאוחר יותר בלוק חימום יבשים או מכונת ה-PCR. לחרוג 58 ° C כדי למנוע דנטורציה חלקית של ארנה.
    2. העברה ארנה צינור ללא נוקלאז 1.5 mL. להוסיף 350 µL ארנה איגוד מאגר כל מדגם ארנה. להוסיף 250 µL של 100% אתנול כל צינור ולערבב על ידי 3 פעמים על-ידי pipetting (do לא מערבולת כדי לערבב ספין).
    3. להעביר את התמהיל מיד אל העמודה טיהור RNA על-ידי הוספתו בעדינות אל המרכז של מיכל הדיו מסנן. צנטריפוגה ב 8000 g x ~ 1 דקות, או עד המיקס עבר לחלוטין דרך המסנן. למחוק את הזרימה דרך ולהשתמש ברכבת התחתית ומפקחת
      הערה: RNA יתחיל מאיצים על התוספת של אתנול.
    4. להוסיף µL 650 מאגר לשטוף בכל מחסנית מסנן. צנטריפוגה ~ 1 דקות ב- 8,000 x g או עד המאגר כולו עבר. למחוק את הזרימה דרך ולסובב את המסננים דקות ~ 1 נוספים להסיר שאריות של המאגר לשטוף.
    5. להעביר את המסנן צינור אוסף ארנה טריים. להוסיף 100 µL של מים נטולי נוקלאז מחומם מראש (50-55 ° C) למרכז של המסנן. לחכות 2 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ~1.5 דקות ב- 8,000 x g או עד שזה עבר לתוך הצינור אוסף.

3. הגברה בסיבוב השני

  1. לסנתז את cDNA סטרנד הראשון (בסיבוב).
    1. ארנה העברה של צעד 2.5.5 לרכבת התחתית microfuge 200 µL, ואקום לרכז את µL 100 elutant 10 µL. שימוש בלי חום, להפעיל את מיכשור עבור מינימלית 65 השווה עם 10 µL של מים בצינור 200 µL כדי לאמוד את נפח מופחת.
    2. מחממים תנור אוויר הכלאה ל 42 º C.
    3. להוסיף 2 µL של hexamer אקראיים תחל הערכה IVT ארנה, בקצרה, מערבולת, ספין לאסוף את התוכן.
    4. דגירה הצינור microfuge-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב הצנטרפוגה תרמי ולאחר מכן מקם את זה על קרח.
    5. הכנת המיקס הבאה של מאסטר RT: 2 µL של 10 x הראשון מאגר סינתזת גדיל, µL 4 של dNTP מיקס, µL 1 של מעכב RNase ו µL 1 של האנזים ArrayScript. לערבב היטב בשפופרת 200 µL microfuge על ידי בעדינות vortexing, ואז לסובב כדי לאסוף את התוכן ומניחים על קרח.
    6. הוסף 8 µL של המאסטר RT מערבבים (קווצת הראשון) כדי כל שפופרת microfuge. מקום הצינורות חממה אוויר 42 ° C כבר שעתיים.
    7. להוסיף 1 µL של RNaseH התגובה לעיל. לערבב היטב על ידי pipetting 2 - 3 פעמים, כקבוצה – עלים 3 - 4 פעמים, ו ספין לאסוף את התוכן. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על מכונת ה-PCR. לאחר דגירה, המשך לשלב השני-strand סינתזה מיד.
  2. לסנתז את חוט השני-cDNA (בסיבוב).
    1. להוסיף 3 µL של פריימר T7-RA5 (ב 25 ng/µL עבודה דילול, בטבלה 2) ו- µL 2 של מים נטולי RNase כל מדגם cDNA. מערבבים היטב, ספין לאסוף את התוכן.
    2. ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב הצנטרפוגה תרמי דגירה. מניחים את התגובה על קרח.
    3. הכנת הבסיס RT לערבב (חוט השני) על קרח: µL 58 של נוקלאז ללא מים, µL 10 של 10 x מאגר סטרנד השני, µL 4 של מיקס dNTP ו 2 µL של ה-DNA פולימראז. מערבבים היטב בעזרת vortexing ו ספין לאסוף את התוכן. לשמור על הקרח.
    4. להוסיף µL 74 של המיקס הנ ל כל שפופרת מהשלב 3.2.2. לערבב היטב על ידי pipetting 2-3 פעמים, מצליף 3 - 4 פעמים, ואז לסובב כדי לאסוף את התוכן. לשמור על הקרח והחזק.
    5. מראש מגניב הצנטרפוגה תרמי עד 16 ° C על-ידי ביטול החום המכסה. למקם את הצינורות הצנטרפוגה תרמית עבור 2 h ב-16 ° c
    6. לאחר השלב השני-strand סינתזה, במקום הצינורות על קרח כדי להמשיך לשלב טיהור cDNA, או להקפיא ב-20 ° C.
      הערה: טיהור cDNA מומלץ לפני ההקפאה.
  3. לבצע טיהור cDNA (בסיבוב).
    הערה: כל centrifugations מבוצעות ב g x ~ 8,000 בטמפרטורת החדר. לחרוג 16,000 g x כדי למנוע נזק הדיו מסנן.
    1. להפעיל חימום נוקלאז ללא מים עד 50 – 55 ° C לשימוש מאוחר יותר בבלוק חימום יבשים. לחרוג 58 ° C כדי למנוע דנטורציה חלקית של cDNA.
    2. להעביר את cDNA צינור ללא נוקלאז 1.5 mL. להוסיף µL 250 cDNA איגוד מאגר כל שפופרת. בדוק פוחת משקעים במאגר, לחמם את בופר עד 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפזר מחדש. לערבב ביסודיות על ידי pipetting 2-3 פעמים, כקבוצה – עלים 3 - 4 פעמים. ספין לאסוף את התוכן.
    3. בחוזקה לשים את מחסנית מסנן cDNA הצינורות לשטוף. להוסיף את התערובת מעל למרכז של המסנן. צנטריפוגה ב 8000 g x ~ 1 דקות, או עד שזה דרך המסנן. למחוק את הזרימה דרך ולהחליף את צינור שטיפה.
    4. להוסיף 500 µL שטיפת המאגר. ודא אתנול נוספה למאגר לשטוף קודם לכן. צנטריפוגה ב 8000 g x ~ 1 דקות, או עד שזה דרך המסנן.
    5. למחוק את הזרימה דרך, צנטריפוגה שוב ב g 8,000 x ~ 1 דקות לרוקן את המחסנית. להעביר את המסנן cDNA שפופרת • תנאי cDNA.
    6. µL 8.5 של מים נטולי נוקלאז מראש ומחוממת חלות על המרכז של המסנן. לחכות 2 דקות, צנטריפוגה ב 8000 g x עבור ~1.5 מינימלית Elute שוב עם µL 8.5 נוספים של מים נטולי נוקלאז ומחוממת מראש.
      הערה: כפול גדילי cDNA שחזור נפח יהיה ~ 16 µL.
    7. המשך מיד שנייה IVT עגול או להקפיא את cDNA ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. לבצע סיבוב שני של ארנה הייצור על ידי IVT.
    1. הגדר תנור אוויר הכלאה 37 ° C (setpoint 36 ° C).
    2. להכין את תערובת הבסיס IVT בקרח לפי הסדר הבא: כדי µL 16 של cDNA eluted גדילי כפול מ שלב 3.3.7, להוסיף 4 µL של פתרון T7 ATP (75 מ מ); µL 4 בפתרון T7 CTP (75 מ מ); µL 4 בפתרון T7 GTP (75 מ מ); µL 4 בפתרון T7 UTP (75 מ מ); µL 4 T7 10 x תגובת המאגר; µL 4 של תערובת אנזימים T7. מערבבים היטב, ספין בקצרה כדי לאסוף את התוכן, והחזק על קרח.
    3. להוסיף µL 24 של המיקס מאסטר IVT כל שפופרת המכילה µL 16 של cDNA. מערבבים את התוכן על-ידי pipetting בעדינות וביסודיות. דגירה צינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 14 שעות.
      הערה: הדגירה עבור < 12 h השלכות חמורות על התשואה.
    4. להוסיף מים ללא RNase להגדיל את נפח כדי 100 µL ולעצור את התגובה IVT מטופלים 60 µL של הלא-DEPC.
  5. לבצע טיהור ארנה (בסיבוב).
    הערה: כל centrifugations מבוצעות ב g x ~ 8,000 בטמפרטורת החדר. לחרוג 16,000 g x כדי למנוע נזק הדיו מסנן.
    1. להפעיל חימום ~ 200 µL של נוקלאז ללא מים עד 50 – 55 ° C לשימוש מאוחר יותר בלוק חימום יבשים או מכונת ה-PCR. לחרוג 58 ° C כדי למנוע דנטורציה חלקית של ארנה.
    2. להעביר את ארנה צינור ללא נוקלאז 1.5 mL. להוסיף 350 µL ארנה איגוד מאגר כל מדגם ארנה. להוסיף 250 µL של ACS כיתה 100% אתנול כל צינור ולערבב 3 פעמים על-ידי pipetting (do לא מערבולת כדי לערבב ספין).
      הערה: RNA יתחיל מאיצים על התוספת של אתנול.
    3. להעביר את התמהיל מיד אל העמודה טיהור RNA על-ידי הוספתו בעדינות אל המרכז של מיכל הדיו מסנן. צנטריפוגה ב 8000 g x ~ 1 דקות, או עד המיקס עבר לחלוטין דרך המסנן. למחוק את הזרימה דרך ולהשתמש ברכבת התחתית ומפקחת.
    4. להוסיף µL 650 מאגר לשטוף בכל מחסנית מסנן. צנטריפוגה ~ 1 דקות ב- 8,000 x g או עד המאגר כולו עבר. למחוק את הזרימה דרך ולסובב את המסננים דקות ~ 1 נוספים להסיר שאריות של המאגר לשטוף.
    5. להעביר את המסננים צינור אוסף ארנה טריים. להוסיף 100 µL של מים נטולי נוקלאז מחומם מראש למרכז של המסנן. לחכות 2 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ~1.5 דקות ב- 8,000 x g או עד שזה עבר.
    6. Aliquot µL 2 צינור עבור ספקטרופוטומטרים (ב 260 ננומטר אורך הגל) ו- bioanalyzer התפשטה ניתוחים כדי לבדוק אם התשואה ארנה ואיכות.
      הערה: ריכוז חייב להיות לפחות 5 ng/µL; אחרת, דוחים את הדגימה. ניתן לאחסן את הדגימה לשנה ~ 1 ב-80 מעלות צלזיוס. הימנע ההקפאה-מפשיר הדגימות.
    7. בדוק את הדגימות באמצעות bioanalyzer להציג באופן חזותי ראוי הפצת מוצרים ארנה לפי הפרוטוקול של היצרן (איור 2).

4. מוגבר וניקוי של RNA פיצול

  1. לערבב הבאות על הקרח (µL הנפח הכולל 40, לשלב 2 צינורות של ארנה שאינם חופפים מדגם ברקודים): 36 µL ארנה (200 ng סה כ), 4 µL RNA פיצול המאגר. דגירה התערובת ב 94 ° C עבור 90 s.
  2. להעביר מיד את התערובת קרח ולהוסיף 4 µL RNA פיצול המאגר לעצור. לכוון את עוצמת הקול כדי 100 µL על-ידי הוספת 56 µL של נוקלאז ללא מים.
  3. להוסיף 350 µL RLT מאגר של הטיהור RNA קיט (ראה טבלה של חומרים) ומערבבים היטב על ידי pipetting. להוסיף 250 µL של EtOH, מערבבים היטב בעזרת pipetting, להעביר את הדגימה אל העמודה ספין טיהור RNA. ספין 15 s ב 8000 g x.
  4. להעביר את העמודה החדשה אוסף שפופרת ולהוסיף 500 µL RPE המאגר. ספין 15 s ב ג x 8,000 למחוק את הזרימה דרך. להוסיף 500 µL של 80% EtOH ו ספין למשך 2 דקות ב 8000 g x.
  5. להעביר את העמודה צינור אוסף חדש, המכסה פתוח של עמודה, ספין במשך 5 דקות במהירות מלאה.
  6. להעביר את העמודה צינור אוסף חדש, elute עם µL 16 של מים נטולי נוקלאז, מסתובב במהירות מלאה עבור 1 דקות.

5. ספריית הכנה

הערה: IVTs יכול להיות איחדו בשלב זה, אם אין חפיפה של ברקודים בשימוש. הפעם הטיפול פוספטאז הוא זמן טיפול של קינאז פולי-נוקלאוטיד 40 דקות הוא 1 h.

  1. כדי µL 16 של ארנה מפוצלים בשפופרת 0.7 מ ל PCR, להוסיף 4 µL של המיקס הבאים: 2 µL של 10 x פוספטאז מאגר µL 1 של פוספטאז האנטארקטי, µL 1 של recombinant ריבונוקלאז (למשל, RNaseOUT). דגירה ב הצנטרפוגה תרמי עם פרוטוקול הבאים: 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, והחזק ב 4 º C.
  2. כדי הצינור PCR מ ל 0.7 מ שלב 5.1, להוסיף 30 µL של המיקס הבאים: 17 µL של מים נטולי נוקלאז µL 5 של 10 x מאגר פוספטאז, 5 µL של ATP (10 מ מ), µL 1 של ריבונוקלאז רקומביננטי, 2 µL של PNK. דגירה ב הצנטרפוגה תרמי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, ואז תחזיק ב 4 º C.
  3. לבצע ניקיון עמודה של פוספטאז, שטופלו PNK ארנה.
    1. לכוון את עוצמת הקול כדי 100 µL על-ידי הוספת µL 50 של נוקלאז ללא מים. להוסיף 350 µL RLT מאגר ומערבבים היטב. להוסיף 250 µL של EtOH, מערבבים היטב בעזרת pipetting, להעביר את הדגימה אל העמודה ספין טיהור RNA.
    2. ספין 15 s ב- 8,000 x ג' להעביר את העמודה צינור אוסף חדש ולהוסיף 500 µL RPE המאגר.
    3. ספין 15 s ב ג x 8,000 למחוק את הזרימה דרך ולהוסיף 500 µL של 80% EtOH.
    4. ספין למשך 2 דקות ב- 8,000 g x. העברת העמודה צינור אוסף חדש, פתח את המכסה של עמודה, ספין במשך 5 דקות במהירות מלאה.
    5. להעביר את העמודה צינור אוסף חדש, elute עם µL 14 של מים נטולי נוקלאז, מסתובב במהירות מלאה עבור 1 דקות לשחזר אמצעי אחסון µL ~ 10 של חומר. למחוק את העמודה. להפחית את אמצעי האחסון ל- 5 µL באמצעות רכז ואקום ~ 10 דקות.
  4. 3' מאתרים ומפסיקים את מתאם באמצעות פרסומת קיט (ראה טבלה של חומרים).
    1. לדלל את 3' מתאם (RA3) מ- TrueSeq ערכת 3 קיפולים עם מים ללא נוקלאז ולאחסן את aliquots ב-20 ° C.
    2. כדי µL 5 פוספטאז, שטופלו PNK RNA, להוסיף 1 µL של מתאם מדולל 3'. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחר מכן מקם מיד את הצינורית על קרח כדי למנוע היווצרות מבנה שניוני.
    3. להוסיף 4 µL של המיקס הבאים: 2 µL של 5 x HM מצדו מאגר (HML), µL 1 של מעכב RNase ולאחר µL 1 של T4 RNA ליגאז 2 (מקוצר). דגירה הצינור על הצנטרפוגה תרמי מחומם מראש ב 28 ° C עבור h 1 (מחוממת או עם מכסה פתוח).
    4. עם הצינור התגובה שנותרו על הצנטרפוגה תרמי, להוסיף 1 µL של להפסיק פתרון (STP), בעדינות pipette האחסון כולו למעלה ולמטה 6 – 8 פעמים כדי לערבב ביסודיות. להמשיך דגירה הצינור התגובה על הצנטרפוגה תרמי ב 28 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן מקם את הצינורית על קרח.
    5. להוסיף 3 µL של מים נטולי נוקלאז להשיג את הנפח הכולל של µL 12 µL-6 שימוש ולאחסן את µL 6 הנותרים ב-80 מעלות צלזיוס.
  5. לבצע תגובה שעתוק במהופך.
    1. לשלב הבא בצינור PCR: 6 µL של RNA ובין אם-לא מתאם ו µL 1 של תחל RNA RT (RTP). דגירה הצינור ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן מקם באופן מיידי את הצינורית על קרח.
    2. להוסיף µL 5.5 של המיקס הבאים: 2 µL של 5 x הראשון מאגר סטרנד, 0.5 µL של מיקס dNTP 12.5 מ מ, µL 1 מ"מ DTT, µL 1 של מעכב RNase ולאחר µL 1 של רוורס טרנסקריפטאז. דגירה של צינור מחומם מראש הצנטרפוגה תרמי ב 50 ° C עבור 1 h ולאחר מכן מקם את הצינורית על קרח (יכול להישמר דגימות ב-20 ° C).
  6. לבצע הגברה PCR עם 11-15 מחזורים להעשיר 5', המוצר מחוברים 3'-פריימר.
    1. על כל תגובה שעתוק במהופך, להוסיף 35.5 µL של המיקס הבאים: 8.5 µL של מים אולטרא טהורים, 25 µL של ה-PCR מיקס (PML) ו- 2 µL של RNA PCR פריימר (RP1). על כל תגובה, להוסיף 2 µL של פריימר RNA PCR אינדקס ייחודי (RPIX, X = 1 עד 24).
    2. להגביר את צינור הצנטרפוגה תרמי באמצעות PCR אופניים בתנאים הבאים: 98 ° C ל 30 s; 12-15 מחזורים של 98 ° C עבור 10 s; 60 ° C 30 s; 72 ° C ל 30 s; 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; אז להחזיק ב 4 º C.

6. PCR מוצר ניקוי ובחירת גודל

  1. Prewarm AmpureXP beads מגנטי בטמפרטורת החדר. מערבולת החרוזים עד שהם מפוזרים היטב, לאחר מכן להוסיף 50 µL התגובה PCR 50 µL (1:1 PCR המוצר: חרוזים). לערבב את התוכן כדי פי 10 לערבב ביסודיות.
  2. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות במקום על דוכן מגנטי לפחות 5 דקות, עד שהנוזל נראה ברור. להסיר ולמחוק µL 95 של תגובת שיקוע.
  3. להוסיף 200 µL של טריות 80% EtOH. תקופת דגירה של פחות 30 s, הסר ואז להשליך תגובת שיקוע מבלי להפריע את החרוזים. חזור על זה פעם נוספת.
  4. מילה נהדרת את החרוזים למשך 15 דקות, או עד יבש לחלוטין. Resuspend עם µL 32.5 מאגר resuspension. Pipette האחסון כולו לאורך עשר פעמים לערבב ביסודיות.
  5. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דק המקום על דוכן מגנטי במשך 5 דקות, עד שהנוזל נראה ברור. להעביר 30 µL של תגובת שיקוע צינור. הוסף 20 µL של מים נטולי נוקלאז להשיג הנפח הכולל 50 µL.
  6. לבצע בחירת גודל של מוצרי ה-PCR עם הנייח הפיך (אלוהים אדירים) מעבדתי beads מגנטי.
    1. להוסיף x 0.7 נפח (35 µL) של אלוהים אדירים חרוזים הצינור שהוכנו שלב 6.5 ו לערבב ביסודיות על ידי pipetting. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. מניחים את הצינורית על דוכן מגנטי ולא לחכות 5 דקות או עד את החרוזים נפרדים. הסר את תגובת שיקוע בזהירות מבלי להפריע את החרוזים.
    3. להוסיף 200 µL של טריות 85% EtOH. המתן 30 s ולאחר מכן הסר EtOH. מילה נהדרת את החרוזים 10 דקות.
  7. הוסף 20 µL של נוקלאז ללא מים. מניחים את הצינור בחזרה על המגנט לחכות 5 דקות, פיפטה את החלק הנוזלי מבלי להפריע או לגעת את החרוזים. מאגר ה-DNA ב-20 ° C.

7. קביעה של ספריית כמות ואיכות

  1. בדוק את הריכוז של ה-DNA עם ספקטרופוטומטרים-260 גל nm (צפוי הריכוז הוא לפחות ~ 5 – 10 ng/µL).
  2. להפעיל 1 µL של כל מדגם bioanalyzer באמצעות שבב דנ א רגישות גבוהה לבחון את התפלגות גודל (צפוי שיא היא ב- 300-400 bp (ראה איור 3)).

8. ההגשה לדוגמה

  1. לשלב שאינם חופפים רצפי ה-PCR ברקודים (יחס 1:1). לדוגמה, לשלב מוצרי ה-PCR של דגימות עם RPI-1 ו RPI-2, RPI-3 RPI-4 יחד בכמויות nanogram שווה כל, על פי הרנ א רצף מדגם קלט סה כ כמות דרישה המלצות של הליבה.
  2. לאחר שילוב, להתאים את ריכוז מוחלט 5 ng/µL, לפחות אמצעי 10 µL או המומלצת על-ידי הליבה מתקן רצף.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, GABAergic העצב היו ידנית למיין (איור 1) ואז RNA היה מוגבר, הפך ספריית cDNA (איור 2) וסודרו עומק גבוה8. המוצרים RNA (ארנה) מוגבר נע בין 200 – 4,000 bp בגודל, עם התפלגות שיא מעט מעל 500 bp (איור 3 א). ספריית cD...

Discussion

המדריך מיון פרוטוקול מתאים רצפי RNA תחת פיקוח של נוירון אוכלוסיות שהן גם בדלילות שכותרתו במוח עכברים או הם המייצגים אוכלוסיה תא נדיר כי אחרת אינו אפשרי ללמוד באמצעות התא הנוכחי תפוקה גבוהה שיטות מיון של הגברה. התאים נתון FACS בדרך כלל עוברים לחצים קו נדן ודגימת בטווח של psi ~ 9 – 14, תלוי בגודל הח?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי ישנם אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH (5R01MH094705-04, R01MH109665-01 כדי Z.J.H.), על ידי הקרן Neuroscience רוברטסון CSHL (ל Z.J.H.), ועל ידי NARSAD לפוסט מלגת (אקולוגיה).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ERCC RNA Spike-In Control MixesThermo FisherCat# 4456740
SuperScript IIIThermo FisherCat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease InhibitorThermo FisherCat# 10777019
RNA fragmentation bufferNew England BiolabsCat# E6105S
RNA MinElute kitQiagenCat# 74204
Antarctic phosphataseNew England BiolabsCat# M0289
Poly nucleotide kinaseNew England BiolabsCat# M0201
T4 RNA ligase2, truncatedNew England BiolabsCat# M0242
Ampure Xp magnetic  beadsBeckman CoulterCat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beadsThermo FisherCat# B23317
DL-AP5TocrisCat# 0105
CNQXTocrisCat# 1045
TTXTocrisCat# 1078
Protease from Streptomyces griseusSigma-AldrichCat# P5147
Message Amp II kitThermo FisherCat# AM1751
CarbogenAirgasCat# UN3156
Sylgard 184Sigma-AldrichCat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kitIlluminaCat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chipAgilentCat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chipAgilentCat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F).LeicaModel MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.Warner instrumentsModel GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette pullerSutter Instruments CoP-97
VibratomeThermo MicromHM 650V
Vibratome tissue cooling unitThermo MicromCU 65

References

  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
  6. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  7. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  8. Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
  9. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
  10. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
  13. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  15. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140RNASeqUMI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved