JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

. הנה, נדגים את שיטות ויוו כימות של ליקוציט יציאה מן תמימה, מודלק, והעור מאתר ממאיר. אנו לבצע השוואת עפות בשני דגמים: transdermal FITC יישום, בחיי עיר photoconversion. יתר על כן, נדגים את התועלת של photoconversion עבור מעקב אחר ליקוציט היציאה של גידולים עורית.

Abstract

ליקוציט יציאה מן רקמות היקפיים ניקוז הלימפה אינה קריטית עבור מעקב המערכת החיסונית, חניכה, אך תורם גם הרזולוציה של רקמות היקפיים תגובות. בעוד מגוון שיטות משמשים לכמת ליקוציט יציאה מן הרקמות שאינם הלימפה, ציוד היקפי, המנגנונים תאית ומולקולרית המפקחים על היציאה תלויי-ההקשר נשארים ממעטים להבין. כאן, אנו מתארים את השימוש בבאתרו photoconversion לניתוח כמותי של ליקוציט יציאה מן העור מאתר וגידולים. Photoconversion מאפשר ישיר תיוג וחריגה של תושב תוך עורית. למרות חשיפה העור אור סגול גורם מקומי תגובות דלקתיות מאופיין ליקוציט ולחום, leakiness בכלי הדם, תוך השוואה ראש בראש עם יישום transdermal של קליעים נותבים פלורסנט, photoconversion במיוחד מתויג אוכלוסיות נודדות תא דנדריטי וזמין בו-זמנית כימות של יציאה מיאלואידית ו הלימפה מן microenvironments עורית וגידולים. המנגנון של היציאה ליקוציט רכיב חסר בהבנה שלנו של intratumoral ליקוציט מורכבות וובכך היישום של הכלים המתוארים במסמך זה יספקו תובנה ייחודית הדינמיקה של הגידול מערכת החיסון microenvironments שני בבית יציב המדינה, בתגובה לטיפול.

Introduction

תגובות חיסוניות רקמות היקפיים הם בצורת לא רק על ידי גיוס ליקוציט לאתרים של דלקת, אלא גם על ידי מנגנונים המסדירים השמירה הבאים שלהם. לפיכך, חיסון הגנתי מוכתב על ידי מנגנונים תאית ומולקולרית מצטברים הקובעים אם ליקוציט מזין, נשאר בתוך, או ליתר דיוק נודד מחוץ רקמות היקפיים דרך כלי הלימפה. חשוב, נטיה של לויקוציטים ליציאה רקמות דרך כלי הלימפה (הנקרא היציאה) מקושרת לפונקציות מיוחדות שלהן. תאים דנדריטים (DC) רוכשים התנהגות נודדות בתגובה אותות ההבשלה המוביל אנטיגן תחבורה המצגת ניקוז הלימפה (dLN), תהליך זה הוא הכרחי עבור חסינות מסתגלת1. ניקוי התאים מיאלואידית, כגון מקרופאגים, נויטרופילים, משמשים כדי לנקות פסולת אפופטוטיים להיפגע דרך phagocytosis. במהלך זיהום חיידקי, נויטרופילים רקמה זו אש מרגמות מדויקת בסופו של דבר עוברים אפופטוזיס dLNs2 , במודל של DSS-induced קוליטיס, נתונים תומך את ההשערה כי היציאה מקרופאג הכרחי לפתרון דלקת מקומית3. אם היציאה נויטרופילים, מקרופאג מתרחשת בכל ההקשרים דלקתיות, לעומת זאת, אינו ידוע. ראיות של לימפוציטים-T יציאה מן מצב יציב4,5,6,7, נגוע8ו מודלק4,9,10, 11,12 הפריפריה, שאינם הלימפה ברקמות מציין כי בתאי T recirculate באופן פעיל, על פי האותות רקמות מבוסס כונן היציאה הזאת להישאר ממעטים להבין. מספר מחקרים זיהו אותות הדרושים להעברת כיוונית לעבר ניקוז לימפטי נימים ובעקבות זו אש מרגמות מדויקת כולל ליגנד כימוקין (מוטיב C-C) 21 (CCL21) והקולטן שלו CCR74,11, 13, ליגנד כימוקין (מוטיב C-X-C) 12 (CXCL12) שלו קולטן CXCR42,14, ו sphingosine-1-פוספט (S1P)10,15,16. מנגנונים אלה אינם פעילים בכל ההקשרים, אולם, בין אם הם לקבוע את היציאה של כל סוגי תאים נותרת שאלה פתוחה. חשוב, עוד תובנה המנגנונים המפקחים על היציאה והקשר שלה פונקציונלי במחלה דורש שיטות כמותיות ויוו של ניתוח.

מספר שיטות השתמשו כדי לכמת את היציאה מספר מודלים ויוו כולל תעלות ישיר של כלי הלימפה, העברת המאמצת של ex-vivo שכותרתו לויקוציטים, יישום transdermal של קליעים נותבים פלורסנט, זריקה של חלקיקים שכותרתו, ויוו photoconversion17,18. תעלות ישיר של כלי הלימפה מביא העכבר הוא מוגבל בחיות קטנות על-ידי אמצעי האחסון של נוזלים הניתנים לאיסוף וקשה. לפיכך, תעלות במידה רבה בוצעו חיות גדולות (למשל., כבשים) איפה מעשי כזה מניפולציות כירורגי. מחקרים אלה מספקים עדות ישירה נוכחות של תאי הלימפה והן מיאלואידית הלימפה10,19,20. יתר על כן, מודלים ovine חושפים כי דלקת אקוטי וכרוני מוגבר לימפוציט נוכחות לימפה בגיל10,כמעט 100-fold21.

העברת המאמצת של לימפוציטים שכותרתו, גנטי חשוב חשף כי CCR7 נדרש עבור היציאה של CD4+ T תאים מן העור מודלק בחריפות5,11, ואילו רעלני של לימפוציטים עם מולקולת קטן S1P קולטן אגוניסט, FTY720, מעכב באופן חלקי בלבד שלהם היציאה10. מעניין, היציאה של לימפוציטים שהועברו מן העור דלקתי כרוני הוא תלוי-CCR710, אך עשויים לדרוש חלקית CXCR49. העברת המאמצת ניסויים, עם זאת, לספק מספרים שאינם-פיזיולוגיים של לשעבר vivo מופעל ומתויגים לימפוציטים לתוך רקמות באמצעות הזרקה, אשר כמושפע ביו-מכני של רקמות, לחצים מוגברות של נוזל בין-תאי זה פתח נימי הלימפה הראשונית, לשנות את המאפיינים שלהם תחבורה22. כיישום transdermal חלופית, של fluorescein isothiocyanate (FITC), נוכחות או היעדרות מגירויים עורי (למשל., dibutyl פתלאט, DBP) או זיהום23,24 מאפשר המעקב אחר התאים phagocytic מעקב ולצבור להגר dLNs. באופן דומה, גידולים fluorescently שכותרתו לספק אמצעי כדי לעקוב אחר תאים phagocytic שכילו הגידול גשמי25. שיטות אלה סיפקו חשוב תובנה המנגנונים למשול DC היציאה13,14,17,26,27 , אך אינם מסוגלים לעקוב אחר שאינו-phagocytic יכול להיות מסובך לימפוציטים ופרשנות, ניקוז לימפטי חינם של FITC מסיסים ובכך תיוג עופות נודדים, DCs תושב LN.

לחלופין, מיקרוסקופ intravital הוא כלי רב עוצמה המאפשר מעקב ויוו לאוכלוסיות ליקוציט רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בזמן אמת28,29. משתמשים בה בשילוב עם הכתב עכברים, נוגדן מבוססי ויוו immunofluorescent תיוג, intravital מיקרוסקופ חשפה את המתחם המרחבי וסלולרי הדינמיקה הטמפורלי של החיסון ההעברה אינטרסטיציאליות, סחר בבני אדם, לרבות30 , גלגול על פני אנדותל הלימפה, המעבר בתוך לומן הלימפה, ואת ההעברה על בעוד ערך28,31. אימוץ רחב של טכניקות הדמיה intravital מוגבל על ידי הוצאות, המומחיות הנדרשת עבור ערכת, מוגבל תפוקה לכימות תנועת סוגי תאים מרובים. עדיין, צימוד שיטות כמותיות לנתח המלאכותיות רקמות עם הדמיה intravital יספקו תובנה מכניסטית נוספים וחשובים לגבי המנגנונים של תנועתיות והעברה לקראת ובתוך נימי הלימפה 18 , 31 , 32.

כתוצאה מכך, אין ויוו photoconversion התפתחה שיטה המאפשרת בחיי עיר תיוג, עצמאית של הפעילות phagocytic, וגם עבור כימות של היציאה ליקוציט פיזיולוגיים (בשילוב עם cytometry זרימה) ב- היעדרות או נוכחות של אתגר. קאךה-Tg עכברים מביעים צורונים חלבון מבודד אלמוג זה מוצגים ירוק קרינה פלואורסצנטית (קאךה ירוק) עד נחשפים באור סגול, לאחר מכן הוא בלתי הפיך ממיר פלואורסצנטי אדום (קאךה אדום)33. ניתן לעקוב Photoconverted תאים כמו זו הם אש מרגמות מדויקת מאתרי רקמות היקפיים להצטבר dLNs. זה ו אחרים דומים photoconvertible העכבר מודלים34,35 חשפו חשוב ביולוגיה כולל יציאה המכונן של תאי T רגולטוריים מן העור36, תלויי-CXCR4 תא B יציאה מן כתמים של פייה37 , גיוס בתאי T הזיכרון תושב פפטיד לאתגר מחדש38, ועל יציאה רחבה ליקוציט מן הגידול microenvironments39. במסמך זה, אנו מבצעים השוואה ראש בראש של photoconversion עם יישום FITC transdermal בהקשר של עורית דלקת ולדלקת כדי לאפשר השוואה ישירה של נתונים קיימים עם השיטה photoconvertible. יתר על כן, אנו מדגימים photoconversion גידולים מושתל, לתאר את יעילות ההמרה ויציאה סלקטיבי של גידול microenvironments. ככזה, אנו טוענים עוד יישום של שיטות אלה המצריך התירי הביולוגיה קריטי של ליקוציט יציאה מן גידולים, אשר יהיו השלכות משמעותיות על פענוח intratumoral ליקוציט המורכבות, אנטי הגידול חסינות, ו תגובה לטיפול.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אורגון לבריאות & ומדע באוניברסיטת.

1. אינדוקציה של דלקת FITC ציור של העכבר פינה

  1. ב תא למינארי, עזים ומתנגד עכבר C57Bl/6 באמצעות isofluorane מתאדה (זירוז ב 3-5% isofluorane ולשמור על 1-3% isofluorane; קצב הזרימה חמצן ב 0.5-1.0 L/min). להבטיח ההרדמה המתאים על-ידי פיקוח על האובדן של רפלקס פדלים, תנועות לא רצוניות וקצב נשימה מופחתת.
  2. שכב אוזן שטוח עם הצד הבטני של האוזן כלפי מעלה. Pipet 20 µL של 5% FITC פתרון מומס פתלאט אצטון 1:1: dibutyl (DBP) בצד הגחוני של האוזן פינה. לאפשר את האוזן לייבוש למשך כמה שניות.
  3. 24 שעות לאחר יישום FITC, המתת חסד העכברים בעזרת חשיפה פחמן דו-חמצני ואחריו נקע בצוואר הרחם. לאסוף את האוזן pinnae לתוך PBS על-ידי הפרדת האוזניים מהראש באמצעות מספריים. לאסוף את dLNs צוואר הרחם ואת ההגירה הלא-ניקוז מפשעי לתוך PBS באמצעות פינצטה כדי להפריד בין שירותי ההגירה מן הרקמות הסובבות. ההגירה הלא-ניקוז מפשעי ישמש פקדים שלילי לנוכחות של לויקוציטים /Kaede אדום+ FITC+. תשליך הגוויות לכל פרוטוקול מוסדיים.
    הערה: photoconversion פוסט הזמן האופטימלי לניתוח תלויות סוג התא והתנהגויות נודדות ידוע. תאים דנדריטים, לדוגמה, ניתן להבחין ב- dLNs מוקדם כיישום DBP פוסט 6-אייץ '.

2. אינדוקציה של דלקת Photoconversion של העכבר פינה

  1. ב תא למינארי, עזים ומתנגד עכבר קאךה-Tg (רקע C57Bl/6) על ידי הזרקת בקרום הבטן של קטמין 80 מ"ג/ק"ג ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים מומס בתוך תמיסת מלח. ודא ההרדמה המתאים כמתואר ב- 1.1 שלב.
  2. שכב אוזן שטוח עם הצד הבטני של האוזן כלפי מעלה. Pipet 20 µL של 1:1 אצטון: DBP בצידי הגחון פינה האוזן. לאפשר את האוזן לייבוש למשך כמה שניות.
  3. לאחר יישום DBP, לחתוך חתך בתוך פיסת נייר אלומיניום ומשוך את האוזן דרך הסדק לחשוף את האוזן למקור אור סגול. להשתטח האוזן עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי כדי לאבטח את האוזן רדיד האלומיניום.
  4. מקם את האוזן ישירות תחת מקור האור, ו- photoconvert למשך 3 דקות באמצעות מקור אור 405 ננומטר-100 מגה-וואט חשמל.
  5. 24 שעות לאחר photoconversion, המתת חסד העכברים קאךה-Tg, לקצור את האוזן pinnae ההגירה צוואר הרחם, סוכנות ההגירה מפשעי כפי שמתואר בשלב 1.3.
    הערה: בנוסף שיקולים מצוטט שלב 1.3, שיעור של התפשטות יקבע את התזמון של ניתוח כמו האובדן של אדום קאךה תתרחש במהירות חלוקת תאים.

3. vaccinia זיהום של העכבר פינה ויישום FITC

  1. עזים ומתנגד עכבר C57Bl/6 עם isofluorane מתאדה כפי שמתואר בשלב 1.1.
  2. להניח בצד הגחוני של האוזן שטוח. Pipet 5 x 106 ויוצרים רובד יחידות (PFU) של וירוס vaccinia (VacV) מעורבבת עם µL 10 ל- PBS אל פינה האוזן. באמצעות מחט 29-מד, לתקוע את פינה 25 פעמים40.
  3. 24 שעות לאחר הפגיעה, עזים ומתנגד עכברים נגועים VacV עם isofluorane כפי שמתואר בשלב 1.1 ו- pipet 20 µL 5% FITC מומס אצטון על הצד הבטני של פינה האוזן. לאפשר את האוזן לייבוש למשך כמה שניות.
  4. 24 שעות לאחר יישום FITC, המתת חסד העכברים ולאסוף את pinnae האוזן, סוכנות ההגירה צוואר הרחם, סוכנות ההגירה מפשעי כפי שמתואר בשלב 1.3.
    הערה: FITC ניתן להחיל על כל זיהום פוסט נקודת זמן כדי לקבוע DC סחר במרווחי זמן שונים 24 שעות ביממה. בעבר דיווחנו כי ההעברה DC ל- dLNs נשמרת ברמות דומות מיום 1 עד 3 פוסט זיהום41.

4. vaccinia זיהום של העכבר וגם Photoconversion.

  1. עזים ומתנגד עכבר קאךה-Tg עם isofluorane מתאדה כפי שמתואר בשלב 1.1.
  2. להדביק את פינה האוזן עם VacV כפי שמתואר בשלב 3.2.
  3. 24 שעות לאחר הפגיעה, עזים ומתנגד עכברים נגועים VacV קאךה כפי שמתואר בשלב 2.1 ולבצע photoconversion כמתואר בצעדים 2.3 2.4.
  4. 24 שעות לאחר photoconversion, המתת חסד העכברים, לקצור את האוזן pinnae ההגירה צוואר הרחם, סוכנות ההגירה מפשעי כפי שמתואר בשלב 1.3.
    הערה: כפי שצוין לעיל ב- 3.4 שלב, photoconversion יכול להינתן על זיהום פוסט בכל נקודת זמן.

5. האוזן הלימפה עיבוד עבור Cytometry זרימה

  1. ליצור תא בודד השעיות של האוזן pinnae: לקלף לגזרים את הצדדים הגחון הגבי של פינה האוזן באמצעות שני זוגות פינצטה ומקום עם החלק הפנימי של האוזן כלפי מטה לתוך הבארות של צלחת 24-ובכן המכיל 1 מ"ג/מ"ל collagenase D ו- 80 DNase U/mL מדולל ב Buffered מלוחים פתרון (HBSS של האנק) (מכיל2 + Ca ו- Mg2 +). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות העיתונות הרקמה מתעכל דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר.
  2. ליצור תא בודד המתלים של ההגירה: מקום ההגירה בבארות של צלחת 24-ובכן המכיל 1 מ"ג/מ"ל collagenase D ו- 80 DNase U/mL מעורבבת עם HBSS. פתח מתגרה הצומת לימפה קפסולת באמצעות שתי מחטים 29-מד ולאחר מכן דגירה בלוטות הלימפה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות הקש הרקמה מתעכל דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר.

6. intradermal מלנומה הגידול השרשה, Photoconversion.

  1. לגלח את הפרווה מהמרכז של החלק האחורי של עכבר קאךה-Tg באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
  2. הצב מחט 29-מד במרכז הגב בין השכם השמאלי ואת הימני העליון, ולאחר intradermally להזריק 5 x 105 תאים סרטניים (מדולל ב- 50 µL של תמיסת מלח) לתוך העור של עכברים קאךה-Tg. גידולים להיות ממוקם היטב כדי להבטיח ניקוז לימפטי שצוין הלימפה (קרי, נחתכו ישר ושמאלה ההגירה עבור גידולים ממוקם באמצע הגב העליון). הימנע מהנחת הגידול מעל dLN כמו התוצאה יכולה להיות ישירה photoconversion של שירותי ההגירה דרך הגידול/העור.
  3. לאפשר הגידולים לגדול לגודל הרצוי (100-650 מ מ3).
  4. יום אחד לפני אוסף רקמה, עזים ומתנגד עכבר קאךה-Tg כמתואר ב- 2.1 ולגלח לשום פרווה regrown לאחרונה סביב הגידול.
  5. לחתוך חור עגול בנייר אלומיניום ומשוך את הגידול לחשוף את הגידול מקור האור. לחתוך את החור מעט קטנה יותר הגידול כדי למנוע את הגידול נופל חזרה דרך החור ולצמצם את ההמרה של סמוך, שאינם סרטניים בעור.
  6. מקם את הגידול ישירות מתחת מקור האור ואת photoconvert במשך 5 דקות באמצעות מקור אור 405 ננומטר ב 200 mW הספק.
  7. 24 שעות לאחר photoconversion, המתת חסד העכברים כפי שמתואר בשלב 1.3. לאסוף את גידולים, dLNs נחתכו, ההגירה הלא-ניקוז מפשעי לתוך PBS. הגידולים מן העור שמסביב באמצעות מספריים לחתוך ולהסיר ההגירה כפי שמתואר בשלב 1.3.

7. הגידול ואת הצומת לימפה עיבוד עבור Cytometry זרימה

  1. ליצור תא בודד המתלים של הגידולים: מינצ הגידולים עם מספריים לתוך בארות של צלחת 24-ובכן המכיל 1 מ"ג/מ"ל collagenase D ו- 80 DNase U/mL מעורבבת עם HBSS. דגירה ב 37 ° C עבור ה 1 לחץ על הרקמה מתעכל דרך מסננת ניילון 70 מיקרומטר.
  2. ליצור תא בודד השעיה של בלוטות הלימפה כפי שמתואר ב- 5.2 שלב.

8. נוגדן צביעת עבור Cytometry זרימה

  1. לאחר מעכל הרקמות לתוך תא בודד המתלים, לבצע טכניקות צביעת cytometry זרימה רגילה לסמן את התאים עם סמנים של עניין. בקצרה, pipet 2 x 106 תאים לתוך צלחת 96-ובכן. דגירה הדגימות עם גוש Fc (1 µg/mL) במשך 20 דקות על הקרח; לשטוף פעמיים עם FACs מאגר (1% שור אלבומין ב- PBS). להוסיף כתם חי/מת (מדולל ב- PBS) הדגימות, תקופת דגירה של 15 דקות על הקרח; לשטוף פעמיים עם מאגר FACs. דגירה עם נוגדנים הראשי (טבלה של חומרים) מדולל במאגר FACs במשך 30 דקות על הקרח; לשטוף פעמיים עם מאגר FACs.
    הערה: קאךה ירוק, קאךה פלואורסצנטי אדום חופף fluorophores FITC ו- PE; לפיכך, FITC ו- PE-מצומדת נוגדנים לא ניתן להשתמש בשילוב עם קאךה חלבונים.
  2. לאחר צביעת, להפעיל את הדגימות cytometer זרימה. לחלופין, לתקן את התאים עם 2% מחברים.

9. לזרום Cytometry ניתוח

  1. הגדר את FITC (קאךה ירוק) ואת PE (קאךה אדום) ערוץ PMT מתח ל- 70-80% של הטווח הכולל (מרכז אוכלוסיה בקירוב 104) באמצעות שמחוץ קאךה ירוק או אדום קאךה חד-צבעי splenocytes או דם.
    הערה: לא תפצה קאךה ירוק (FITC) ולערוצים קאךה אדום (PE) כמו התוצאה תהיה אות רבתי להתפשט.
    1. כדי ליצור פקדים קאךה צבע יחיד, לאסוף של הטחול או דם עכבר קאךה-Tg. Lyse כדוריות דם אדומות עם מאגר ACK, אז התאים מתחלקים לשתי קבוצות: קווקוו ללא המרה קאךה המומר וירוק קאךה אדום.
    2. צבע יחיד קאךה פקדים אדום, להשעות את התאים 1 מ"ל ל- PBS, photoconvert לתוך צלחת 24-טוב עבור 5 דקות באמצעות מקורות אור 405 nm ב כוח של 100 מגה-וואט. השתמש תאים אלה כדי לקבוע את קאךה ירוק (FITC) ואת קאךה המתחים PMT אדום על cytometer הזרימה (שלב 9.1).
  2. ברגע החשמלי של החלבונים קאךה הוגדר, לפצות על כל שאר כתמי נוגדן ראשוני באמצעות יחיד-fluorophore שכותרתו פיצויים חרוזים לפי הוראות היצרן.
  3. להפעיל את הדגימות cytometer זרימה כדי לאסוף נתונים.
    הערה: החלבון קאךה הוא ללא הרף להיות מיוצר על ידי התאים. פירוש הדבר הזה 24 שעות לאחר photoconversion, התאים שהומרו יהיה זוגי חיובית עבור קאךה ירוק, חלבון קאךה אדום כמו שזה עתה מסונתז קאךה (ירוק), צבר בתא.
  4. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת FlowJo או תוכנה דומה.

תוצאות

אנחנו קודם ביקשו לשכפל את התוצאות photoconversion שפורסמו בספרות כדי להעריך את היעילות ולקבוע המשויכים דלקת בעור העכבר. פינה האוזן נחשף לאור mW סגול 100 (405 ננומטר) במשך 3 דקות כאמור תיאר33. יחיד המתלים התא שנוצר בעור האוזן או צוואר הרחם dLNs מיד בעקבות החשיפה גילה של יעילו...

Discussion

למרות היציאה ליקוציט רקמות היקפיים, שאינם הלימפה הוא קריטי עבור החניכה, ברזולוציה של תגובות חיסוניות, המנגנונים המולקולריים המפקחים על היציאה הם הבינו כהלכה. פער זה הידע נובע במידה רבה מוכן הזמינות של כלים כימות בתוך vivo. כאן, אנו מתארים את השימוש photoconvertible עכברים (קאךה-Tg) לכמת ליקוציט א...

Disclosures

המחברים לך אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות ד ר מרקוס Bosenberg למתן YUMM 1.1, YUMM 1.7 מלנומה מאתר קווים, ד ר דבורה ג'יי Fowell למתן B6. עכברים 15Utr cg-Tg(CAG-tdKaede) מסכים עם RIKEN BRC דרך ביו-משאב לאומי של MEXT, יפן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtorPrizmatix LtdV8144
Fluorescein isothiocyanate isomer ISigma-AldrichF4274
dibutyl phthalateSigma-Aldrich524980
acetoneMacron Fine Chemicals2440-02
29-guage syringesExel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
70 um cell strainersVWR732-2758
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (clone 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (clone 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (clone M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)BD Biosciences563726
Bovine serum albumin (Fraction V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle SetBD Biosciences552845
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences
FlowJo v10 SoftwareFlowJo

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143FITC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved