JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ג'יברלין תפיסה חיישן 1 (GPS1) הוא הראשון פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת החיישן למדידת רמות הסלולר של ג'יברלין phytohormones עם רזולוציה גבוהה ייתכן. פרוטוקול זה מדווח על השיטה כדי להמחיש ולכמת רמות ג'יברלין הסלולר באמצעות את החיישן nlsGPS1 גנטית מקודד ב hypocotyls תודרנית וטיפים שורש.

Abstract

ג'יברלין phytohormone (ג'י אי) הוא מולקולה איתות קטן, נייד זה ממלא תפקיד מפתח נביטת הזרעים, התארכות הסלולר ומעברים התפתחותית בצמחים. ג'יברלין תפיסה חיישן 1 (GPS1) הוא הראשון פורסטר תהודה אנרגיה ההעברה (סריג)-מבוסס ביוסנסור המאפשר ניטור של רמות GA הסלולר ויוו. על ידי מדידת פליטת קרינה פלואורסצנטית יחס של גרעיני מקומי-GPS1 (nlsGPS1), ייתכן מיפוי של מעברי צבע endogenously, exogenously שסופקו GA בסוגי רקמות שונות הוא ריאלי בקנה מידה הסלולר. פרוטוקול זה יתאר כיצד תמונה nlsGPS1 יחסי פליטה בניסויים דוגמה 3: מצב יציב, לפני ואחרי אקסוגני ג'יברלין א4 (GA4) טיפולי, ושוב פעם-קורס טיפול. כמו כן, אנו מספקים שיטות לנתח יחסי פליטה nlsGPS1 באמצעות תוכנת הדמיה וניתוח micrograph (תלת-ממדי) תלת ממדי מסחרי והן פיג'י ולהסביר את המגבלות ואת החסרונות סביר של שימוש nlsGPS1 כדי לכמת את רמות ג'יברלין.

Introduction

הורמונים צמחיים תפקיד מהותי צימוח ופיתוח. אלו מולקולות איתות קטן, נייד מוסדרים בדרך כלל במספר רמות, כגון ביוסינטזה, קטבוליזם distance קצר וארוך תחבורה1,2,3,4. ההבנה של הורמון איתות המסלולים ותגובות תעתיק במורד הזרם חידדה לאורך השנים. עם זאת, כדי לקשר את התגובות הסלולר מגוונות של המסלולים איתות הורמון עם הקלט רגולטוריות בימוי הורמון הפצות, אנחנו דורשים כימות ייתכן של רמות ההורמונים בקנה מידה הסלולר. ביולוגיים מבוסס סריג שיכול לזהות phytohormones יכול לקדם את היכולת המדענים לכמת את רמת ההורמונים בקנה מידה הסלולר. מבוסס סריג ביולוגיים מורכבים של זוג קשת/קשתית (התורם ואת מקבל פלורסנט חלבונים) קשורים לתחום החישה נקשר ליגנד מסוים או מגיב לגירוי ביולוגי. עבור מולקולה קטנה ביולוגיים, איגוד ליגנד מפעיל לשינוי הסתגלותי של התחום החושי המביא שינוי מרחק ו/או התמצאות בין שני סוגי החלבונים פלורסנט של זוג סריג. ניתוח רציומטרי של ביוסנסור סריג מושגת על ידי מדידת פליטת קרינה פלואורסצנטית יחס מקבל מעל5,תורם6ומרגש התורם. ליגנד איגוד הוא לזיהוי בשינוי היחס הזה פליטה7.

לאחרונה פיתחנו ביוסנסור מבוסס סריג של ההורמון צמח גז GA. הם קבוצה של הורמונים זה יכול לקדם את נביטת הזרעים, התארכות הסלולר ואת המעבר התפתחותית של צמח פורח שלבים. החיישן nlsGPS1 הוא הגרעין לשפות אחרות, מספק תובנות ייתכן GA dynamics ברקמות הצמח מגוונות. תודרנית תאים, GA נקשר לקולטנים מסיסים, גמד ג'יברלין-רגישות (GID), ומשרה המתחם ההשפלה של חלבונים דלה לשמש הרגולטורים שלילי של GA איתות2. התחום החושי GA של nlsGPS1 מורכב של הקולטן תודרנית GA (AtGID1C) קשורה לחיתוך חומצה אמינו 74 של חלבון דלה (AtGAI), זוג סריג המורכב משופרות dimerization וריאציות של Cerulean כמו החלבון הניאון תורם, אפרודיטה (המגוון codon ונוס) כמו חלבון פלואורסצנטי מקבל8. החיישן nlsGPS1 הוא חיישן זיקה גבוהה עבור GA ביואקטיביות4 (Kd = 24 nM עבור GA4), זה יכול להיות מנוצל בסוגים מגוונים רקמות-כדי למפות ולכמת GA מעברי צבע. כדי להימנע פירוש מוטעה של רמות תודרנית GA ויוו, פיתחנו גם משתנה מצבו של nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) להשתמש כפקד שלילי. החלבון nlsGPS1-NR נושא מוטציות בכיס GA מחייב כי לשבש את הכריכה של GA, מוטציות החלבון דלה לשבש את האינטראקציה עם GID קולטן חלבוני7,9. תבניות פליטת יחס או השינויים בקווים הן nlsGPS1 והן nlsGPS1-NR יכול להיחשב חפצים הקשורים ישירות לא מחייב GA אירועים. חשוב גם לציין כי איגוד nlsGPS1 GA4 הוא בלתי הפיך במהירות, לכן, יש לפרש nlsGPS1 הסלולר פליטה יחסי כמייצג את הריכוז האחרונות הגבוהה של GA גרעין נתון יותר מאשר את בזמן אמת רמות מצב יציב. כתוצאה מכך, ניתוח של רמות GA נופלים אינה אפשרית עם nlsGPS1.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט של ביוסנסור nlsGPS1 בתאים של הצמח דגם תודרנית, שימוש בגישות קונאפוקלית מבוססת הדמיה ברזולוציה ניצול. הפרוטוקול מספקת מידע על שורשי צמחים הדמיה ו- hypocotyls-מצב יציב וגם לאורך זמן-קורסים. באופן פוטנציאלי יכול להיות מנוצל החיישן nlsGPS1 סוגי רקמות מגוונות, כמו גם בכל מיני צמחים, כדי למפות ולכמת הפצות GA.

Protocol

1. תכשירים

  1. להכין ½ Murashige ו- Skoog אגר pH 5.7 עם לא סוכרוז (1 ליטר).
    1. להמיס 2.2 גר' בינוני הבזליים Murashige ו- Skoog (MS) ב- 950 מ ל מים הנדסה גנטית. להתאים את ה-pH ל 5.7 עם 5 מ' KOH.
    2. לפצות את הפתרון הסופי נפח של 1 ליטר מים הנדסה גנטית. לחלק זה שני בקבוקים 500 מ"ל, כל אגר המכיל 1% צמחי. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  2. להכנת נוזל ¼ MS ב- pH 5.7 עם לא סוכרוז (1 ליטר).
    1. להמיס 1.1 גר' MS ב- 950 מ ל מים הנדסה גנטית. להתאים את ה-pH ל 5.7 עם 5 מ' KOH. לפצות את הפתרון הסופי נפח של 1 ליטר מים הנדסה גנטית. לחלק זה שני בקבוקים 500 מ"ל. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  3. להכין GA4.
    1. להמיס את המשחק4 אתנול 70% כדי להפוך ריכוז סופי של 100 מ מ GA4 מניות.
    2. כדי להכין הפתרון עובד, לדלל את המניה4 GA 0.1 – 1 מיקרומטר ¼ MS נוזלי רמת החומציות 5.7.

2. צימוח

  1. לחטא את הזרעים תודרנית .
    1. עבודה בעזרת ברדס כימי. Aliquot זרעים (כ-200) לתוך צינורות microcentrifuge 2 מ"ל. להשתמש את סמן עם כלור עמיד דיו ולמקם הצינורות בשלמותם פתוח בתוך הכלי עיקור (קופסה גדולה יכול להיות סגור).
    2. במקום גביע 250 מ ל המכיל 50 מ של מים הנדסה גנטית, 50 מ של נתרן תת-כלורי פתרון בתוך הכלי עיקור.
    3. להוסיף 3 מ"ל של חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCl) הספל. מייד לאטום את כלי הקיבול ולאפשר עיקור באמצעות גז כלור עבור h 6-16.
    4. לאחר unsealing את כלי הקיבול, סגור את המכסים כל הצינורות microcentrifuge בארון זרע. זרעים סטיריליים ניתן לאחסן יבש עד הזמן של ציפוי.
  2. לזרוע כ 20 סטיריליים תודרנית זרעים על ½ MS אגר צלחות מרובע. חותם הצלחות עם הדבקה נקבובי, עוטפים אותם עם רדיד אלומיניום. דגירה אותם ב 4 ° C 1 – 3 ימים ריבוד.
  3. עבור הדמיה שורש, להעביר את הצלחות אל התא צמיחה בצורה מאונכת במשך 3 ימים עם התנאים הצמיחה הבאים: יום ארוך תנאים (LD, h 16 של אור/8 h של אפל); 120 µmol⋅m-2s-1 עוצמת האור; בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס (במהלך מחזור אור) או 18 ° C (במהלך מחזור כהה), 65% לחות יחסית (RH).
  4. עבור hypocotyl תוצרת אפל: להעביר את הצלחות לתא צמיחה דופק אור של 1-4 h כדי לסנכרן את הנביטה. לעטוף את הצלחות ברדיד אלומיניום ומניחים אותם אל החדר צמיחה בצורה מאונכת במשך 3 ימים.

3. הכנת הדוגמא

  1. מידות מצב יציב (איור 1A)
    1. בשקופית מיקרוסקופ נקי, להוסיף 50 µL של ¼ MS נוזל (הנקרא מעכשיו כפתרון מעושה). בעדינות העברת השתילים לבטא nlsGPS1 מהצלחת לשקופית.
    2. קח coverslip נקי, ספוט טיפת שומן ואקום בכל פינה של coverslip. הנח בעדינות את coverslip מעל השתילים ומוסיפים בזהירות את פתרון מדומה נוסף כדי להסיר את כל בועות האוויר.
  2. GA4 טיפול: ניסוי כימי exchange (איור 1B).
    1. לפני הטיפול4 GA, השתמש מזרק 20 מ"ל מלא שומן ואקום (מצורף טיפ pipet) כדי לצייר מלבן (אורך: 3.5 ס"מ, גובה: 2.5 ס מ) עם שכבה אחידה של ואקום גריז על משטח זכוכית נקי (איור 1B). כדי לאפשר קו דק של גריז ואקום, הטיפ pipet צריך להיות חתוך יש פתיחה של 1 מ מ קוטר.
    2. להוסיף 50 µL של פתרון מדומה השקופית זכוכית. עם מלקחיים נקי, לבחור את השתילים nlsGPS1 ומניחים בעדינות על הפתרון המדומה. כדי למנוע נזק, להעביר את השתילים על-ידי תמיכה של undersides של פסיגי הזרע ללא האוחז שתיל עם המלקחיים.
    3. קח coverslip נקי, ספוט טיפת שומן ואקום בכל פינה של coverslip. עם המלקחיים, מניחים את coverslip במרכז המלבן גריז ואקום. עכשיו coverslip אטומה משני הצדדים התואם את הקצוות ארוך של המלבן גריז ואקום.
    4. להוסיף בזהירות פתרון מדומה נוסף כדי למלא את המאגר ולהסיר כל בועות אוויר בתוך המאגר מבלי להפריע את seedling(s) פנימה.
    5. רוכשים את התמונות לפני הטיפול4 GA באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בצע את ההוראות כמתואר בסעיף 4 של פרוטוקול זה.
    6. לטיפול4 GA, הסר השקופית מיקרוסקופ קונפוקלי הבמה. הגדרת שעון עצר עבור 20 דקות.
    7. לאחר הפעלת הטיימר, להחליף את בופר עם ¼ MS נוזל המכיל 1 מיקרומטר GA4. להוסיף את הפתרון4 GA (כ-50 µL) מהצד השמאלי של coverslip ולהסיר הפתרון הקודם (מעושה) מצד ימין. לשמור על החלפת הפתרון להחליף את הפתרון מעושה לגמרי, אשר לוקחת כ 10 דקות (איור 1B).
    8. מקם את השקופית זכוכית בחזרה על הבמה מיקרוסקופ. לחכות עוד 10 דקות לפני רכישת התמונה לאחר-GA.
  3. הקמה של מסלול הזמן הרקמה עניין
    הערה: הרקמה עניין יכול להיות, למשל, hypocotyls או שורשים. אנו מבצעים באופן שגרתי הזמן קורסים הדמיה ביוסנסור nlsGPS1 באמצעות מערכת זלוף מסחרי (איור 1C, ראה טבלה של חומרים) או10,7,RootChip11.
    1. להוסיף 200 µL של פתרון מדומה למרכז של הערוץ זלוף של השקופית-הדביק (ראה טבלה של חומרים). בעדינות לבחור nlsGPS1 השתילים ולמקם אותם על הפתרון המדומה הדביק-בשקופית.
    2. באמצעות מלקחיים, בעדינות למקם את coverslip זכוכית ולחץ, בעזרת הישבן של המלקחיים, בעדינות על הקצוות החיצוניים של coverslip כך הוא יוצר קשר חזק עם החומר דביק בפריפריה של השקופית-הדביק.
    3. בעזרת המרפק שני סכינים סטריליים (עם הקוטר הפנימי [קוד] של 0.8 מ מ) ומחברי לאורך צינור סיליקון (עם מזהה של 0.8 מ מ), להתחבר השקופית-הדביק מזרק 20 מ"ל של מיכל עודפים איסוף הפתרון יצוא. השתמש במחבר נעל זכוכית (עם מזהה של 0.8 מ מ) כדי לחבר את המזרק לאורך צינור סיליקון.
    4. לחץ בעדינות את המזרק המכיל את הפתרון מעושה באופן ידני כדי לתת פתרון מספיק לעבור התא כך שיהיו אין בועות אוויר נשאר בבית הבליעה. מקום והחזק את המזרק משאבת מזרק לתכנות.
    5. להגדיר את הפרמטרים משאבת ספציפי המזרק משמש (כלומר., קוטר ונפח) יחד עם קצב הזרימה לפי ספר ההוראות שסופקו עם המשאבה.
      הערה: ב פרוטוקול זה, קצב זרימה של 1 – 3 מ ל/h היה בשימוש, ואת זה ניתן לשינוי בהתאם לדרישות ניסיוני. ליזום מסלול הזמן על-ידי הפעלת המשאבה.
    6. לטיפול GA4 במהלך הזמן (איור 1C), להפסיק את זלוף על ידי השהיית המשאבה ולשנות את המזרק בנוזל החדש אחד המכיל ¼ MS בתוספת GA4. להמשיך עם הדמיה קונאפוקלית כמתואר בסעיף הבא.

4. מיקרוסקופ

הערה: אנו מבצעים מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.

  1. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם לייזרים לבצע הדמיה סריג.
    הערה: עבור nlsGPS1, עם תמונה וריאציות של חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וחלבון פלורסנט צהובות (YFP). פרוטוקול זה, מיקרוסקופים המסחרי (ראה טבלה של חומרים, מופיע בתור מיקרוסקופ 1 ו- 2) משמשים עם 10 x או 20 x יבש 0.70 הרמונית מתחם APO לתכנן יעדים.
  2. מיקרוסקופ 1, השתמש 448 nm ו 514 לייזרים גל nm לגרות CFP ו YFP, בהתאמה. רוכשים סריקות רציפים. מוגדר לזהות 460 – 500 ננומטר עבור CFP (התורם פליטה) 525 – 560 nm עבור YFP (סריג פליטה) לאחר עירור של CFP גלאי (למשל, HyD SMD). באמצעות רצף השני, להגדיר גלאי כדי לאתר 525 – 560 nm YFP (YFP פליטה) לאחר עירור של YFP.
    הערה: זריחה YFP הזה משמש כפקד של הביטוי, כמו גם הממיין גרעינים, כדי לייצר משטחים באמצעות ניתוח תוכנה להדמיה micrograph תלת-ממדי מסחרי.
  3. מיקרוסקופ 2, שימוש 440 ננומטר, קווי לייזר באורך גל של nm 514 לגרות CFP ו YFP, בהתאמה. רוכשים שני מסלולים. מסלול 1, להגדיר גלאי (למשל., ChS) כדי לזהות 464 – 500 ננומטר עבור CFP (פליטת התורם), 526 – 562 nm עבור YFP (סריג פליטה) לאחר עירור של CFP. על רצועה 2, לקבוע גלאי כדי לאתר 526 – 562 nm YFP (YFP פליטה) לאחר עירור של YFP.
    הערה: זריחה YFP הזה משמש כפקד של הביטוי, כמו גם הממיין גרעינים, כדי לייצר משטחים בתוכנת הדמיה וניתוח תלת-ממדי.
  4. לרכוש תמונות באמצעות תבנית של 512 x 512 פיקסלים, רזולוציה של 12 סיביות.
  5. הרווח צריך להיות מותאם לערך נחוש מדעית המאפשרת קליטה טובה בזמן לא קולח פיקסלים. אין לשנות את הרווח בין פליטת CFP, סריג במהלך הניסוי. הגדר את חריר 1 יחידה אוורירי (AU). מניחים את IBIDI הדביק-השקופית בשלב של מיקרוסקופ קונפוקלי ולהמשיך הדמיה כאמור המוצג.
  6. בתוכנה מיקרוסקופ 1, בעוד בסריקה חיים פעיל, לנצל זוהר מעל ומתחת ממוקם בתפריט בצד שמאל של המסך התמונה למעלה כדי לקבוע את מצילום ואת הרוויה של האזור בעל עניין. בתוכנה מיקרוסקופ 2, לנצל טווח מחוון ממוקם בצד התחתון של המסך תמונה כדי לקבוע את מצילום ואת הרוויה של האזור בעל עניין. עבור כל ניתוח תמונה כמותית, צריך להיות לא רוויה פיקסל.
  7. הגדר את z-במחסן עם גודל צעד של 1 μm. גודל צעד ניתן מופחת עבור z-רזולוציה מוגברת או גדל עבור מהירות מוגברת של רכישה או להגדיל את מספר העמדות/והמדגמים יכול לדימות. מסלול אוטומטי הזמן להגדיר את הזמן יחד עם z-במחסן (מצב xyzt מהכרטיסיה מצב רכישה) לרכוש התמונות במרווחי זמן קבועים.

5. התמונה ניתוח באמצעות פיג ' י

הערה: שימוש ImageJ (פיג'י) זה אפשרי לעבד נתונים הדמיה לייצר תמונות דו-ממדית (2-D) של היחס פליטה nlsGPS1 ב תודרנית שתילים. לקבלת דוגמאות של תמונות, ראה איור 2A, 2 C, 2E, דור 2ו- 3 א. ImageJ, זה ניתן למצוא כל פקודה של פרוטוקול זה שימוש בפונקציית החיפוש. הקש על מקש הרווח ו- L על מקלדת המחשב. חלון חדש ייפתח; הקלד את הפקודה נדרש בשדה החיפוש.

  1. גרור את הקובץ (קבצי. או .lif או .lsm) פיג'י (תמונה J) ופתח את התמונות כמו היפר-מחסנית.
  2. מתוך התפריט הראשי, בחר תמונה > מחסנית > Z פרוייקט , בחר סכום פרוסות ללכוד כל הפיקסלים ולא רק את הפיקסלים מבריקים כמו הקרנה מרבי.
  3. מתוך התפריט הראשי, בחר תהליך > רקע הפחת ואת ערכת רדיוס הכדור מתגלגל ל 50 פיקסלים. בטל בחירת אפשרויות אחרות ולעבד כל שלוש תמונות. שלב זה הסרת רקע בעזרת האלגוריתם "לגלגל את הכדור".
    הערה: 50 פיקסלים נקבע מדעית כדי לכלול גרעינים כמו הקידמה.
  4. מתוך התפריט הראשי, בחר תמונה > צבעים > פצל ערוצים. שלושה חלונות חדשים יפתח: סכום-C1 (ערוץ CFP); סכום-C2 (ערוץ קשת/קשתית), ו- C3-SUM (ערוץ YFP).
  5. בחר חלון סכום-C3 ו, בתפריט הראשי, בחר תהליך > מסננים > Gaussian Blur ולהחיל את Gaussian Blur 1 כדי להפחית את הרעש בתמונה.
  6. מתוך התפריט הראשי, בחר תמונה > התאם > בהירות/ניגוד ו- select auto.
  7. מתוך התפריט הראשי, בחר תהליך > לשפר ניגודיות, וכן קביעת רוויה = 0.35.
  8. מתוך התפריט הראשי, בחר תמונה > סוג > 8-bit להמיר את הערימות לתוך תמונה של 8 סיביות.
  9. מתוך התפריט הראשי, בחר תמונה > התאם > סף אוטומטי מקומיות. הסף מקומיות אוטומטית, בחר את הפרמטרים הבאים: שיטת Phansalkar, radius = 15, פרמטר 1 = 0, פרמטר 2 = 0ו- stack לבן. בשלב זה, ערימות YFP משמשים לעשות מסכה בינארי.
  10. בחר חלון C2-SUM ו, בתפריט הראשי, בחר תהליך > מסננים > Gaussian Blur ולהחיל Gaussian Blur של 1.
  11. בחר חלון סכום-C1 ו, בתפריט הראשי, בחר תהליך > מסננים > Gaussian Blur ולהחיל Gaussian Blur של 1.
  12. כדי ליצור את המחסנית יחס פליטה של בין שני הערוצים, בתפריט הראשי, בחר תהליך > תמונת מחשבון. בחלון שיופיע, בחר סכום-C2 כתמונת 1, בחר לחלק אופרטור ובחר C1 sum כתמונת 2.
  13. הקפד לבחור יצירת חלון חדש ואת התבנית 32 סיביות. יופיע חלון חדש בשם תוצאה של C2-SUM.
  14. מתוך התפריט הראשי, בחר תמונה > טבלת בדיקת מידע > LUT 16_colors.
  15. מתוך התפריט הראשי, בחר תהליך > תמונת מחשבון. בחלון שיופיע, בחר תוצאה של C2-סכום כתמונת 1, בחר להכפיל אופרטור ובחר סכום-C3 כתמונת 2. בשלב זה, המסכה בינארי YFP מוכפל עם הערימה YFP/CFP להראות נוכחות ערוץ הבקרה YFP פיקסלים בלבד.
  16. מתוך התפריט הראשי, בחר תהליך > מתמטיקה > לחלק ואת ערכת הערך עד 255. בחלון חדש שנפתח, בחר כן כדי לנתח כל התמונות במחסנית. תמונה חדשה תופיע בשם תוצאה של תוצאה של C2-SUM.
  17. מתוך התפריט הראשי, בחר תמונה > התאם > בהירות/חדות , בחירה אוטומטית.
  18. מתוך התפריט הראשי, בחר תהליך > לשפר את הניגודיות, ובחר סוג רווי = 0.35.
  19. מתוך התפריט הראשי, בחר תמונה > התאם > בהירות/חדות, ואת ערכי המינימום והמקסימום קבוצת כדי ללכוד את התפלגות GA. שלב אופציונלי: התפריט הראשי, בחר נתח > כלים > כיול בר , בר הצג LUT-כיול, ולשמור את התוצאה של תוצאה של C2-סכום בתור קובץ .tiff.
  20. כדי להשיג את הערכים של הפליטה יחסי, בתפריט הראשי, בחר נתח > הגדר מדידה , בחר מתכוון וערך אפור , סטיית תקן.
  21. בחר את צורת המלבן מסרגל הכלים וצייר אזור בעל עניין (ROI). מתוך התפריט הראשי, בחר נתח > מדד. חלון חדש יהיה לדווח את הערך הממוצע של רועי שנבחרו.
  22. להעתיק, להדביק את הערכים שהושג בתכנת (למשל, Excel או OriginPro) ולעשות היסטוגרמה לטיפול לפני ואחרי GA4 ניסויים או גרף קווים עבור קורס בזמן הניסוי.

6. תמונות ניתוח באמצעות הדמיה תלת-ממדית ותוכנות אנליזה

הערה: היתרון של שימוש בתוכנה שנבחר (ראה טבלה של חומרים) הוא קטע אובייקטים (כגון: גרעינים) וליצור תמונות תלת-ממדיות מאוסף-z קונפוקלי. לקבלת דוגמאות של תמונות, ראה איור 2B, 2D, 2F, 2 Hו- 3B.

  1. לפתוח את התוכנה וייבא את הקובץ (קבצי. או .lif או .lsm).
  2. קטע גרעינים המבוסס על ערוץ פליטה YFP הבקרה באמצעות אשף משטחים. האובייקטים מקוטע מכונים "משטחים". שלב זה פילוח מאפשרת הניתוח של כל voxels ב גרעין כאובייקט אחד תוך צמצום הרקע voxels מחוץ לגרעין.
  3. אשף משטחים, להגדיר חיסור רקע (חדות מקומי) 3 מיקרומטר, על סף לברירת המחדל. מסיכה CFP פליטה (התורם עירור התורם פליטה [DxDm]) וערוצים פליטה (התורם עירור מקבל פליטה [DxAm]) סריג המבוסס על משטחים שנוצרו באמצעות הערוץ YFP פליטה (מקבל עירור מקבל פליטה [AxAm]).
  4. משתמשים בסיומת XT כלומר עוצמת יחס לחשב יחס של התורם עירור מקבל פליטת מחולק התורם עירור התורם פליטה (DxAm/DxDm) בין ערכי העוצמה אכזרי של משטחים בודדים בשני ערוצים.
    הערה: הרחבה זו זמינה באינטרנט להורדה.
  5. כדי לצבוע משטחים בודדים עם היחס פליטה nlsGPS1, בחר קידוד עם סטטיסטיקה של צבע, המיוצגת כסמל גלגל צבע. בחר כלומר עוצמת יחס כסוג נתונים סטטיסטיים.
  6. לייצא את היחס של הערכים הבודדים מהשולחן, אשר נמצא תחת הסמל ' סטטיסטיקה '.
  7. העתק ו הדבק הערכים לתוך גיליון אלקטרוני ולעשות היסטוגרמה לניסויים לפני ואחרי GA4 טיפול או גרף ליניארי עבור זמן הקורס ניסויים.

7. ניתוח סטטיסטי

הערה: ראה איור תלת-ממד עבור חלקת beeswarm ותיבת יחסי פליטה nlsGPS1.

  1. לפתוח את התוכנה ולהדביק את היחס פליטה של משטחים גרעינים כעמודות Y.
  2. בחר את העמודות עניין ובחר סטטיסטיקה > תיאור סטטיסטיקה > נורמליות לבדוק כדי לדעת אם הדגימות מופצים בדרך כלל. הפעל את בדיקת נורמליות, חלון חדש פתוחים ודווח על התוצאות.
  3. אם הדגימות מופצים בדרך כלל, השתמש ה- t-מבחן מבחן סטטיסטי. בחר סטטיסטיקה > בדיקת השערות > Two-Sample t-test בשורות , בניהול ה- t-מבחן.
  4. אם הדגימות לא מופצים בדרך כלל, בחר סטטיסטיקה > בדיקת השערות סטטיסטיקה > Two-Sample לבדוק סטיה לדעת השונות בין הדגימות האם, לא שונה באופן משמעותי.
  5. אם הסטיה אינה שונה באופן משמעותי, השתמש את מבחן מאן-ויטני U מבחן סטטיסטי. בחר סטטיסטיקה > מבחן Nonparametric > מבחן מאן-ויטני , הפעל הבדיקה.
  6. אם הסטיה היא שונה באופן משמעותי, השתמש Kruskal ווליס ANOVA מבחן מבחן סטטיסטי. בחר סטטיסטיקה > מבחן Nonparametric > מבחן ANOVA ווליס Kruskal and הפעל הבדיקה.

תוצאות

שימוש nlsGPS1, זה אפשרי למדוד רמות4 GA תאית ברקמות לבצע הדמיה פלורסצנטיות, כולל טיפים שורש כהה תוצרת hypocotyls (איור 2). השורש תודרנית , מעבר הצבע יחס פליטה של nlsGPS1 הוא מעיד על רמות נמוכות GA באזורי meristematic וחילוק לבין רמות גבוהות של GA באזור התארכות מאוחר (איור 2A ו- 2B). לעומת זאת, צבע יחס פליטה לא נצפתה שורשים nlsGPS1-NR, רומז מעבר הצבע GA אנדוגני הוא לא חפץ (איור 2C ו- 2D). הדרגתי יחס פליטה nlsGPS1 הוקמה גם ב hypocotyls תוצרת אפל, עם רמות נמוכות את פסיגי הזרע ו וו הפסגה ורמות גבוהות באזור הבסיס elongating במהירות hypocotyl (איור 2E ו- 2F). לעומת זאת, צבע יחס פליטה לא נצפתה על hypocotyls nlsGPS1-ע נ (איור 2G ו- 2 H). תודרנית שורשים והן תאים שגודלו כהה hypocotyl, הצטברות GA אנדוגני בקורלציה עם הסלולר ההתארכות.

יתר על כן, GA שסופקו exogenously4 מצטבר מעדיפים באיזור התארכות לעומת אזור חלוקה של השורש תודרנית (איור 3), המציין שאת nlsGPS1 הזה יכול לשמש כדי ללמוד GA אנדוגני, אקסוגני תכנים.

במהלך הזמן קורס ניסויים, nlsGPS1 השתילים היו ממוקמים בתאי דביק שקופית, perfused עם ¼ MS נוזלים, ואחריו טיפול בעזרת מיקרומטר 0.1 GA4 למשך 30 דקות. הצטברות מהירה יותר של GA אקסוגני4 באזור התארכות השורשים לעומת אזור חלוקה (1 וידאו) בסרטון.

figure-results-1722
איור 1: לטעום הכנה הדמיה קונפוקלי. מראות אלה ייצוג סכמטי של הכנת המדגם (A) ניסוי מצב יציב, (B) לפני ואחרי אקסוגני GA4 טיפולים, ולכל (C) ניסוי כמובן זמן טיפול באמצעות דביק-שקופיות (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2277
איור 2: מעבר הצבע GA תודרנית שורשים, שגודלו כהה hypocotyls. תמונות דו-ממדיות של nlsGPS1 (א) ו- (C) nlsGPS1-NR שורשים נותחו באמצעות תוכנת ImageJ, תמונות תלת ממדיות של nlsGPS1 (B) ו- (ד) nlsGPS1-NR נותחו באמצעות פרסומת תלת מימדי תוכנת ניתוח התמונה. שתי הבדיקות הראו GA אנדוגני4 הדרגתיות בשורשים תודרנית . תמונות דו-ממדיות של nlsGPS1 (E) (G) nlsGPS1-NR תוצרת אפל hypocotyl נותחו באמצעות תוכנת ImageJ, תמונות תלת ממדיות של nlsGPS1 (F), (H) nlsGPS1-NR נותחו באמצעות תוכנת ניתוח תלת ממדי התמונה מסחרי. שני ניתוחים הראה GA אנדוגני4 צבע ב- hypocotyls תוצרת אפל. הבר LUT מציג מוספים שווא nlsGPS1 פליטה יחסי. תמונות YFP מדווחים כפקדי הביטוי. תמונות hypocotyl נרכשו באמצעות שתי עמדות הבמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3441
איור 3: מעבר הצבע GA אקסוגני בשורשים. שני לוחות התערוכה הראשונה (א) דו מימדי, תמונות תלת-ממדיות (B) של nlsGPS1 שורש לפני ו- 20 דקות לאחר הטיפול של GA אקסוגני4 (1 מיקרומטר). תמונות YFP מדווחים כפקדי הביטוי. שני לוחות הצג (C) הממוצע, סטיית תקן, עלילה beeswarm ותיבת (D) של יחסי פליטה nlsGPS1 עבור גרעינים של אזור התארכות (האזור המוגדר עם מסגרת לבנה). באזור התארכות, היחס פליטה nlsGPS1 היה גבוה באופן משמעותי לאחר הטיפול4 GA (מבחן מאן-ויטני U, * * * P-הערך < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4314
וידאו 1: זלוף ניסוי של שורש nlsGPS1 באמצעות שקופיות דביק. וידאו זה מציג תמונות תלת ממדיות של nlsGPS1 perfused עם נוזל ¼ MS ו שטופלו 0.1 GA מיקרומטר4 למשך 30 דקות. במהלך הזמן, הדמיה נרכשה כל 10 דקות במשך 3 שעות עם המרווחים הבאים: 30 דקות של פתרון מדומה (מסגרת t = 1, t = 2, t = 3), 30 דקות של טיפול4 GA (מסגרת t = 4, t = 5, t = 6), 2 h של ואימץ אז lution (מסגרת t = 7 t = 18) פתרון. לפני הרכישה, המדגם היה perfused עם פתרון מדומה 2 ה אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Discussion

NlsGPS1 ביוסנסור GA מבוסס סריג מספק שיטה כמותית כדי לדווח ולמדוד את מעברי צבע הורמון GA multicellular צמחים. מבוסס סריג ביולוגיים יכולים לכמת דינאמיקה של פתרון ייתכן משופרת על זיהוי ישיר באמצעות ספקטרומטר מסה ומדידה עקיף על-ידי כתבים תעתיק או איתות חלבון-השפלה-המבוסס על שיטות12, 13. דימות ברזולוציה סלולר רקמות מגוונות-סוגי יכולות להניב תובנות משמעותיות GA ביולוגיה, ניצוץ חדש וההשערות לגבי תקנה והתפקוד של GA הצטברויות בהקשר multicellular. לדוגמה, מעקב אחר שינויים החיישן nlsGPS1 GA ספציפי biosynthetic הוחלף נגזר, קטבולי, תחבורה מוטציות, וכן במהלך spatiotemporally המושרה לפליטת, יכול להיות מאוד אינפורמטיבי כדי לבדוק באופן ספציפי איך GA מעברי צבע הוקם בשנת שורש ושורש כתובת התא התגובות GA מעברי צבע. החיישן יכול לשמש מינים אחרים מודל, חיתוך כדי לבדוק את השימור של מנגנוני בקרה הפקד בתיווך GA של נביטת הזרעים, התארכות הסלולר פורח.

בשלבים קריטיים דימות מבוסס סריג של החיישן nlsGPS1 הם, לא צריך להיות רווי 1) את הפיקסלים במהלך ניתוח כמותי של סריג, הדמיה 2) פרמטרים כגון "גלאי רווח" צריך להישמר קבועה עבור התורם הפליטה (DxDm), מקבל פליטה (DxAm) רכישות, 3) בקרת nlsGPS1-NR קווי אמור לשמש כדי לשלול את חפצי אמנות ו- 4) דוגמאות צריך להיות מוכן כדי למזער את הסחף ובעיות מוקד-שינוי. בנוסף, לתנאי הסביבה בה גדלים דוגמאות חשובות לשלוט מאז רמות GA רגישים תנאים סביבתיים כגון משך אור ועוצמת האור14,15,16 ,17. מגבלה מפתח של סוג זה של ניתוח הוא יחס אות לרעש גבוה הוא נדרש עבור הדמיה לנוכח העלייה רעש הטמונה רציומטרי הדמיה. לפיכך, nlsGPS1 הדמיה לא יהיה שימושי בשביל לרקמות ואיברים לא נתונות רציומטרי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באמצעות חלבונים פלורסנט ציאן וצהוב — לדוגמה, לרקמות העמוקות איפה פלורסנט חלבונים מזוהים בצורה גרועה. מצד שני, רציומטרי המפרט עדיפות לעיתים קרובות על קריאות intensiometric, כי פקד פנימי הוא מועיל כדי לשלול חפצי הנובעים משינויים ביוסנסור ביטוי, יציבות, בהירות או detectability בתא נתון, רקמה , או תנאי. לדוגמה, תדאג ביוסנסור הדמיה, ניתוח התמונה גם שימשו ללמוד מגוון רחב של ליגנדים במגוון רקמות5,6,18,19,20,. ניסויים הדמיה וניתוחים התמונה דיווחו כאן יכול להיות שונה כדי להתאים את שיטות הדמיה חדשות, כגון מיקרוסקופ אור גיליון, אשר יכולה להניב תובנות הרומן בסוגי, לדוגמה, עמוק שורש רקמות.

החיישן nlsGPS1 דור ראשון הוא חיישן גבוהה-זיקה מספקת מפה ברזולוציה גבוהה של מעברי צבע GA גם ידווח על עליות תאיים GA בעקבות טיפולים GA אקסוגני. אחת המגבלות הנוכחי של nlsGPS1 היא כי החיישן הוא בלתי הפיך במהירות, לכן, דוחות לא על מצב יציב GA רמות אלא, סביר, על מרבי האחרונות GA הריכוז בפתרון של ריבית. שיעור תחלופה מדויק עבור החיישן הוא גם לא ידוע, זה, בשילוב עם הפיכות נמוך, מונע זיהוי של אנדוגני depletions GA זה קורה בטווח דקות עד כמה שעות בסוגים מסוימים רקמות. חשוב גם לציין כי nlsGPS1 יש זיקה גבוהה עבור GA4 (Kd = 24 ננומטר) בהשוואה לצורות אחרות GA (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd = 110 ננומטר) כאשר הדמיה אחרים ביו גז 7. ניתן לתכנן עתיד דורות של GA ביולוגיים להגדיל הפיכות תוך שמירה על זיקה גבוהה או להפגין specificities שונים של קודמן, ביו, שונים או catabolite גז. 

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו קיבלה מימון מן האירופית מחקר המועצה (ERC) תחת של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר וחדשנות התוכנית (גרנט הסכם n ° 759282).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seedsNASCN2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seedsNASCN2107735
Gibberellin A4 (GA4)SigmaG7276dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach)Fisher S/5040HSRA 064
Hydrogen cloride HClSigma31434
Micropore tape3M1530-1
ibidi sticky-slideIbidi81128Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slideIbidi80168Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slidesIbidi10812
Elbow Luer ConnectorsIbidi10802
silicone tubingIbidi108401
Luer Lock ConnectorIbidi10826
programmable syringe pumpWorld Precision InstrumentsAL-1000
Vacuum greaseSigma18405
Murashige and Skoog Basal SaltsDuchefaM0221
Agar plant, 1 kgMelfordP1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thickFisher Scientific12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mmFisher Scientific12363138
Luer-slip Syringe 20 mLFisher Scientific10785126
3M Micropor Surgical Paper TapeFisher Scientific12787597
Potassium Hydroxide, 500 gSigma Aldrich221473-500G-D
Absolute EthanolFisher Scientific10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteelScientific Laboratory SuppliesINS4340
Scissors, 125 mm, stainless steelFisher Scientific12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6Ibidi10829
Leica SP8Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780Confocal laser microscope 2
ImarisBitplane3D visualization and Analysis software
Fijiimage analysis software
OriginProOrigin LabStatistical Analysis Software

References

  1. Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
  2. Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
  3. Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
  4. Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
  5. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
  6. Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
  7. Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
  8. Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
  9. Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
  10. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
  11. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  12. Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
  13. Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
  14. Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
  15. De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
  16. Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
  17. Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
  18. Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  19. Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
  20. Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143PhytohormoneSpatiotemporal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved