חילוץ וניתוח של פרופוליס ירוק מטייוואן

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות אתנול כמו הממס כדי לחלץ לאפיין פרופוליס ירוק מטייוואן זה מוצגים אנטיבקטריאלי.

Abstract

פרופוליס ירוק מטייוואן עשיר prenylated פלבנואידים ותערוכות במגוון רחב של פעילויות ביולוגיות, כגון נוגדי חמצון, אנטי בקטריאלי, ואת אלה נגד סרטן. Bioactive תרכובות של פרופוליס ירוק מטייוואן הם propolins, כלומר C, D, F ו- G. הריכוז של propolins ב פרופוליס ירוק מטייוואן משתנה בהתאם העונה והמיקום הגיאוגרפי. לפיכך, חיוני להקים הליך סטנדרטי, הדיר לקביעת האיכות של פרופוליס ירוק מטייוואן. כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה האתנול מבוססי החילוץ, כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, ניתוח פעילות נגד חיידקים לאפיון איכות פרופוליס ירוק מטייוואן. שיטה זו מציינת כי 95% ו- 99.5% אתנול עקירות להשיג את היבול המרבי חומר יבש של פרופוליס ירוק מטייוואן, ובכך מניב הריכוזים הגבוהים ביותר של propolins יש תכונות אנטיבקטריאליות. על פי ממצאים אלה, בפרוטוקול הנוכחי נחשבת הדיר לקביעת האיכות של פרופוליס ירוק מטייוואן ואמין.

Introduction

פרופוליס הוא תערובת שרפי הטבעי המיוצר על ידי דבורה המין בומבוס. פרופוליס כבר בשימוש נרחב מאז ימי קדם בפולק תרופות. מחקר דיווח לאחרונה שכי הפרופוליס הינו מועיל למניעת זיהומים חיידקים, דלקת¹. מחקרים רבים הראו כי תרכובות ביו הראשי של פרופוליס הם פלבנואידים, בעל תאים פנוליים אסטרים חומצה, prenylated p-חומצות coumaric ו- diterpenic חומצות^2,3. עד כה, זוהו prenylated 10 flavanone נגזרות של פרופוליס ירוק מטייוואן באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC)^4,5,6,7. הנפוץ ביותר בקרב אלה הם propolins C, D, F ו- G^5,7. השפעות ביולוגיות ניכר של פרופוליס ירוק מטייוואן נמצאים בקורלציה עם שלה תכולה גבוהה של propolins⁸.

הריכוזים של תרכובות ביו בפרופוליס משתנים במידה רבה בהתאם העונה והמיקום הגיאוגרפי שממנו מתקבל פרופוליס. פרופוליס האירופית מכיל בעיקר פלבנואיד אגליקון ו בעל תאים פנוליים חומצות⁹. תרכובות ביו העיקריים של פרופוליס מברזיל הם prenylated p-חומצות coumaric, כגון artepillin C¹⁰. מחקר הוכיח כי העונה הוא גורם קריטי בקביעת התכנים propolin הכולל פרופוליס ירוק מטייוואן¹¹. התוכן propolin הטייוואנית פרופוליס ירוק הוא הגבוה ביותר בחודשי הקיץ (מאי - יולי), הנמוך ביותר חורף¹¹. המאפיין אנטיבקטריאלי של פרופוליס נחשב באופן נרחב כדי להיות מחוון פעילות ביולוגית. בדרך כלל, הדגימות של פרופוליס שנאספו מאזורים שונים שכישוריי אנטיבקטריאלי נכס דומה; לדוגמה, זה בדרך כלל יעילה כנגד כמעט כל חיידקים גראם חיוביים ותערוכות השפעה אנטי-בקטריאלי מוגבלת נגד חיידקים גראם שליליים^10,12,13. האינטראקציות סינרגטי בין פלבנואידים ב פרופוליס היו הפגינו יש השפעה אנטי-בקטריאלית של¹⁴. באופן דומה, פרופוליס ירוק מטייוואן דווח להשפיע מיקרוביאלית כנגד חיידקים גראם חיוביים¹⁵. יתר על כן, מחקר זיהה גם אפקט מיקרוביאלית של פעולת הגומלין בין propolins פרופוליס ירוק מטייוואן⁸.

האפיון של תרכובות ביו של פרופוליס קשה בגלל ההרכב הכימי שלה יכולה להשתנות, בהתאם למקורו של המקור. לכן, זה הכרחי ליצור שיטה אפשרית הדיר לקביעת איכות פרופוליס ירוק מטייוואן. עם זאת, אין נוהל הוקם עבור חילוץ פרופוליס ירוק מטייוואן, אנליזה פונקציונלית עוקבות. מספר שיטות החלות ממיסים אורגניים ואנאורגניים בדרכים שונות הוצעו פרופוליס החילוץ^{16,17,18,19,20}. כי הפרופוליס הינו תערובת lipophilic, מחקרים הראו החילוץ אורגני עדיף אורגניים החילוץ^8,18,19. ריכוז propolin הכולל פרופוליס ירוק מטייוואן, שלה תכונות אנטיבקטריאליות הם מחווני מפתח של האיכות של פרופוליס ירוק מטייוואן. לפיכך, מטרת מחקר זה היא להציג פרוטוקול להצפנה באמצעות אתנול כמו הממס כדי לחלץ לאפיין את תכונות אנטיבקטריאליות של פרופוליס ירוק מטייוואן.

Protocol

1. הכנת תרכובות אתנול, חילוץ

1. שוקלת 10 גרם של קפואים פרופוליס ירוק מטייוואן, אשר נאסף מתוך כוורות בטייוואן ממאי עד יולי, לטחון אותו באמצעות את מטחנת תבלינים. לאשר כי כל פיסות פרופוליס ירוק מטייוואן הם הקרקע לאבקה בסדר בלי שום חלקיקים גדולים.
2. להוסיף 100 מ של ריכוזים שונים של אתנול (60%, 70%, 80%, 95% ו- 99.5%) ומים נפרדים מבחנות ולערבב כל ריכוז עם 10 גרם פרופוליס הקרקע.
3. דגירה 25 ° c, לנער את הבקבוק בהישג 250 סל"ד במשך 48 שעות.
4. לסנן את תמציות אתנול דרך מסנן נייר עם גודל הנקבוביות 25 μm.
5. לשקם את filtrates כדי שלהם לאמצעי האחסון המקורי (100 מ"ל) עם אתנול 95% באמצעות על סטריליות.
6. חנות שהאתנול תמציות ב-20 ° C.
   הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

2. הכנה של אתנול תמציות HPLC

1. רכז 10 מ"ל אתנול תמציות בשל התאיידות ואקום ב 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
2. אופים את העניין יבש ב 45 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
3. לשקם את העניין יבש עם 10 מ"ל אתנול 95%.
4. מסנן 1 מ"ל אתנול תמציות באמצעות מסנן סטרילי מזרק עם גודל הנקבוביות 0.45 מיקרומטר.
5. לסנן מחדש תמציות אתנול באמצעות מסנן סטרילי מזרק עם גודל הנקבוביות 0.22 מיקרומטר. פילטרט של שנאספו, ניתן ישירות לנתח באמצעות HPLC.

3. ניתוח התוכן Propolin באמצעות HPLC

1. הקמתה של עקומות סטנדרטית של propolins
   1. להכין 1 ליטר בשלב ניידים של פתרון מתנול: מים 88.8:11.2 (וי/v).
   2. להכין דילולים טורי של propolin ריכוז רגיל (C, D, F ו- G) (15.625 מ"ג/מ"ל, 31.25 מ"ג/מ"ל, 62.5 מ"ג/מ"ל ו- 125 מ"ג/מ"ל, בהתאמה) באמצעות הפתרון שלב ניידים כמו הממס.
   3. מזריקים µL 20 של ריכוזים סטנדרטי propolin לתוך העמודה הפוכה-פאזי, ברצף של ריכוז נמוך לריכוז גבוה.
   4. הגדר את העמודה HPLC של 30 מעלות צלזיוס, קצב הזרימה כדי 1 mL/min.
   5. הגדר אורך הגל של הגלאי UV 280 ננומטר וזמן מקליט את 20 דקות.
   6. לנתח את הסטנדרטים לפחות 3 x.
   7. להתוות את התגובה מדידה (ציר y) נגד הריכוז (ציר x) באמצעות חישוב גיליון תוכנה, וליצור עיקול רגיל עם חמוציות או ערך R בריבוע.
2. ניתוח של אתנול לחלץ s
   1. מזריקים µL 20 של תמציות אתנול המתקבל שלב 2.5 לתוך העמודה הפוכה-פאזי.
   2. הגדר את העמודה HPLC של 30 מעלות צלזיוס, קצב הזרימה כדי 1 mL/min.
   3. הגדר אורך הגל של הגלאי UV 280 ננומטר וזמן מקליט את 20 דקות.
   4. לנתח את הסטנדרטים לפחות 3 x.
   5. חשב את ריכוז propolin תמצית אתנול, באמצעות המשוואה עבור העקומה הסטנדרטי המתקבל שלב 3.1.7 המשתמשת האזור שיא עבור כל propolin.

4. הריכוז המעכב המינימלי וניתוח ריכוז אחרים מינימום

הערה: השיטה microdilution משמש כדי להעריך את היעילות אנטיבקטריאלי של אתנול, חילוץ propolins של פרופוליס ירוק מטייוואן.

1. הכנת מבחן אורגניזמים
   1. להפשיר את זני חיידקים, Staphylococcus aureus ו- Escherichia coli, , תרבות אותם tryptic סויה מרק, מרק מזין, בהתאמה, ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
   2. המעבר של S. aureus באמצעות ציר סויה tryptic ו- e. coli באמצעות נזיד מזין עבור שני דורות, ואז לחשב את המושבה יוצרי יחידות על ידי ספירת מושבות בודדות על צלחת אגר.
2. הכנה של אתנול תמציות עבור בדיקות אנטיבקטריאלי
   1. לרכז את תמציות אתנול המתקבל שלב 1.5 על ידי אידוי ואקום ב 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   2. לשקם את העניין יבש עם דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ולהתאים את הריכוז של התמצית כדי 12.8 מ"ג/מ"ל.
   3. לגרום לדילול טורי (ריכוזים: 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 ו µg 640/mL) של אתנול תמציות באמצעות המרק.
3. הריכוז המעכב המינימלי בדיקות
   1. להוסיף 10 µL של תמציות אתנול מדולל החל 0.156 וכלה µg 640.0/mL לתוך צלחת 96-ובכן.
   2. באמצעות ציר, לכוונן את עוצמת הקול כדי 100 µL, ולתחזק דימתיל סולפוקסיד 5% על כל דילולים.
   3. לחסן µL 100 התרבות חיידקי (1 x 10⁶/mL) המשקולת 96-ובכן.
   4. תרבות inoculum המכילים ריכוזים שונים של אתנול תמציות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
   5. לנתח את התפתחות חיידקים על פי צפיפות אופטית (microplate קורא) עכירות ושימוש ב- 590 nm לקביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC).
4. ריכוז אחרים מינימום בדיקות
   1. לחסן µL 10 של תרבות נוזלי מכל קידוח של הבדיקה מיקרופון זה הציג אין צמיחה על גבי צלחת אגר.
   2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
   3. לקבוע את פעילות אחרים על-ידי זיהוי הריכוז הנמוך ביותר שגילה אין התפתחות חיידקים גלוי. ריכוז שלגמרי מבטלת צמיחת תאים נחשב ריכוז חיידקי מינימלי (MBC).

תוצאות

נציג נתונים חיוביים להפקת אתנול מוצגים בטבלה1. התשואה חומר יבש של פרופוליס ירוק מטייוואן היה קשור באופן חיובי הריכוז של אתנול. תמציות אתנול 95% ו- 99.5% היה החומר היבש הגבוה ביותר תשואה של פרופוליס ירוק מטייוואן. התשואה חומר יבש הנמוכה מפרופוליס ירוק מטייוואן אירעה ?...

Discussion

מחקר דיווחו כי השרייה, שאורכה, באמצעות ריכוזים שונים של אתנול, יכול לשמש עבור חילוץ פרופוליס ברזילאי¹⁷; עם זאת, התהליך היה זמן רב¹⁷. זה לקח לפחות 10 ימים כדי לחלץ את תרכובות ביו, כגון תוכן בעל תאים פנוליים, פרופוליס ברזילאי¹⁷. לחלופין, הפקת אתנול בשילוב עם ח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Whatman no. 4 filter paper	Sigma-Aldrich	WHA1004125
methanol	Sigma-Aldrich	34860
reverse phase RP-18 column	Phenomenex Inc.	00G-0234-E0
Staphylococcus aureus	ATCC	BCRC 10780
Escherichia coli	ATCC	BCRC 10675
tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092
nutrient broth	Sigma-Aldrich	70122
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
spice grinder	Waring	WSG60K
microplate Reader	Molecular Devices	EMAX PLUS
HPLC system	Agilent	1200 Series
vacuum evaporation	BÜCHI	Rotavapor R-215