וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Summary

פרוטוקול זה תוכנן כדי להעריך immunotherapeutic cytotoxicity T-cell (המכונית T-cell) שנותבו מחדש נגד 3D מובנות תאים סרטניים (spheroids) בזמן אמת.

Abstract

חיסוני הפך שדה של עניין הולך וגובר במאבק נגד סרטן חשוכת אחרת. בין כל שיטות immunotherapeutic, chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) מנותב מחדש תאי T שהושגו התוצאות המרהיבים ביותר, במיוחד עם ילדים לוקמיה לימפובלסטית חריפה-B (B-כל). שיטות אימות הקלאסית של תאי T המכונית לסמוך על השימוש היחודיות מבחני פונקציונליות של תאי T מכונית נגד התאים היעד ההשעיה, במודלים xenograft. למרבה הצער, תצפיותיו במבחנה הם לעתים קרובות decoupled מן התוצאות המתקבלות vivo, הרבה מאמץ וחיות יכולה להינצל על ידי הוספת עוד צעד: השימוש של תרבות תלת-ממד. הייצור של spheroids מחוץ לתאים יעד פוטנציאליים המחקים את מבנה תלת-ממדי של תאי הגידול כאשר הם נמצאים engrafted לתוך המודל בעלי חיים מייצג חלופה אידיאלית. כאן, אנחנו מדווחים שיטה קלה ובמחיר כדי לייצר spheroids משושלת transduced תא המעי הגס ככלי אימות עבור טיפול בתא המאמצת (כאן לידי ביטוי CD19 המכונית T תאים). שיטה זו זה משולב עם מערכת הדמיה חיה מתקדמת, ניתן לקיים צמיחה ספרואיד, אפקטור תאים אפופטוזיס תא cytotoxicity, הגידול.

Introduction

העברה לתא המאמצת (ACT) מייצג את הטיפול בסרטן הדור הבא. זה מסתמך על ההזרקה של תאים אפקטור (T - או NK-תאים) לתוך החולה. תאים אלה יכול להיות שונה גנטית עם קולטן זה להנחות אותם למטרה שלהם, הגידול, ולהרוס אותו. לאחרונה הוצגה גישה זו להיות ריאלי כאשר Chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) נגד דה מרקר B-cell CD19 הוצג לתוך התאים החולה T להרוג סרטן /¹. במקרה של המכונית, אשר קולטן מלאכותי, העיצוב מורכב מקטעי נוגדנים ספציפיים, אנטיגן מחייב תחום מופחתת למקטע ישות שרשרת יחידה ייעודית משתנה (scFv), מקושרים לתחומים איתות T-cell. למרות שיש מספר עיצובים, הגירסאות הנפוצות ביותר המכונה כמו הדור השני רכב עיצובים, מורכב CD3z עבור מערכת אזעקה TCR ובתחום co-stimulatory אחד (CD28, 4-1BB, OX40, וכו.) ^{1 , 2}. השדה חיסוני מכוונת רוב תשומת הלב שלה צורה חדשה של מעשה כאשר CD19 רכב-T תאים efficaciously באין ספור מטופלים עם תא B-מחלות ממאירות-^3,-⁴. בעקבות הצלחה זו, החוקרים ניסו לנצל את העיצובים דומה על ידי מיקוד אחרים epitopes עבור גידולים מוצקים עם הצלחה מוגבלת. למרבה הצער, המחסור גידול אנטיגנים ספציפיים, את microenvironments גידול קשים שניתנו המכונית T תאים פחות יעיל לקראת גידולים מוצקים⁵.

כיום, האסטרטגיות אימות הנפוצים בשימוש במבחנה להסתמך על מימדי מערכות (2D) המטפלות רק קטע מן האתגרים כאמור לעיל גידולים מוצקים. באופן קלאסי, 2D במבחנה מערכות לערב תערובת של תאי T רכב המטרה שורות תאים סרטן כמו monolayers כדי להעריך את הפונקציונליות וספציפיות של תאים אלה אפקטור. אסטרטגיות אלו הן חלקים חשוב וחיוני של המחקרים, אך הם אינם מביאים בחשבון את המבנה התלת-ממדי (3D) של תאי סרטן⁶ומורפולוגיה מורכבים. תאים סרטניים תרבותי במערכות תלת-ממד, המכונה spheroids, רוכשים חדשים פנוטיפי היסודיות לשינויים ג'ין ביטוי פרופיל⁷, אשר עשויים להשפיע על ההכרה על ידי תאים אפקטור שנותבו מחדש. Birgersdotter ועמיתיו הראו כי הודג'קין לימפומה (HL) קו תא כאשר גדל רק בדגם תלת-ממד תרבות רוכשת את פרופיל ביטוי גנטי דומה לזו דגימות הגידול העיקרי⁸. לכן, spheroids או 3D דומה תרבות מתודולוגיות הצעה יותר הרלוונטיים במודלים חוץ גופית לעומת תקן מערכות דו-ממדיות. מערכות אלו דומים גם מחקרים ויוו אשר נתפסים השלב הסופי בתהליך האימות של מכונית נתונה. בהתחשב בכך כי מערכות דו-ממדיות להיכשל לחקות את המורפולוגיה של סרטן אשכולות, spheroids מציעים תצורות דומות כדי להעריך את הפונקציונליות של תאי T רכב לפני ויוו מודלים. במחקר אחד, Pickl et al. זיהה כי מודל ספרואיד של קולטן האנושי גורם הגדילה באפידרמיס (HER2) overexpressing תאים סרטניים המחישו דומה פרופילים איתות מודלים ויוו⁹. זה תומך בהמשך כי spheroids מציעים יותר רלוונטי ולא מקרוב פנימה vivo הערכה של תאי T המכונית. בנוסף, המכונית T-cell אימות נגד spheroids עשוי לעזור להעריך את יעילותם יותר ביקורתי ולמנוע חלק מהעיצובים העברת מחקרים ויוו בטרם עת¹⁰; לפיכך, תורמים מחקר מודאג מבחינה מוסרית ע י הקרבת בעלי חיים פחות. יתר על כן, פרוטוקולים באמצעות spheroids אינם יקרים יותר מאשר מערכות דו-ממדיות קלאסית, הרבה יותר מהר לעומת לימודים קלאסיים ויוו . יחדיו, ניתן לחזות כי הכללת לימודי ספרואיד תהפוך בקרוב יאושם לקשר מחקרים במבחנה ויוו.

כאן, אנו מציגים את הכנת spheroids מתוך שורת תאים סרטן המעי הגס של HCT 116. הקו תא שונתה כדי להביע את המולקולה CD19 אנושי כדי להפוך אותה רגישות תאי T המכונית CD19 וכדי לספק הערכה ברורה של ההרג באמצעות מבנה המכונית קלינית המאומת.

Protocol

1. דור של Spheroids משורת תאי סרטן המעי הגס

1. לשטוף 116 של HCT (stably transduced להביע את האשכול של בידול 19 (CD19) ו חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP)) monolayers תא עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS; 5 מ ל-25 ס מ² או 10 מ"ל על בקבוקון² 75 ס מ). הוסף טריפסין (0.5 מ"ל 25 ס מ² או 1 מ"ל על בקבוקון² 75 ס מ), דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
2. בדוק בתא הניתוק תחת מיקרוסקופ ולנטרל תא אנזים דיסוציאציה רוזוול פארק אנדרטת המכון 160 מלאה בינונית (RPMI 1640) (FCS RPMI 1640 + 10% + Gentamycin; 10 מ"ל 25 ס מ² או 20 מ"ל על בקבוקון² 75 ס מ).
3. צנטריפוגה תא ב x 500 g עבור 5 דק להסיר supernatant באמצעות פיפטה תחליב, resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים עם 5 מ של בינוני RPM1 1640 מלאה.
4. ספירת תאים באמצעות Trypan blue הדרה על השיש במטבח תואם התא.
5. צנטריפוגה תא ב x 500 g עבור 5 דק להסיר supernatant באמצעות פיפטה ובית resuspend בינוני RPMI כדי לקבל 5 x 10³ תאים/מ ל....
6. להעביר את המתלים תא מאגר סטרילי, לוותר על µL 200/באר לבאר 96-סיבוב צלחות התחתון באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
7. להעביר את הצלחת המנגנון הדמיה אוטומטית בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, 95% לחות).
8. להיכנס לתוך רכישת התוכנה, בחר את לוח הזמנים כדי לרכוש | ההשקה להוסיף כלי | סריקה בלוח הזמנים | ליצור כלי: חדש.
9. בחר סוג סריקה: ספרואיד. בחר את ערוצי עניין: שלב + Brightfield (לעקוב אחרי הגדילה spheroids), ירוק (לעקוב אחר הגידול אות, רכישת זמן 300 ms) ואדום (בהמשך אפופטוזיס, רכישת זמן 400 ms).
   1. בחר את רמת ההגדלה הרצויה: 10 x.
   2. לקחת את הדגם צלחת מעמדה במגירה. בחר את המיקום של בארות לשיקוף. הזן את התיאור של הניסוי: שם, סוג של תאים, מספר התאים.
10. עבור הגדרת ניתוח, בחר באפשרות דחה ניתוח עד מאוחר יותר. לחץ לחיצה ימנית על ציר הזמן, בחר באפשרות להגדיר שנבחר סריקה מרווח קבוצה ולהגדיר להוסיף סריקות כל 4 שעות, עבור סכום כולל של עד 24h. לקבוע שעת ההתחלה הרצויה (לפחות שעה לאחר דגירה במנגנון הדמיה אוטומטית).
11. לבדוק כל יומיים לצמיחה של spheroids על-ידי כניסה לתוך התוכנה הדמיה.
    1. בחר באפשרות התצוגה האחרונות סורק ולחץ פעמיים על הניסוי הרצוי. בחר Brightfield בחלונית ' ערוצים ' התמונה ולאחר מכן השתמש בכלי תכונות תמונה מדידה כדי למדוד את הקוטר של spheroids. זה לוקח 6 ימים עבור ספרואיד להגיע לגודל הרצוי: 0.5 מ מ קוטר. להוסיף 50 µL בינוני RPMI מלאה בכל טוב בכל יום 4 להגביל השפעה בינונית אידוי.

2. דור של תאי T המכונית CD19

1. הרחבה של תאי T המכונית CD19
   הערה: ביטוי יציב של תאי T המכונית CD19 נרכשה על ידי בצובר retroviral התמרה חושית של התורם בריא PBMCs כפי שתואר לעיל¹⁶. קידוד retroviral לבנות המכונית CD19 מכונית הדור השני והיא מורכבת fmc63 scFv שרשרת, ציר CD8, תחום transmembrane, תחום co-stimulatory 4-1BB, ולבסוף תחום CD3ζ.
   1. כדי להרחיב, תרבות ה-T transduced תאים בנוכחות אנטי-CD3/28 beads מגנטי עם תא חרוז יחס של 1:1 10-11 ימים. במהלך ההרחבה, תאים הם בינוני מלא (X-VIVO 15, 5% סרום, ו 100 U/mL רקומביננטי האנושי il-2).
      הערה: צפיפות אידיאלי הרחבה יעילה היא 1 ל 2 x 10⁶ תאים למ"ל. בהתאם למספר הראשונית, ניתן להרחיב תאים ב מבחנות (25 ס מ² מבחנות עד 20 מ"ל, 75 ס מ² מבחנות עד 40 מ"ל של הנפח הכולל) בחממה תרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, 95% לחות).
   2. כקבוצת בקרה שלילית עבור מבחני הבאים כוללים הלא-transduced PBMCs (יטופלו כמו מעושה) בפרוטוקול הרחבה מקבילה בתאי T המכונית CD19.
   3. ביום השלישי ואילך, להוסיף בינוני טריים כל יום ואני מתחלקים התאים מבחנות תרבות נוספים במידת הצורך.
   4. יום 10 – 11, צנטריפוגה תאים ב 500 x g עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע לשלב כל התאים לתוך שפופרת 50 מ ל אחת, resuspend תאי ~ 30 מ"ל של התקשורת מלאה טריים.
   5. מקם את הצינור 50 מ ל המכילות את התאים resuspended על דוכן המגנטי להפריד את החרוזים מגנטי המדיום תרבות.
   6. להמתין 2-3 דקות על החרוזים לאסוף בצד של הצינור.
   7. הסר את המדיום תרבות עם פיפטה, העברת צינור מבלי לגעת אזורי אוסף חרוז מגנטי.
   8. חזור על שלבים לגבי הסרת חרוז (2.1.5–2.1.7) עוד פעם כדי להגביל את מספר חרוזים במדיום תרבות הסופי.
   9. Resuspend, לספור את התאים, להתאים את הצפיפות ל 1 ל 2 x 10⁶ תאים למ"ל במדיום מלאה.
   10. שאר התאים לפחות 4 שעות עד לילה. לאחר מכן ישירות להקפיא אותם למטה ב-80 מעלות צלזיוס, להעביר את הבקבוקונים מיכל חנקן נוזלי למחרת לאחסון לטווח ארוך. לחלופין, אחד יכול להאריך את השאר עד לילה לשימוש מיידי.
2. המכונית CD19 בקרת ביטוי בתאי T ראשי
   1. ספירת מספר התאים T מורחב כמו המספרים עשוי להשתנות מעט לאחר לילה תרבות או בינוני לאחר ההקפאה/ההפשרה.
   2. להעביר 5 x 10⁵ תאים מן המכונית CD19 שני, ואימץ העיקרי בתאי T כדי להפריד בין צינורות cytometry זרימה.
   3. לשטוף את התאים עם 200 μL מאגר לזרום (2% FBS ב- PBS), צנטריפוגה הצינורות ב x 500 g עבור 5 דק. חזור על השלבים כביסה כדי להיפטר פריטים הנגרמת על-ידי המדיום תרבות.
   4. להכין נוגדן ראשוני (ביוטין עז העכבר אנטי אג, ₂ F(ab') קטע ספציפי) על-ידי ביצוע דילול 1:200 במאגר לזרום.
   5. Resuspend תאי μL 100 של נוגדן מיקס למחזור, דגירה על קרח במשך 15 דקות חזרו על הצעד הקודם כביסה פעמיים כדי להסיר עודפי נוגדנים.
   6. להכין נוגדן המשני (Streptavidin-PE) כמו 1:400 דילול במאגר לזרום.
   7. Resuspend תאי μL 100 של נוגדן מיקס למחזור, דגירה על קרח במשך 15 דקות חזרו על הצעד הקודם כביסה פעמיים כדי להיפטר עודף נוגדן.
   8. Resuspend תאי μL 200 זרימה מאגר למחזור ולנתח אותו על cytometer זרימה.
   9. שימוש בתאי T ללעוג להגדיר את השער ואתאיזם ולנתח CD19 המכונית transduced תאי T בהתאם.

3. תלת-ממדי הגידול ספרואיד הרג Assay

1. לאחר 6 ימים או פעם אחת spheroids להגיע לגודל הרצוי, הסר את הלוחית של החממה. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להסיר בעדינות µL 100/טוב של בינוני RMPI 1640 להשלים הצלחות ספרואיד.
   1. בשלב זה, זווית הטיפים לקראת הבתוך קיר של צלחת 96-ולס, הימנעות ממגע בתחתית הבאר כדי למזער הפרעה של spheroids. הנותרים נפח צריך להיות בסביבות 100 µL.
2. הכן פתרון 1:200 של Annexin V אדום על ידי ערבוב 50 µL של Annexin V אדום עם mL 9.95 בינוני RPMI 1640 מלאה.
3. להוסיף 100 µL/טוב של 1:200 פתרון Annexin V אדום.
4. להעביר את הצלחת אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, 95% לחות) למשך 15 דקות.
5. לקצור תאי T CD19 המכונית transduced צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה אותם ב x 500 g עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה ואת resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים עם 2 מ"ל של מדיום RPM1 1640 מלאה.
6. ספירת תאים באמצעות Trypan blue הדרה על השיש במטבח תואם התא.
7. צנטריפוגה תא ב x 500 g עבור 5 דק להסיר supernatant באמצעות פיפטה ובית resuspend בינוני RPMI להשיג 2 x 10⁵ תאים/מ ל....
8. להעביר את המתלים תא מאגר סטרילי, לוותר על µL 100/באר לבאר 96-סיבוב צלחת ספרואיד התחתון בעזרת פיפטה רב-ערוצי.
9. להעביר את הצלחת חזרה למכשירים הדמיה אוטומטית בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, 95% לחות).
10. להיכנס לתוך רכישת התוכנה, בחר את לוח הזמנים כדי לרכוש.
    1. לחץ לחיצה ימנית על ציר הזמן הסריקה ובחר ערוך ציר הזמן. לחץ לחיצה ימנית על קבוצת סריקה ומחק אותו. לחץ לחיצה ימנית על ציר הזמן, בחר באפשרות להגדיר שנבחר סריקה מרווח קבוצה ולהגדיר להוסיף סריקות כל 1.5 h, עבור סכום כולל של עד 24 שעות.
    2. לקבוע את שעת ההתחלה הרצויה (לפחות שעה לאחר דגירה במנגנון הדמיה אוטומטית). בחר להציל את לוח הזמנים סריקות.

4. ניתוח תמונות אוטומטית

1. להיכנס רכישה, בחר באפשרות התצוגה האחרונות סורק ובחר באפשרות ' ניתוח ההשקה . בחר ליצור הגדרה חדשה של ניתוח | ניתוח מסוג: ספרואיד. סמן את הערוצים התמונה כדי לנתח (שלב + Brightfield, ירוק ואדום).
2. בחר לפחות 10 להחליפן בתמונות: בדרך כלל, 1 לכל תנאי ולפחות 3 נקודות זמן (התחלה, אמצע, סוף הרכישה).
3. תצוגה מקדימה של ברירת המחדל לנתח את הליך במחסנית התמונה כולה.
4. לשנות את הפרמטרים עבור מסכת brightfield. פרמטרים אופייניים הם: רגישות 10, חור מילוי 1,000 מיקרומטר², מין אזור 1,000 מיקרומטר². תצוגה מקדימה במחסנית התמונה כולה ולבדוק הפרמטרים שנבחרו לזהות במדויק את spheroids.
5. לשנות את הפרמטרים עבור מסכת ירוק (GFP). פרמטרים אופייניים הם: פילוח מגבעת עם רדיוס 200 מיקרומטר, סף 3 GCU, קצה לעזוב, חור למלא 5,000 מיקרומטר², התאם גודל-2 פיקסלים, אזור מינימום 3,000 מיקרומטר². תצוגה מקדימה במחסנית התמונה כולה ולבדוק הפרמטרים שנבחרו לזהות במדויק את spheroids.
6. לשנות את הפרמטרים עבור מסכת אדום (Annexin V). פרמטרים אופייניים הם: פילוח מגבעת עם רדיוס 150 מיקרומטר, סף 2 GCU, קצה לעזוב, חור למלא 5,000 מיקרומטר², התאם גודל 0 פיקסלים, אזור מינימום 1,000 מיקרומטר². תצוגה מקדימה במחסנית התמונה כולה ולבדוק הפרמטרים שנבחרו לזהות במדויק את spheroids.
7. להפעיל את מנתח.
   1. לאחר הניתוח נעשה, לחלץ את המדידה של ריבית. בחר את הקובץ שנותחה ולאחר מכן באפשרות גרף מדדים . בחר את המדדים של עניין, לסרוק את הבאר. בדרך כלל, עוצמת אדום וירוק הכולל בגבולות brightfield לתת את המידות המדויקות ביותר על-ידי הגבלת את האות של קרינה פלואורסצנטית לגבולות spheroids נקבע על-ידי המסיכה brightfield (איור 3). תמצית מדדים שנבחר בתבנית קובץ מספר על ידי לחיצה על "ייצוא נתונים".
8. להמשיך החילוץ של תמונות, סרטים על-ידי בחירת הקובץ שנותחה ולאחר מכן בחר באפשרות ייצוא תמונות וסרטים . שתי אפשרויות זמינות, גם "כמו להציג" כדי לאחזר תמונות וסרטים ראיתי על תוכנת הדמיה (תמונות בדרך כלל ללא הפרדות צבע), או "כמו מאוחסן" כדי לאחזר נתונים גולמיים עבור ניתוח חיצוני דרך התוכנה השלישית-חלק.

תוצאות

כפי שניתן לראות באיור1, זה הכרחי לבדוק את רמת הביטוי של המכונית CD19 על תאי T (איור 1 א') ואת רמת CD19 על שורות תאים סרטניים HCT116 (איור 1B) cytometry זרימה. איור 2 מדגימה את התוצאה של ניסוי ספרואיד טיפוסי. הדמיה המנגנון האוט...

Discussion

השימוש spheroids ככלי חדשניים כדי לאמת את הטיפול בסרטן בעתיד הפך שדה של עניין הולך וגובר בשנים האחרונות. Spheroids מייצגים שלב ביניים בין קלאסי 2D ניתוח במבחנה בהערכת vivo. השיטה עוד מחזיקה הרבה הבטחה לגבי מחוזקה במובן של הגידול סביבת מיקרו מחקה כמו גם גנים פרופילים⁷. פרוטוקול מוצג בפרסום...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	-
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 mL tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Bioscience