חדש נייד במבחנה חשיפה קלטת לדיגום אירוסול

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע חשיפות תרסיס סלולרי נייד ולמדוד את תגובת תאי. השיטה משתמשת בתאים, גדל הממשק אוויר נוזלי, מחקה ויוו פיזיולוגיה. תגובה תאית nanoparticle נחושת אירוסולים נצפתה כמו לחץ חימצוני באמצעות הדור מינים חמצן תגובתי cytotoxicity כמו שחרור לקטט דהידרוגנאז.

Abstract

פרוטוקול זה מציג במבחנה חשיפה מערכת חדשה, מסוגל להיות שחוקים, כולל אפיון והביצועים שלו. ממשק אוויר נוזלי (עלי) במבחנה חשיפה מערכות לעיתים קרובות מגושם, יצירת תחבורה שדה ומבצע במקור של פליטת או בתוך האזור נשימה קשה וגדולים. דרך המזעור של מערכות אלה, ניתן להביא את המעבדה לשדה, לזירוז זמן עיבוד ואספקת שיטה מתאימה יותר חשיפה זה אינו משנה את תרסיס לפני פנייה אל התאים. הנייד במבחנה חשיפה קלטת (PIVEC), מסתגל קלטת מסנן 37 מ מ כדי לאפשר במבחנה רעילות בדיקות מחוץ סביבה מעבדה מסורתיים. PIVEC התאפיינה באמצעות שלושה גדלים של חלקיקים נחושת כדי לקבוע יעילות התצהיר בהתבסס על gravimetric ניתוח ריכוז מספר החלקיקים. Cytotoxicity הראשונית הניסויים בוצעו עם תאי הריאות חשופות כדי לקבוע את היכולת של המערכת הפקדת חלקיקים תוך שמירה על התא הכדאיות. PIVEC מספק יעילות דומה או מוגבר התצהיר בהשוואת להתקני זרימה בניצב זמין במבחנה חשיפה. למרות התפוקה דגימה נמוך יותר, גודל קטן נותן כמה יתרונות ה הנוכחי במבחנה עלי חשיפה מערכות. אלה כוללים את היכולת להיות משוחק לניטור אישי, ניידות מהמעבדה כדי מקור פליטה, ואת האפשרות שיבנו מערכות מרובות עבור רזולוציה מרחבית תוך שמירה על משתמש התחתון עולה. PIVEC הוא מסוגל איסוף אירוסולים בשדה, בתוך האזור נשימה אל אוויר-לממשק, במבחנה מודל מערכת.

Introduction

דגימה אישי תוך שימוש בטכניקות במבחנה יכול לספק מידע מקיף על האפקטים הביולוגיים של אירוסולים במקום העבודה. ¹ חשיפות מזהמים באוויר כוללים חשיפות הכימיקל עצמו, את הדגימות שנאספו אוויר, בתנאים המשוקע שבו הגז היא הציגה התליה תא, חשיפות לסירוגין באמצעות מכשיר כמו כיסא נדנדה, או ישירה חשיפות-הממשק אוויר נוזלי (עלי). ² רבים של טכניקות אלה מבוצעים עם תאים גדל ההשעיה או האוסף של דוגמאות לפני החשיפה, שכל אחד מהם יכול להשפיע על המחקר רעילות עקב שינויים פוטנציאליים בתרסיס. ³ כדי למנוע שינויים אלה, המעבדה ניתן להביא לשדה באמצעות מספר במבחנה עלי תרבות החשיפה מערכות המשמשות בספרות,^{4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13} . עם זאת, מעטים הם זמינים מסחרית. ^{8 , 9 , 12} מערכות אלה לעיתים קרובות מגושם, במיוחד כאשר כולל מכשירים לווסת טמפרטורה, לחות של הסביבה התאית, קצב הזרימה של מדגם בתרסיס. באמצעות את PIVEC, תרסיס חשיפות ניתן לבצע מחוץ סביבה מעבדה מסורתי או בתוך האזור הנשימה בזמן מחקה שאיפה תנאים.

הקביעה של תרסיס התצהיר במבחנה חשובה החקירה של השפעות בריאותיות כתוצאה מהשאיפה. אזור הנשימה, שטחה של 30 ס מ הפה והאף,¹⁴ חיוני להבנת את החשיפה חלקיקים ולשם קישור בין האפקטים הביולוגיים של הריאות. ² לעתים קרובות, התצהיר על תאים מוגדר על יעילות התצהיר, החלקיקים הנמסרים, נלקח על ידי התאים מחולק החלקיקים מנוהל מערכת ה-^6,15 או על בסיס המוני של כמויות זהה. ^{4 , 16} השיטות למדידת אירוסולים באזור נשימה הן מסנן המבוסס, לכידת חלקיקי על פני תקופה דגימה נתון ושימוש המסננים לערוך בדיקה נוספת. ¹⁷ ניטור אישי מחייב מערכת קטנה שמגיע עם עסקת החליפין של דגימות פחות.

קיימות גישות רבות כדי לקבוע את ההשפעות הבריאותיות מחשיפה תרסיס. המודל עלי מאפשר בתרסיס להינתן ישירות לתאים באוויר כמו תרחיש חשיפה אמיתית, אך היא חסכונית יותר, פחות זמן אינטנסיבי יותר ויוו לומד תוך כדי לחקות את המחסומים אוויר נוזלי כגון העיניים, העור והריאות. ריאות תאים גדל את עלי יש את היכולת ליצור שכבה מכשול מקוטב,^18,19 אשר מייצרת תכונות פיזיולוגיות הדומות ויוו ריאות האפיתל, כולל ייצור ריר, חומרים פעילי שטח ספציפי שורות תאים הסמפונות או מכתשי, cilia מכות, צמתי צר¹⁹ , קיטוב²⁰ ותא^19,. ¹⁸ משתנה כגון אלה יכולים להשפיע על התגובה התאית נמדד מחקרי רעילות. ²¹ . בנוסף, עלי במבחנה דגם תוצאות הם לעתים קרובות יותר רגישה תאים נחשפו באמצעות מודלים ההשעיה²² ואין מסוגלות כדי דגם חריפה ויוו שאיפת רעילות. ^{23 , 24} . לפיכך, מערכת חשיפה עלי כי הוא מסוגל לבצע מדידות בתוך האזור נשימה היא צעד הבא טבעי.

על ידי חשיפת התאים תרסיס ישירות על מקור פליטה, חקירת ההשפעות של גזים, תרכובות נדיפות למחצה, וכל חלקיקי מעורב בתערובת מתרחשת. כאשר התערובת נאסף על מסנן, תרכובות נדיפות של גזים לא נתפס, לא יכול לחקור את כל התערובת. בנוסף, שיחזור של חלקיקי אבקה או השעיה נוזלי יכול להוביל צבירת או אינטראקציות חלקיקים-נוזל, כגון פירוק, ההשעיה נוזלי. ^{25 , 26} כאשר חלקיקי אירוסול מתווספים הנוזל, קיים פוטנציאל גבוה יותר עבור הצטברות,^25,27 היווצרות של חלבונים קורונה,²⁸ או אינטראקציה עם תרכובות בתוך הנוזל, אשר יכול להשפיע על התצהיר, להשפיע על התגובה הביולוגית. ^{29 , 30}

חשיפה-עלי מבוססת על שלושה פרופילים תרסיס הראשי, ענן שיקוע, במקביל זרימה וזרימה בניצב. ענן להתיישב, בשימוש על ידי חשיפה תא ממשק אוויר נוזלי (אליס),⁴ היא מערכת אצווה שבו חלקיקים להפקיד באמצעות כוח הכבידה, diffusional מסתדר כמו בתרסיס היא כאל יחידה אחת. זרם מקבילים, המשמש את תרסיס אלקטרוסטטית במבחנה חשיפה מערכת (המרזבים)⁵ ו Multiculture חשיפה קאמרית (MEC) II,⁶ מאפשר התצהיר באמצעות התוספת של תנועה בראונית דרך הפרופיל זרימה. זרימת בניצב, בשימוש על ידי microsprayer,⁷ ננו תרסיס קאמרית In-Vitro רעילות (NACIVT),¹¹ , מסחרי עלי מערכות^8,9,10,12, מוסיף את פקק של חלקיקים בתוך אזור התצהיר. רבות ממערכות אלה חשיפה וגדולים מגושם, הדורשים מערכות עודף עבור תרסיס מראש מיזוג, משאבות הזרימה, או אפילו חימום לשכות דגירה של תאים. גודל גדול זה מקטין הניידות של המערכת. במקום דגימה ישירות על מקור פליטה, מערכות אלו לעתים קרובות יש דוגמאות הובא אירוסולים מעבדה או מודל שנוצר לצורך ניתוח. אסור לאבד את המורכבות בתרסיס הנפלט בתרגום מן השדה למעבדה. PIVEC הוא קטן יותר מאשר המערכות הקיימות, עם שטח פני השטח החיצוניים של 460 ס מ² , במשקל 60 גרם בלבד, עם חום ולחות שולבו מערכת המאפשרת להתקן נייד במיוחד. ירידה בגודל ובמשקל לאפשר למערכת להיות שחוקים או נלקח למקור של חשיפה, המתיר דגימה ישירה.

גודלו של מערכות החשיפה הנוכחית גם פוחתת היכולת לבצע דגימה לחקור את מרחבי מעברי צבע בריכוזים. החלטה זו היא המפתח בעת החלטה על תופעות רעילות של פוטנציאל סביבתיים רבים, סיכון מקצועי כגון פליטה לרכבים חלקיקי החומר או מקום העבודה פעילויות שבו מתרחשת חשוד. מיד לאחר פליטה, הופך שם שונות מרחבית בריכוז החלקיקים. זה גדל עם הזמן כפי החלקיקים לפזר ברחבי האטמוספירה ולשנות אפקטים אלה בהתבסס על תנאי הסביבה, כגון טמפרטורה, לחץ, רוח, שמש. חלקיקים יכולים להתחיל בגיל, נישחק גם פעם הנפלט^31,32 , פיזור המחירים המושפעים הטופוגרפיה; ריכוז גבוה ניתן למצוא קניונים ומנהרות, שבו פיזור האפקטים הם האטה, ריכוז נמוך יותר ניתן למצוא איפה יש אזור גדול עבור פיזור. ³³ שינויים אלה של פיזור המחירים יכול להיות השפעות משמעותיות על בריאות האדם, ניתן לראות כאשר משווים את המספר של אסתמה מבוגרים המתגוררים עירוני לעומת הכפרי. ³⁴ בעוד מערכות חשיפה רבות לספק דוגמאות מרובים בבת אחת, מערכות מרובות נחוצים עם שפע של ציוד גדול לביצוע רזולוציה מרחבית.

על ידי הבאת מהמעבדה לשדה, הניתנות להפחתה הזמן של ניתוח על-ידי שימוש את כל התא חיישן. בעקבות מנגנונים ביולוגיים ידוע ונקודות קצה יכול לסייע בקביעת הרכב תרסיס ואת גודל. בשל שיטות הסיווג איטי, לרבות בשחרור ליחה, phagocytosis רוברטסונית, חלקיקים אלה לעיתים קרובות אינטראקציה עם תאים כ ימים עד שבועות³ יוצר סטרס חמצוני, דלקת, אפילו מוות של תאים. אלה נקודות קצה ביולוגי יכול להיות נקודות המוצא עבור תוצאה שלילית מסלולים עבור מחלות לב וכלי דם או מחלת ריאות חסימתית כרונית. בנוסף, Wiemenn. et al. לבצע מגוון של מבחני במבחנה כדי להשוות ערכים ספרות לטווח קצר ויוו שאיפת רעילות. ³⁵ In vivo התגובה היה חזה עם שניים מתוך ארבעת תוצאות חיוביות של בדיקות cytotoxicity באמצעות שחרור לקטט דהידרוגנאז, סטרס חמצוני של הפחתת גלוטתיון היווצרות מימן על-חמצני ושחרור, דלקת אפשרית מן הגן הגידול נקרוזה מקדם אלפא. מתוך עשר nanosized תחמוצות מתכת נבדק, שש נבדק כמו פעיל (טיטניום אוקסיד, תחמוצת אבץ ו תחמוצת צריום שונות ארבעה) באמצעות חשיפות בתוך חוץ גופית עם אישור ויוו. 

על מנת לחקור את ההשפעות של אירוסולים בסביבה תעסוקתית, המעבדה שלנו פיתח את PIVEC עבור חשיפות בשטח. בנוסף, PIVEC יכול להיות משוחק על דגימה אישי לפקח ולחקור שאיפת חשיפה כמו קלטת מסנן³⁶ 37 mm או מערכות מרובות ניתן להשיג רזולוציה מרחבית בתוך אזור נתון. ב פרוטוקול זה, אפיון ושימוש PIVEC הנדונה. לאחר החשיפה, השפעות ביולוגיות הם נצפו דרך מבחני cytotoxicity.

Protocol

מפעילי חייב ללבוש ציוד מגן אישי (למשל חלוק, כפפות, משקפי מגן) בעת ביצוע שלבים 1, 2, 3, 5 ו- 6.

1. הכנה של חומרים

1. להכין חומרים עבור מכלול המערכת ולהבטיח חשיפה הדיר.
   1. ודא שימוש חדש 70% אתנול ניקה ¼" הקוטר הפנימי מוליך צנור ו- ¼" הקוטר החיצוני למחברי או עבור מכלול המערכת.
   2. מאגר חומרים מבחן כולל מסננים, PIVEC רכיבים, פינצטה, אבקות חלקיקים בסביבה מבוקרת היטב, לגבי טמפרטורה, לחות, במשך לפחות 24 שעות לפני הניסוי.
      הערה: הטמפרטורה צריכה להיות קרוב לטמפרטורת החדר, כ 20 ° C, עם לחות יחסית פחות מ- 35%. זה חשוב מאוד להשיג את הדיר בין ניסויים.
   3. להכין את מוני חלקיקים באמצעות אלכוהול איזופרופיל לנקות חלקים ולאפשר מערכת החימום על-פי המלצות היצרן, כולל ניידות סריקה של חלקיקים סייזר (SMPS), חלקיקים אופטיים סייזר (OPS) למדידה.

2. דור של תרסיס יבש

הערה: מפעילי יש לבצע תרסיס דור בשכונה fume.

1. להרכיב מערכת להפקת אירוסולים יבש
   הערה: התליה של חלקיקי גז או נוזל צריך להיות מתאים התרבות מעוצבת של יישום, תא. השיטה הבאה יכולה להתבצע באמצעות תרסיס בנוזל. העיצוב של המערכת תרסיס יבש הוא מפני אש ואח. ³⁷ סכימטי של מערכת פיזור יבש מוצג באיור1.
   1. את ברז להתחבר בכל קצה של גודל השחיל הצינור 4" 1/8, זה ישמש הופר חלקיקים. להתחבר 2" 1/8 גודל צינור ברז אחד.
   2. שוקל חלקיקים נחושת, במחקר זה ריכוז מסה עבור כל גודל החלקיקים נשמר קבוע תוך קביעת היעילות התצהיר. להשתמש 7.5 מ"ג של 40 ננומטר נחושת חלקיקים, 7 מ"ג של חלקיקים nm נחושת 100 מ"ג 13 של חלקיקים 800 nm נחושת לכל חשיפה. למקם את חלקיקי נחושת הופר חלקיק דרך הקצה הפתוח.
      הערה: כמות חלקיקי נחושת שקל ישמש המיסה מבוסס ריכוז מנוהל.
   3. המקום של 3" פיסת הקוטר החיצוני (OD) אבובים ½" סביב צינור 2" המקום HEPA מסנן בתוך צנור קצר זה כך כיוון הזרימה היא דרך ברז.
   4. להתחבר הגנרטור ואקום שסתום כדור אחרים באמצעות שרשור. להתחבר ואקום גנרטוריים מיכל אוויר על-ידי הצבת של "5/16" OD צינורות לתוך הקשר דחיפה-כדי-lock. השתמש OD אבובים ¼" כדי להתחבר לשקע של הגנרטור ואקום הסידור ניסיוני על ידי הנחת הצנרת מעל השקע של הגנרטור ואקום.
2. השימוש במערכת תרסיס יבש כדי ליצור תרסיס יבש
   1. לפתוח את המיכל אוויר על-ידי סיבוב שמתחזקים את הברז הראשי ולאפשר זרימת אוויר למערכת. לפתוח את השסתום על המתקן זרימה על המיכל אוויר, להגדיר כך הזרימה דרך המערכת שווה ההגדרות הרצויות על המשאבה ואקום.
   2. פתח את ברז הקרוב מסנן HEPA ולאחר מכן לפתוח את ברז ואקום גנרטוריים הקרוב ביותר. פקח אלה עבור 3 s כדי לאפשר חלקיקים ששולפים לתוך זרם האוויר.
   3. לסגור את ברז הקרוב ואקום מחולל ולאחר מכן לסגור ברז הקרוב מסנן HEPA. לאפשר האוויר ממיכל לזרום משך זמן הניסוי לפי הצורך.
   4. סגור שסתומים הראשי, הרגולטור על מיכל אוויר כדי לעצור את הזרימה. נקי כדוריים, ואקום גנרטוריים באמצעות אתנול 70%. אוטוקלב צינורות מתכת עבור עיקור.

3. בתצהיר היעילות מדידה באמצעות PIVEC

הערה: מפעילי יש לבצע חשיפות תרסיס בשכונה fume.

1. למדוד את התצהיר על ידי איסוף בתרסיס nanoparticle נחושת שנוצר בשלב 2.2 על מסנן קדם שנשקל. השתמש את המינון הופקדו, נמדד באמצעות המסה שנאספו על המסנן, והמנה מנוהל, נמדד באמצעות כמות החלקיקים נחושת שנשקל, כדי לקבוע את היעילות התצהיר.
   1. שמור 1.00 מיקרומטר נקבובית זכוכית סיבים מסננים בתנאים לחות נמוכה, שמתואר 1.1.2, במשך לפחות 24 שעות לפני טרום חשיפה מדידות. שוקל מסנן בשימוש שלוש פעמים ולהקליט את המשקולות מסנן. המקום למסנן שאינם בשימוש של תרבות תא הכנס.
   2. בחר תאים מתאים לתרבות הוספה מתאם (6 טוב או טוב 24) עבור PIVEC לתמוך את תותב התרבות תאים עם המסנן. המקום התרבות התא להוסיף מתאם פיסת על הבסיס PIVEC, הגדרת למקום כזה כי הבסיס של היצירה מתאם הוא רחב יותר למעלה.
   3. שימוש פינצטה כדי למקם תרבית תאים מסנן נטען להוסיף בתוך חתיכת מתאם. מניחים את החלק העליון על גבי פיסת מתאם, להתיישב במקום כזה כי הבסיס של החלק העליון הוא רחב יותר למעלה. עוטפים PIVEC עם שכבה אחת של דבק.
   4. להתחבר 37 mm חתיכות קלטת על החלק העליון והתחתון של PIVEC על ידי דחיפת למקומו. מניחים ¼" תיל מתאמי כניסת קלטות ו עודפים.
   5. לעטוף את החימום resistive סביב PIVEC כך החוטים הם בבסיס. הקלטת כדי לאבטח.
   6. עוטפים PIVEC עם ~ 8 סיבובים של רדיד אלומיניום לבידוד. לאבטח עם קלטת.
   7. לחבר 2" חתיכה ארוכה של 1/2" הקוטר החיצוני גמיש אבובים על המתאם על גבי PIVEC. הסר אבובים מגומי נקבובי במים סטריליים ומקום בתוך צינורות על גבי PIVEC.
   8. מקום PIVEC בתוך המלחציים על הדוכן טבעת ומאובטח. הגדרת להשלים עם משאבת ואקום, מוני חלקיקים, הגדרת תרסיס.
      הערה: המינון הופקדו המבוססת על מספר יכול להיקבע רק אם מוני חלקיקים ממוקמים לפני את PIVEC ואחרי את PIVEC על מסלולים נפרדים.
   9. חושפים את המסננים באמצעות שלב 2.2 פרוטוקול, זמן החשיפה הרצויה וקצבי זרימה, במחקר זה שזמן החשיפה של 10 דקות-0.5 LPM שימש. הסר PIVEC הסידור. להוציא את תותב תרבות תא ולמקם את המסנן חשוף בעל מסנן תחת תנאי לחות נמוכה לפחות 24 שעות לפני מדידות.
   10. PIVEC נקי עם 70% אתנול. לחטא עם האור האולטרה סגול במשך לפחות 30 דקות לפני הניסוי הבא.
   11. שוקל את המסנן חשוף שלוש פעמים ולהקליט את המשקולות מסנן. מקם את המסנן חשוף בעל מסנן תוויות עבור אחסון.

4. חישוב של הפקיד מינון ויעילות התצהיר

הערה: הידע של העדות הוא חשוב עבור המינהל תרסיס ופרשנות של תגובת תאי.

1. לחשב את התצהיר של מדידות מבוסס-מסה
   1. לחשב את המסה הופקדו על מסנני כהפרש בין משקל ממוצע טרום חשיפה לבין משקל ממוצע לאחר חשיפה. ערך זה הוא המינון הופקדו מבוסס-מסה לניסוי.
   2. שימוש מנוהל מסה, מ'_admin, המבוסס על מסה שהופקדו המינון נקבע 4.1.1, ז_ה-dep, כדי לחשב את היעילות התצהיר מבוסס-מסה, η_מ', לניסוי.
      
   3. ממוצע של ערכים מן 4.1.1 4.1.2 לניסויים לפחות 3 לקבוע התצהיר ויעילות התצהיר עבור PIVEC עבור גודל החלקיקים.
2. לחשב את התצהיר של המבוססת על מספר מדידות
   1. ודא כי מדידות עם מוני חלקיקים בוצעו עם מוני לאחר את PIVEC, כדי לקבוע ריכוז החלקיקים לפני PIVEC. לשלב את ריכוז החלקיקים לאורך זמן עבור המונה חלקיקים ואז לשלב מעל קוטר של חלקיקים כדי לקבוע את הסכום הכולל חלקיקים נמדד.
   2. לחשב את מספר החלקיקים הופקדו כהפרש בין החלקיקים מנוהל חלקיקים למדוד את הפוסט-PIVEC. ערך זה הוא המינון הופקדו המבוססת על מספר לניסוי.
   3. שימוש מנוהל חלקיקים, n_admin, המבוססת על מספר להפקיד במינון n_dep, ספיקה, V, זמן, t, כדי לחשב את התצהיר המבוססת על מספר יעילות, η_n, לניסוי.
      
   4. ממוצע של ערכים 4.2.2 ו 4.2.3 לניסויים לפחות 3 לקבוע התצהיר ויעילות התצהיר עבור PIVEC עבור גודל החלקיקים.

5. תרסיס חשיפה של תאים

הערה: עבור התא תרבות הממשק אוויר נוזלי הקורא נקרא ריק ואח. ³⁸ אופרטורים, יש לבצע הוספה תרבות תא טעינה (צעדים 5.1.2-5.1.4) בתוך ארון אבטחה. אופרטורים, יש לבצע חשיפות תרסיס בשכונה fume.

1. התרבות תאים על ממשק אוויר נוזלי
   1. הרם A549 תאים מן הבקבוק תרבות על-ידי הוספת טריפסין-EDTA, 3 מ"ל בקבוקון T75 או 1 מ"ל על בקבוקון T25, תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 º C. להוסיף 7 מ של מדיה מלאה עבור בקבוקון T75 או 4 מ"ל של התקשורת מלאה T25 הבקבוקון אל הבקבוק, יש לשטוף את הבקבוק קיר עם השעיה תא למקסם את מספר התא התאושש. להעביר את המתלים תא צינור חרוטי סטרילי 15 mL ואז צנטריפוגה תאים ב 800 x גרם במשך 3 דקות.
   2. הסר את supernatant המכיל טריפסין-EDTA, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של התקשורת מלאה. להסיר µL 10 של השעיה תא ומוסיפים hemocytometer. לספור תאים באמצעות hemocytometer כדי לקבוע את הריכוז ואת המספר הכולל של תאים.
   3. המקום 0.5 מ"ל של מדיה מלאה כל טוב בתוך צלחת טוב 24 שעות ביממה. מקום מוסיף התרבות תאים שאינם בשימוש בארות. תרבית תאים זרע מוסיף בצד הפסגה צפיפות תא ליד עונה 1 פרק 10⁵ תאים/cm² עבור סוגי תאים לגדול בקצב ליד הכפלת ליום. זרע A549 תאים בתוך בגודל 24 להוסיף טוב, להוסיף תאים זרע על צפיפות של עונה 1 פרק 10⁵ תאים/cm² על-ידי הוספת תאים 35,000 התרבות התא.
      הערה: תאים עם קצב צמיחה איטי יכול להיות נזרע על צפיפות תאים מוגברת.
   4. הוסף מדיה מלאה לצד הפסגה של התא תרבות הוספה כדי להגיע את עוצמת הקול הסופי (עבור 24 צלחת טוב נפח סופי הוא 0.25 mL).
   5. תרבות במשך 7 ימים בתנאים המשוקע, החלפת מדיה כל 1-2 ימים. לאחר 7 ימים, הסר את הפסגה המדיה והתרבות לפחות יום אחד בתנאים עלי, החלפת רק התקשורת basolateral.
2. להרכיב PIVEC
   1. מאפשרים לתאים equilibrate לממשק אוויר נוזלי לפחות 24 שעות לפני החשיפה.
   2. בחר תאים מתאים לתרבות הוספה מתאם עבור PIVEC לתמוך את תותב התרבות תאים עם המסנן. תרבית תאים המקום להוסיף מתאם חתיכה על גבי PIVEC הבסיס, הגדרת למקום כזה כי הבסיס של היצירה מתאם הוא רחב יותר למעלה. להוסיף 4 מיליליטר תא תרבות המדיה הבאר של בסיס PIVEC.
   3. שימוש פינצטה כדי למקם את התרבות התא להוסיף בתוך חתיכת מתאם להציב בשלב 5.2.3. מניחים פיסת העליון על גבי פיסת מתאם, להתיישב במקום כזה כי הבסיס של החלק העליון הוא רחב יותר למעלה. עוטפים היטב, PIVEC עם שכבה אחת של דבק.
   4. להתחבר 37 mm חתיכות קלטת על החלק העליון והתחתון של PIVEC, על ידי דחיפת למקומו. מניחים ¼" תיל מתאמי כניסת קלטות ו עודפים.
   5. לעטוף חימום התנגדות סביב PIVEC כך החוטים הם בבסיס. הקלטת כדי לאבטח.
   6. עוטפים PIVEC עם ~ 8 סיבובים של רדיד אלומיניום לבידוד. לאבטח עם קלטת.
   7. להתחבר קטע קצר של 1/2" צנור גמיש הקוטר החיצוני המתאם בראש PIVEC. הסר אבובים מגומי נקבובי במים סטריליים ומקום בתוך צינורות על גבי PIVEC.
   8. מקום PIVEC בתוך המלחציים על הדוכן טבעת ומאובטח. השלם את קביעת עם משאבת ואקום, הגדרת תרסיס.
3. לחשוף תאים-עלי באמצעות את PIVEC
   1. להשתמש יעילות התצהיר נקבע בשלב 2 כדי לחשב את המסה של חלקיקי להיות aerosolized. שוקל מסה המתאים ולהוסיף מערכת תרסיס להגדיר בעקבות שלב 2 בתוך המנוע fume.
   2. לחשוף תאים על-ידי ביצוע שלב 2.2 במחקר ביולוגי נקודות הקצה של התאים נחשפו כ- 3.5 מ"ג של חלקיקים נחושת עם קצב זרימה של 0.5 LPM, משך חשיפה של 10 דקות שליטה מחקרים שבוצעו לקביעת אוויר humidified השפעת אוויר לבד. הסר PIVEC הסידור. להוציא את תותב התרבות תאים, מניחים בצלחת טוב סטרילי וחוזרים החממה₂ CO (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, 90% לחות).
   3. האחות המדיה מן PIVEC. אם ביצוע ניסויים נוספים, שטיפה התחתון של PIVEC עם פוספט buffered פתרון ולאחר מכן חזור על שלב 5.1 ו- 5.2.
   4. PIVEC נקי עם אתנול 70% בסיום. לחטא עם האור האולטרה סגול במשך לפחות 30 דקות לפני הניסוי הבא.
4. נהלים וזמינותו הביולוגית
   הערה: מבחני שבוצעה במחקר זה היו דור סטרס חמצוני דרך וזמינותו DCFH-DA cytotoxicity דרך שחרור לקטאט דהידרוגנאז (LDH).
   1. להמיס 24.4 מ"ג של DCFH-DA ב 50 מ ל מתנול כדי להפוך פתרון 1 מ DCFH-DA. פתרון זה ניתן לאחסן ב-20 ° C עד 4 חודשים. למהול 1 מ DCFH-DA פתרון על ידי ערבוב 0.1 מ"ל של 1 מ מ DCFH-DA פתרון 9.9 מ ל HBSS לעשות 10 מיליליטר 10 מיקרומטר DCFH-פרקליט המחוז
   2. הסר תא תרבות ומדיה שטיפת תא תרבות עם 1 מ"ל ל- PBS. להוסיף 0.5 מיליליטר 10 מיקרומטר DCFH-DA פתרון כל טוב, החלפת מוסיף בסיום. מכסים בצלחת ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photoactivation של לצבוע ולחזור חממה 37° C עבור 1 h.
   3. להסיר תאים של החממה, וארוקן את הפתרון עובד DCFH-DA מן הבארות. להוסיף 0.5 mL HBSS בארות ולהחליף מוסיף התרבות תאים.
   4. לטעון את הצלחת היטב לתוך צלחת קורא ולמדוד פלורסצנטיות בסיסית באמצעות עירור/פליטה אורכי הגל של 485/530 ננומטר. הסר צלחת צלחת קורא ו'טען הוספה לתוך PIVEC לחשיפה.
   5. לחשוף תאים למשך החשיפה הרצויה. הסר הוספה PIVEC ולחזור לבסיס טוב. הסר µL 50 של נוזל basolateral צלחת טוב והמקום בצלחת טוב לבן 96. למדוד את זריחה של DCF באמצעות עירור/פליטה אורכי הגל של 485/530 ננומטר בכל 30 דקות לאחר חשיפה כבר שעתיים.
   6. תן נוזל basolateral equilibrate לטמפרטורת החדר במשך 20-30 דקות להוסיף 50 µL של LDH assay פתרון, מעורבות פרוטוקול יצרן הבאים, כדי basolateral נוזלים צלחת היטב ולתת מגיב במשך 10 דקות להוסיף 25 µL של להפסיק פתרון טוב. לקרוא זריחה של מוצר resorufin באמצעות עירור/פליטה אורכי גל 560/590 ננומטר.
   7. להסיר נוזל basolateral נוספות, חזור על שלב 5.4.6 ב 4 שעות ו- 24 שעות לאחר חשיפה.

6 שיטות סטטיסטיות

1. ניתוח של נתוני וזמינותו הביולוגית
   1. דוח ROS ייצור כמו העלייה עוצמת קרינה פלואורסצנטית תאי המטופל ביחס למדידות בסיסית. דו ח פעילות LDH כמו העלייה עוצמת קרינה פלואורסצנטית של תאים שטופלו ביחס תאים ללא טיפול.
   2. לבצע גורם יחיד ANOVA כדי לקבוע הבדלים סטטיסטיים בין ערכות נתונים. במקרים המתאימים, לבצע סטודנט t-בדיקות לפי שווי של מובהקות של 0.05. לדווח נתונים כמו הממוצע ± סטיית התקן של פחות שלוש מדידות חשיפה.

תוצאות

תעסוקתית במבחנה הרעלים כוללת שמירה על יכולת הקיום הסלולר תוך כדי ביצוע החשיפה תרסיס. מערכת PIVEC מוצג באיור 2, לרבות הטמפרטורה, בקרת לחות, את PIVEC שחוקים. הטמפרטורה נשמר באמצעות תנור resistive המופעלים באמצעות סוללות והגדילה תרסיס humidified באמצעות לחות טבעי דרך ...

Discussion

מסנן קלטות מספקות שיטה פשוטה, זולה של איסוף אירוסולים באזור נשימה; עם זאת, תרסיס מופק מסננים לא מייצגים את תרסיס כולו (כלומר גזים שיכללו חומרים נדיפים, חלקיקים) ודוגמאות כתוצאה מכך להגביל את ההערכה של השפעות ביולוגיות קשורים. באמצעות העיצוב הראשוני בקלטת מסנן 37 mm, PIVEC נועד לשמור על ניידות ומ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scanning mobility particle sizer (SMPS)	TSI, Inc.	3910	NanoSMPS
Optical particle sizer (OPS)	TSI, Inc.	3330
Stainless Steel Pipe, 4" Long	McMaster-Carr	4830K116	Standard-Wall 304/304L, Threaded on Both Ends, 1/8 Pipe Size
Brass Ball Valve with Lever Handle	McMaster-Carr	4112T12	Compact High-Pressure Rating, 1/8 NPT Female
Steel Pipe, 2" Long	McMaster-Carr	7753K121	Standard Wall, Threaded on One End, 1/8 Pipe Size
HEPA filter	GE Healthcare	09-744-12	HEPA-Cap Disposable Air Filtration Capsule
Vacuum Generator	PISCO USA	VCH10-018C
PIVEC	VCU		For design please contact authors
Resistive heater
1/4" barbed connectors	Zefon International, Inc.	459743
Porous tubing	Scientific Commodities, Inc.	BB2062-1814A	Hydrophilic 10 um pores
Battery power bank
Cell culture insert	Fisherbrand	353095	24 well plate insert
Filter Forceps	Fisherbrand	09-753-50
Transfer Pipette	ThermoScientific	13-711-27
Glass Fiber Filters	SKC	225-7	Binder-Free Type AE Filter 37 MM 1.00 um pore
Ultra Micro Balance	A&D	BM-22	Housed in environmental chamber
37 mm filter cassette	SKC	225-3250	Filter Cassette Blank, 37 mm, Clear Styrene
Variable flow vacuum pump	SKC	220-5000TC	AirChek TOUCH, 5 to 5000 mL/min
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1090	40 nm
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1088	100 nm
Copper Particles	U.S. Research Materials, Inc.	US1117M	800 nm