פרוטוקול אל חלד באיכות גבוהה בידוד RNA של לייזר לכידת תאי Microdissected Purkinje המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן

Summary

פרוטוקול זה משתמש בגישה העיניינים להמחיש, בידוד תאי Purkinje ברקמת קפוא טרי מן המח האנושי פוסט-מורטם באמצעות לייזר ללכוד microdissection. המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה עבור רצפי RNA.

Abstract

לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי יתרון זה מאפשר עבור האוסף של תאים cytologically או phenotypically רלוונטי או אזורים של רקמות heterogenous. המוצר שנתפסו ניתן להשתמש במגוון של שיטות מולקולריות חלבון, בידוד ה-DNA או RNA. אולם, שימור של RNA מרקמות המוח האנושי לאחר המוות הוא מאתגר במיוחד. טכניקות להדמיה סטנדרטי עבור הפונקציה LCM דורשים היסטולוגית או שגרות מכתימים immunohistochemical אשר יכול לקדם לבזות RNA. לכן, תיכננו פרוטוקול נירוסטה עבור הפריט החזותי LCM עם הייעוד של שמירה על תקינות RNA ברקמת המוח האנושי פוסט-מורטם. התא Purkinje של המוח הקטן הוא מועמד טוב ויזואליזציה אל חלד, עקב בגודל ובמיקום אופיינית. קליפת אסטרוציטומה יש שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, הפיכתם של ארכיטיפ טוב לזיהוי תחת בהגדלה מיקרוסקופית. תאי Purkinje הם נוירונים גדול ממוקם בין השכבה תא גרגר, שהינה רשת סלולרית בצפיפות של נוירונים קטן, השכבה המולקולרית, אשר הוא דליל בגוף התא. בגלל זה אדריכלות, השימוש של ויזואליזציה נירוסטה הוא ריאלי. מערכות אחרות איברים או תא המחקים פנוטיפ זה יהיה גם מתאים. פרוטוקול נירוסטה נועד לתקן רקמת קפוא טרי עם אתנול ולהסיר שומנים עם קסילן להמחשת מורפולוגי משופרת תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה. פרוטוקול זה אינו חשבון בשביל שיטות קיבוע אחרות, היא תוכננה במיוחד עבור דגימות רקמה מוקפאות שנלכדה באמצעות של אולטרה סגול (UV)-מערכת LCM. כאן, אנו מציגים עבור חלוקתה ותיקון רקמות אנושיות אסטרוציטומה טריים קפואים פוסט-מורטם וטיהור של RNA מתאי Purkinje מבודדת על ידי UV-LCM, תוך שמירה על איכות ה-RNA עבור ה-RNA עוקבות-רצף פרוטוקול מלא. בידיים שלנו, פרוטוקול זה מייצר רמות יוצאות דופן של ויזואליזציה הסלולר ללא צורך מכתים ריאגנטים ותשואות RNA במספרים גבוהים RNA תקינות (≥8) לפי הצורך לניסויים פרופיל תעתיק.

Introduction

לייזר לכידת microdissection (LCM) הוא כלי רב ערך מחקר המאפשרת הפרדת תאים באופן פתולוגי רלוונטי להערכת מולקולרי מונע עוקבות. השימוש של ניתוחים מולקולריים אלו דגימות רקמה הטרוגנית, המתאם עם נתונים פתולוגית וקלינית הוא צעד שנדרש לצורך הערכת המשמעות translational של המחקר הביולוגי¹. בעת ניתוח נתוני ביטוי גנים RNA, השימוש של מקטעי רקמת קפוא מומלץ מאוד שכן היא מאפשרת עבור איכות מעולה של RNA וכן מוגדל כמות². זה הוכח גם כי באיכות גבוהה והן את כמות ה-RNA הם חיוניים עבור נתונים משמעותיים בין רצפי הרנ א³. עם זאת, בעת שימוש RNA מרקמות טריים קפואים פוסט-מורטם עבור הפונקציה LCM, השפלה RNA הוא אתגר גדול, כמו זה מתרחש מיד עם מותו את מימדיו מתווך על ידי גורמים שונים הקשורים עם רקמת אוסף שיטה^4,5 . יתר על כן, ה-RNA השפלה היא מתעצמת כאשר טכניקות צביעת נדרשים לזהות פרטים היסטולוגית וזיהוי התא. התמחה מכתים טכניקות, hematoxylin & אאוזין, הכתם Nissl, immunofluorescence ו אימונוהיסטוכימיה מועילים ב המבדילים תאים של משתית שמסביב אבל הוכחו לבזות RNA ולשנות התעתיק ביטוי פרופילים⁶. לכן, המעבדה שלנו יצרה פרוטוקול נירוסטה שתוכננה במיוחד כדי לשמר RNA המח האנושי פוסט-מורטם למטרות של רצפי RNA לאחר LCM בידוד של נוירונים Purkinje.

עיבוד רקמה קפוא טרי עבור הפונקציה LCM, שיטת קיבוע יכול להשפיע variably RNA וגם רקמות תקינות. קיבוע פורמלין הוא תקן לשימור מורפולוגי, אך גורם cross-linking זה ייתכן קטע RNA ומשבשים RNA הגברה⁷. קיבוע אתנול הוא חלופה טובה יותר לבידוד RNA, כפי שהוא מקבע coagulative זה לא לגרום cross-linking¹. כדי לשפר את החזיית מורפולוגיה רקמות, קסילן היא הבחירה הטובה ביותר, כאשר הוא מסיר שומנים מן הרקמה. עם זאת, שם מוכרים מגבלות כאשר ניצול קסילן ב LCM, כמו הרקמות יכול להתייבש ולהיות שביר-גרימת רקמות פיצול על לייזר לכידת⁷. קסילן גם רעלן נדיפים, חייבים להיות מטופלים כראוי בשכונה fume. למרות זאת, קסילן הוכח כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה תוך גם שמירה על תקינות רנ א⁸. לכן, פרוטוקול שלנו סובבת, השימוש של 70% אתנול קיבוע והתייבשות אתנול, ואחריו קסילן הדגירה עבור בהירות מורפולוגי.

חשוב לציין סוגים שונים של מערכות microdissection מבוססת לייזר, כפי הם הוכחו נבדלים מהירות, דיוק ואיכות RNA. הלייזר האינפרא-אדום (IR) ללכוד microdissection ומערכות אולטרה סגול (UV) לייזר microbeam microdissection היו שתי פלטפורמות LCM הרומן שצצו כמעט במקביל⁸. מערכת אינפרא-אדום-LCM מעסיקה "מערכת קשר" באמצעות סרט גומי סינתטי אשר בהתקשותו שקוף וממוקם על סעיף רקמות, תאים עניין באופן סלקטיבי לדבוק הסרט על-ידי פולסים ממוקד של לייזר אינפרא-אדום. לחלופין, מערכת UV-LCM היא "מערכת ללא מגע" לפיה קרן לייזר ממוקדת חותך את התאים או אזורים של עניין בתוך הרקמה; בהתאם לתצורת ב שתי פלטפורמות מסחריות זמין כעת המשתמשות או עיצוב מיקרוסקופ הפוכה או זקוף, רקמות נרכש מכשיר אוסף ע י גל הלחץ לייזר המושרה זה משפד אותו נגד כוח המשיכה או רקמה אסף על-ידי כוח הכבידה, בהתאמה. יתרונות משמעותיים של מערכת UV-LCM כוללים רכישת תא מהר יותר, ללא זיהום אוסף עם גישה ללא מגע, ניתוח מדויק יותר בשל הרבה יותר קטן לייזר קרן בקוטר⁹. פרוטוקול זה תוכנן במיוחד עבור מערכת UV-LCM, לא נבדק בכל מערכת אינפרא-אדום-LCM. גם עיצוב מערכת UV-LCM, כאשר תאים צבירת לתוך הכיפה איסוף, שימוש coverslip זה משפר את בהירות הסלולר במהלך מיקרוסקופ אינו מתאים, כמו התאים לא יוכל להיכנס לתוך הכיפה אוסף. לכן, כדי לשפר את רקמת ויזואליזציה, בדקנו את השימוש של אוסף אטום caps, אשר נועדו לשמש coverslip להמחשת מיקרוסקופיים מערכות UV-LCM, נגד נוזלי אוסף מלא בקבוקים. אוסף מילוי נוזלי כמוסות עשויה להיות מאתגרת, הנוזל כפוף אידוי, יש להחליפם בתדירות גבוהה תוך כדי עבודה על המיקרוסקופ. הזמן הופך להיות גורם חשוב ליציבות RNA, כפי הרקמה שנתפסו לבישום⁷.

המעבדה שלנו מחקרים השינויים neuropathologic לאחר המוות הקטן בחולים עם רעד חיוני (ET) והפרעות הקשורות ניווניות של הצרבלום. הראו שינויים מורפולוגיות שבמרכזה תאי Purkinje להבחין בין המקרים ET לעומת פקדים, כולל מספר מופחת של תאי Purkinje, גדל רגרסיה דנדריטים וכן מגוון של שינויים עצב, מוביל אותנו בקביעתו Purkinje הזה ניוון תאים היא תכונה וחיסונים הליבה ET פתוגנזה^10,11,12,13. פרופיל תעתיק שימש למחלות רבות נוירולוגיים לחקור את הבסיס המולקולרי שבבסיס של שינויים ניווניים הסלולר. עם זאת, פרופילים תעתיק מדגימות הטרוגנית, כגון אזורים רקמת המוח, ניתן לאשש להסוות את הביטוי של הפרוטוקולים שפע נמוכה ו/או לצמצם את הגילוי של השינויים המולקולריים המתרחשים רק אוכלוסיה קטנה של המושפע תאים, כגון תאי Purkinje בקליפת אסטרוציטומה. למשל, תאי Purkinje במידה רבה יותר על ידי תאים גרגר שופע בקליפת אסטרוציטומה מאת; 1:. כ 3000 לפיכך, למקד בצורה יעילה transcriptome שלהם דורשת בידוד ספציפי של נוירונים אלה. קליפת אסטרוציטומה תחום שכבות נפרדות נבדלים צפיפות התאים, גודל התא. ארכיטקטורה זו הסלולר הוא אידיאלי כדי לדמיין דגימת רקמה קפוא טרי ללא ריאגנטים מכתימים המכילים צבען. בתיאוריה, פרוטוקול זה יכול גם להיות מיושם סוגים אחרים, רקמות כי יש רקמת הייחודי דומה בארגון.

פרוטוקול זה תוכנן לעבוד במיוחד עבור תאי Purkinje הדמיית המוח האנושי פוסט-מורטם הקטן. פרוטוקולים רבים קיימות עבור הקיבעון, צביעת ויזואליזציה ושימור RNA סוגים רבים של רקמות למטרות של שני IR - ו UV-LCM. כשהוא מהרהר בעל עיצוב ניסיוני עבור UV-LCM, אנשים צריך להתאים נהלים שתתאים בצורה הטובה ביותר את הצרכים ואת הדרישות של להתחלה וסיום חומרים. כאן, אנו משלבים היבטים רבים של פרוטוקולים שונים LCM כדי לספק שיטה משופרת להמחשת תאי Purkinje ושההתפתחות האנושי פוסט-מורטם ללא צורך לצבוע המכיל נוגדנים מכתימים להתכונן RNA באיכות גבוהה transcriptome . רצף.

Protocol

כל הדגימות אדם מנוצל פרוטוקול זה הושגו עם הסכמה מדעת, אושרו על ידי פנימיות סקירה לוח (IRB) באוניברסיטת קולומביה, אוניברסיטת ייל.

הערה: מכלול של פרוטוקול זה צריך לעקוב קפדנית RNA טיפול הנחיות, לפיה יד בכפפה משמש תמיד, כל המשטחים מנוקים עם decontaminator RNase כל עובד שחומרים RNA/DNA/נוקלאז חינם.

1. בדיקת תקינות RNA של רקמות לפני הפעלת הפונקציה LCM

הערה: בדיקות איכות RNA יכול להיעשות על ידי שיטות רבות. ודא כי RNA מתוך המקטע כולו נבדק לספק מספר שלמות RNA נציג (RIN) עבור המדגם.

1. בחר בקפידה דגימות רקמה לצורך הכללה שמתאימים בתוך הפרמטר של הנבחנים. אם גזירה-cryostat, לעבור שלב 1.2. אם לא, לעבד את הרקמה בהתאם ולעבור שלב 1.11.
2. קבל שני מיכלים של קרח יבש. הגודל יהיה תלוי במספר הדגימות.
   1. במקום המכולה הראשונה של קרח יבש, של שפופרת ריק, שכותרתו 2 מ"ל עם הקוד רקמות.
      הערה: זה לוקח 10 דקות עד שהשפופרות להקפיא. צינורות בוודאי קופא לפני הנחת הרקמה לתוכם; אחרת, הרקמה יתמוססו על פני ברכבת התחתית.
   2. במיכל השני של קרח יבש, מקום הרקמה מקפיא-80 ° C הדורשת סימון ה-RNA.
3. לנקות את cryostat. ראה שלב 4.7 לקבלת מפורט ניקוי בהליך.
4. להסיר את הרקמה של קרח יבש, לחתוך קטע קטן של רקמה עם סכין גילוח RNase ושוקמו. רקמות צריך להיות כ 1 ס"מ על 1 ס"מ בגודל.
5. במקום של התל כ 3 מ מ גבוהה של האופטימלית חיתוך טמפרטורה (אוקטובר) המורכב על cryostat "צ'אק" ולאפשר לו להקפיא באופן חלקי. אז, במקום הרקמה מעל OCT — לדחוף לתוך OCT, פשוט לאפשר להם לנוח על העליונה.
6. ברגע OCT מתקשה למקם את הצ'אק עם רקמת הנטען cryostat חיתוך הזרוע, עמדה מול הלהב cryostat.
7. לקצץ ב 30 סעיפים μm עד הרקמה אפילו.
8. לחתוך 300 μm של רקמות, המקום בשפופרת mL 2 קפוא. מקם את הצינור בחזרה לתוך קרח יבש.
9. להסיר את הרקמה "צ'אק" ומניחים בחזרה לתוך קרח יבש עד מוכן כדי לכלוא.
10. חזור על הצעדים 1.4 – 1.9 לכל רקמות.
11. לאחר כל דוגמאות מלאה, לחלץ RNA באמצעות של RNA ערכת חילוץ מסופקים (טבלה של חומרים #15). פרוטוקול מפורט מסופק עם הקיט מיצוי ה-RNA. בצע את הוראות כולל את שלב אופציונלי לייבוש אוסף שפופרת קרום, הצעד אופציונלי לעיכול DNase (טבלה של חומרים #16).
12. בדוק את התקינות של RNA המחולצים דרך איכות הערכת bioanalyzer¹⁴.

2. להתכונן לפני החל חלוקתה LCM

1. לנקות את מחזיקי שקופיות לפני כל סיבוב של רקמות חלוקתה עבור הפונקציה LCM. בצע את ההליך ניקוי יום לפני השימוש כדי לאפשר מלאה ייבוש למשך הלילה.
   הערה: שקופית מחזיקי משמשים קיבוע בסעיף רקמות אתנול בתוך קסילן.
   1. שקופית מחזיק ניקוי הליך: לשטוף עם decontaminator RNase ואחריו מים מטופלים pyrocarbonate (DEPC) diethyl. מאפשרים לילה יבש במהופך על השטח חינם ה-DNA/RNA/נוקלאז, הימנעות אבק או אחרים זיהום באוויר.
      התראה: DEPC הוא רעיל מאוד, צריך להיות מטופל. והשמדתי באמצעות פרוטוקול סטנדרטי כימיקלים מסוכנים EH & S.
2. לנקות מברשות חלוקתה עם RNase decontaminator וגם תאפשר לילה יבש. להימנע כל האבק מזהמים אחרים.
3. המקום הקרום שקופיות תחת אולטרא סגול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לא לחשוף שהשקופיות UV יותר מ 1 – 2 ימים לפני שימוש. זה מגביר את הכריכה של הרקמה אל השקופית ממברנה.
   הערה: 2.3 שלב יכול להיות משולב עם שלב 4, מה שמאפשר עבור שקופיות UV טיפול להתרחש באותו היום כמו רקמות אופטים (ראה צעד 4.4).

3. מכינים קיבוע פתרונות עם מים חינם RNase ואתנול באיכות גבוהה

הערה: כל הפתרונות טריים מוכנים בכל ניסוי. ודא כי המחזיק שקופית ניקוי נוהל מ 1.1 שלב השלמת. כל הפתרונות מוכנות ב מחזיקי שקופיות.

1. מקום 30 מ של 100% אתנול מחזיק שקופית אחת.
2. לדלל אתנול עם RNase/DNase/נוקלאז מים חינם. מקום 30 מ"ל אתנול 95% באחד שקופית מחזיק ולשים על קרח.
3. לדלל אתנול עם RNase/DNase/נוקלאז מים חינם. מקום 30 מ של 70% אתנול באחד שקופית מחזיק ולשים על קרח.
4. מקום 30 מ ל 100% קסילן לשניים להפריד בין מחזיקי שקופיות, לתייג אותם כמו #1 ו #2.

4. מכינים Cryostat בשביל לרקמות חלוקתה

1. להביא דלי קרח פתרונות אתנול, מיכל עם קרח יבש על הרקמה.
   התראה: קרח יבש הוא קר מאוד, לכן השתמש כפפות מגן. אין למקם קרח וקרח יבש באותה אריזה. בטמפרטורות שונות קרח, קרח יבש יגרום להם טופס יחד בטמפרטורה לא מוגדר.
2. להסיר את הרקמה המקפיא-80 ° C והמקום בקרח יבש להובלה כדי cryostat.
3. הגדרות cryostat:
   1. קבע את עובי סעיף 14 μm.
   2. קבע את עובי החיתוך μm 30 לשמר כמות רקמת.
   3. Cryostats עם תא כפול, הדגימה מחזיק טמפרטורות, להגדיר את טמפרטורת החדר (CT) ל-18 מעלות צלזיוס. Cryostats עם הגדרה אחת, להגדיר את הטמפרטורה ל-17 מעלות צלזיוס.
   4. Cryostats עם תא כפול, הדגימה מחזיק טמפרטורה, להגדיר את הטמפרטורה אובייקט (OT) ל-16 ° C.
      הערה: בשטחים הכבושים צריך להיות חם יותר מאשר ה-CT על מנת להבטיח אפילו חיתוך. אם הרקמה עדיין גורס, ניתן להגדיל בשטחים הכבושים כדי לטאוואנג, ה-CT יכול להיות עלה ל-18 ° C.
4. מקם את הרקמה cryostat לפחות 20 דקות לאפשר להגיע לטמפרטורה אופטימלית.
   הערה: אם הרקמה אינה בטמפרטורה אופטימלית, זה לגרוס על חיתוך. אין למקם את הרקמה ב-20 ° C בלילה שלפני כדי לשמר את שלמות RNA, כדי למנוע היווצרות גביש קרח. לאפשר את הרקמה כל כך הרבה זמן לפי הצורך equilibrate טמפרטורה אופטימלית לחתוך בצורה חלקה. יישום אופציונלי של דגירה שקופיות תחת UV עלולה להתרחש כאן (ראה צעד 1.3).
5. מקם את "צ'אק" cryostat לפחות 20 דקות לאפשר לרדת עד הטמפרטורה של cryostat.
6. מקום נקי המברשות cryostat לפחות 20 דקות לאפשר לרדת עד הטמפרטורה של cryostat.
7. לנקות את cryostat
   1. לנקות את הבמה עם תערובת 1:1 של RNase decontaminator ו- 70% אתנול מדולל עם מים ללא ה-DNA/RNA/נוקלאז למניעת קיפאון על הבמה.
   2. נקה להב חד פעמיות cryostat חדש עם RNase decontaminator, מקום בעל להב על הבמה. אפשר לפחות 20 דקות על הלהב cryostat לבוא עד הטמפרטורה של cryostat.
   3. נקי גליל נגד צלחת עם RNase decontaminator וצרף לבמה. אפשר לפחות 20 דקות לצלחת גליל נגד לבוא עד הטמפרטורה של cryostat.
      הערה: צלחת אנטי-רול אינו נדרש לחיתוך אך מומלץ בחום. אם צלחת אנטי-רול אינה זמינה, מברשת נקי עובד חלופי. אם הצלחת גליל נגד אינה בטמפרטורה הנכונה, הרקמה להמיס או מקל על חיתוך.

5. חלוקתה רקמות

1. חותכים חתיכה קטנה של הרקמה (~ 1 ס"מ על 1 ס"מ) על חלוקתה. להחזיר את הרקמה הנותרת קרח יבש /-80 ° C מקפיא.
   הערה: ודא כי סעיף הרקמה cortex אסטרוציטומה ~ 95%, איפה ממוקמים תאי Purkinje.
2. המקום התל כ 3 מ מ גבוהה של OCT כדי לכסות את "צ'אק". התחל על ידי בניית השכבות על גבי בתנועות מעגליות ואיטיות, עד שיש גבעה קטנה.
3. ברגע OCT קפוא חלקית, אבל עדיין יש נוזל במרכז, במקום הרקמה מעל OCT. . אל תלחצי הרקמות עמוק לתוך אוקטובר אפשר הרקמה כדי לשבת על אוקטובר עד קפוא לגמרי. זה לוקח 1-2 דקות.
4. מקם את "צ'אק" עם OCT קפוא ואת הרקמה לתוך הזרוע חיתוך cryostat. התאם את הרקמה כך זה מיושר עם להב חיתוך.
5. לאפשר את הרקמה לשבת בזרוע חיתוך למשך 15-20 דקות להתאמת טמפרטורה חדש.
   הערה: תלוי בעובי של הרקמה, זמן נדרש עבור טמפרטורה והפיזיולוגי. לאפשר את הרקמה לשבת זמן רב ככל הנדרש כדי לחתוך נקיה. התאם OT ו- CT כדי לסייע עם רקמת טמפרטורה והפיזיולוגי.
6. לאט הניעו את הרקמה קרוב יותר אל הלהב. ברגע הרקמה הגיעה הלהב, להתחיל תהליך החיתוך. עובי החיתוך צריך להיות מוגדר 30 μm.
7. קיצוץ 2 – 3 x עד הרבדים קליפת גלויים.
8. למקם וליישר את הצלחת אנטי-רול מעל הלהב cryostat.
   הערה: סילבר ליין יופיעו מן האור cryostat-הממשק של להב, צלחת אנטי-רול. זה מציין הצלחת גליל נגד ישירות מעל קצה הלהב.
9. התחילו לחתוך הסעיפים-14 μm. מקטעים חתוכים כראוי יהיה שטוח כתשר אנטי-רול.
   הערה: אם הרקמה תקוע, להבטיח הצלחת גליל נגד מספיק קר. אם נחוץ, הצבת חלק יבש קרח על הרצון החיצוני (צד לא נוגע הבמה) במהירות מקררים את הצלחת אנטי-רול.
10. סעיפים 4-6 גזורה ליישר אותם בצורה אופקית הבמה cryostat.
11. לדוג את השקופית, לאסוף את כל החלקים של הרקמה בבת אחת.
    הערה: באמצעות המברשות, הרם את הקצוות של הרקמה כדי להיות זמינים יותר עבור השקופית בעת האיסוף. . אל תרים מקטע אחד בכל פעם. חשיפה לאוויר בטמפרטורת החדר תגרע RNA שלמות.
    התראה: לא נותנים לגעת השלב של cryostat הקרום. אם הקרום נוגע על הבמה, הוא יתחיל לנתק משקופית זכוכית, יגרום שגיאות בעת ניסיון LCM.
12. מיד לעבור לשלב 6. אל תתמהמה קיבעון.

6. תיקון רקמות/כתם-פחות ויזואליזציה

1. להעביר מיד פרוטוקול קיבוע אתנול
2. הכנס את השקופית מחזיק שקופיות עם אתנול 70% למשך 2 דקות — על קרח.
3. הכנס את השקופית מחזיק שקופיות עם אתנול 95% עבור 45 s – על קרח.
4. הכנס את השקופית מחזיק שקופיות עם אתנול 100% למשך 2 דקות — ב- RT.
5. טובלים את השקופית 3 פעמים ב מחזיק שקופיות עם קסילן 1 — ב- RT.
6. למקם את השקופית מחזיק שקופיות עם קסילן 2 עבור 5 דקות — ב- RT.
7. אפשר להתייבש באזור נקי מינימלית לפחות 30 פעמים יבש יותר הם אופטימליים, עד כדי 60 דקות.
   התראה: תעמוד שקופיות לייבוש בשכונה fume. קסילן הוא הפכפך. שטוח הנחת שקופיות יגרום קסילן למאגר במקטע רקמות, אשר תגרום רקמת להיות כהה מדי.

7. אופציונלי — אחסון שקופית

1. מקום שקופיות מיובשים צינורות בודדים 50 מ ל (שקופית אחת למחזור), מקום במקפיא-80 ° C עד 7 ימים.
   הערה: שקופיות חייב להיות יבש לפני הצבת במקפיא-80 ° C. אל תשתמש/י סופג לחות בתוך הצינור כמו חלקיקים יבצע הטבעה של רקמות, ממברנה. להבטיח הצינורית חזק; אם לא, עיבוי תתרחש בשקופית כאשר מפשיר לשימוש.
   התראה: RNA שלמות פוחתת לאחר 7 ימים, כמו גם איכות רקמת להדמיה.

8. מפשיר לאחסן שקופיות לשימוש

1. הסר את הצינור עם שקופית אחת מהמקפיא-80 ° C h 1 לפני השימוש המיועד.
2. מיד לפתוח את הצינור. לאפשר את הצינור להגיע לטמפרטורת החדר. עיבוי תתרחש על החלק החיצוני של הצינור בלבד.
3. לאחר הצינור הגיע לטמפרטורת החדר, עיבוי כל נעלם (כ 30 – 40 דקות), הסירי את הפקק ולחשוף את השקופית באוויר בטמפרטורת החדר.
4. לאפשר את השקופית להסתגלות לטמפרטורת החדר עבור 15 – 20 דקות לעזוב השקופית בתוך הצינור בפקק הוסר.
   הערה: עכשיו הוא מוכן עבור הפונקציה LCM שקופיות.

9. לייזר Microdissection לכידת תאי Purkinje:

הערה: סעיף זה של הפרוטוקול ידונו רק פרטים הקשורים לכידת תאי Purkinje עבור רצפי RNA עוקבות. סעיף זה מבוסס על ההנחה כי המשתמש הוא מכיר המיקרוסקופ לכידת לייזר UV ואת התוכנה קשורות.

1. נקי השלב מיקרוסקופ, את אוסף המכסים את זרוע עם RNase decontaminator.
2. עם ידיים בכפפות, למקם את השקופית על המיקרוסקופ, 500 μL קאפ אטום הזרוע אוסף.
   הערה: תמיד להבטיח RNA טכניקה נכונה על-ידי ניקוי אזור העבודה עם RNase decontaminator ולהשתמש ידיים בכפפות תוך נגיעה את השקופית או מכסה אטום. ניתן להסיר כפפות ברגע השקופית ואת ו לכידת לייזר החלה.
3. בהגדלה נמוכה, יישר את הכובע אטום על הרקמה אסטרוציטומה, המבטיח כי הכיפה מכסה את האזור כולו דמיינו בחתיכה העין.
   הערה: רק את העין פיסת המיקרוסקופ יראה אם הכובע אטום ממורכזת. המצלמה לא להראות אם הכובע ממורכזת על הרקמה. בהתאם לעיצוב היקף לכידת לייזר, הפריט החזותי דרך הכיפה אטום יהיה גם היצירה העין היחידה או מטמיעים ב עין היצירה והן המצלמה.
4. לדמיין את הרבדים אסטרוציטומה עם 5 x - 10 x המטרה עדשה, הצב את הסמן מעל המקטע בו שכבה מולקולרית, שכבת תאים גרגר מצטלבים (השכבה Purkinje התא).
5. לעבור 40 X והמחש תאי Purkinje.
   הערה: ראה איור 1 , איור 2 דוגמה פריטים חזותיים.
6. להתחיל לכידת תאי Purkinje.
   הערה: כדי לבצע RNA-רצף, לפחות 5 ננוגרם של RNA נדרש. כ 1600-2000 Purkinje תאים התוצאה מספיק חומר RNA רצף. רנ א יהיו יציבים עבור עד 8 שעות-המיקרוסקופ. מבחן UV ומיקוד UV לפני אוסף כדי להבטיח רמות נכונים. לאורך זמן, הרקמה ימשיך להתייבש UV ומיקוד UV יכול ויהיה צורך לשנות.

10. RNA אוסף פוסט LCM

1. הכנת המאגר פירוק התא (להכין טרי בכל פעם)
   1. לדלל מרקפטואתנול במאגר פירוק-מטריים (10 מ"ל μL:1, בהתאמה). מאגר פירוק (RLT) הינו מסופק טבלה של חומרים (#14 ו- #15).
2. להוסיף 50 μL תא פירוק מאגר הכיפה אטום, עם הכובע פונה כלפי מעלה. בזהירות לסגור את הצינורית על הכיפה.
3. להשאיר את הצינור הפוך עבור 1 דקות.
4. מערבולת הצינור עבור 30 s במהירות ספין המאגר פירוק לתחתית הצינור.
5. פתח מחדש את הצינור וחזור על שלבים 10.2-10.4.
6. מקם את הצינור המכיל 100 μL של פירוק מאגר ו- RNA מהמקפיא-80 ° C עד כל הדגימות מוכן לחילוץ RNA (טבלה של חומרים #14).

תוצאות

פרוטוקול זה מפרט את השלבים להכנת רקמת המוח האנושי טריים קפואים פוסט-מורטם UV-LCM. מפרט יסודית וביאורים ניתנים לחיתוך cryostat, כפי שהוא יכול להיות קשה לחתוך את רקמת המוח קפוא טרי עם רמה גבוהה של דיוק. הנקודה החשובה ביותר שיש לקחת בחשבון הוא כי רקמת קפוא טרי הוא קר מאוד ודורש כמות ...

Discussion

פרוטוקול המובאת כאן במיוחד משתנים להיות בגישה אל חלד ב להמחיש רקמות מורפולוגית נפרדות עבור UV-LCM שיטה זו נועדה להגדיל RNA שלמות עוקבות רצפי RNA ישיר, תוך שמירה על רמת משופרת של רקמות ויזואליזציה. היכולת להבחין בין סוגי תאים שונים עבור לכידה, כדי ליצור את האוכלוסייה הטהור של תאים אפשרי, חיוני לה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.