JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

דגם העכבר של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion הוקמה כדי לחקור הפתופיזיולוגיה של שבץ. אנו יש מאתרים ומפסיקים את עורק המוח התיכון נכון ולא נכון עורק תרדמני, להחזיר את זרימת הדם לאחר 10 או 40 דקות של איסכמיה.

Abstract

במחקר זה, מודל העכבר חסימה בעורק האמצעי (MCA) הוא מועסק ללמוד איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion. מודל אמין הדירים העכבר הוא שימושי עבור חוקרים הפתופיזיולוגיה של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion וקביעת אסטרטגיות טיפוליות אפשריות עבור חולים עם קו. וריאציות באנטומיה של מעגל וויליס של C57BL/6 עכברים משפיע על נפח לאוטם שלהם לאחר פגיעה מוחית-איסכמיה-induced. מחקרים הראו הזה סגר MCA הדיסטלי (MCAO) ניתן להתגבר על בעיה זו, לגרום לאוטם יציב במידה. במחקר זה, אנו להקים מודל העכבר סגר שתיים, כלי של מוחי איסכמיה-פגיעה reperfusion דרך ההפרעה של זרימת הדם MCA הנכון. אנו יש מאתרים ומפסיקים את MCA נכון ולא נכון עורק תרדמני (המרכז לאמנות עכשווית), להחזיר את זרימת הדם לאחר תקופה מסוימת של איסכמיה. הפציעה איסכמיה-פגיעה reperfusion גורם לאוטם של גודל יציב של גירעון התנהגותית. תאים חיסוניים היקפיים לחדור איסכמי במוח במהלך תקופת הסתננות 24 שעות ביממה. בנוסף, אובדן העצבית באזור קורטיקליים היא פחות עבור משך זמן ארוך יותר פגיעה reperfusion. לכן, מודל סגר שתיים, כלי זה מתאים חוקרים את התגובה החיסונית ושחזור העצבית במהלך תקופת פגיעה reperfusion לאחר קליפתית.

Introduction

המודל העכבר איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion היא אחת הגישות ניסיוני הנפוצה ביותר עבור חוקרים הפתופיזיולוגיה של המוח הנגרמת איסכמיה פציעה1. בגלל איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion מעורר את המערכת החיסונית היקפיים, תאים חיסוניים היקפיים לחדור לתוך איסכמי במוח וגורמים נזקים עצביים2. לכן, מודל העכבר אמין לשחזור המחקה איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion נדרש להבין הפתופיזיולוגיה של שבץ.

C57BL/6J (B6) עכברים הם המתח הנפוצות ביותר בניסויים שבץ, כי הם יכולים בקלות להיות גנטית מניפולציה. שני דגמים נפוצים של MCAO/פגיעה reperfusion המחקים את התנאי של איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion זמינים. הראשון הוא הדגם נימה intraluminal של MCAO הפרוקסימלית, איפה נימה מצופה סיליקון הוא מועסק כדי intravascularly occlude את זרימת הדם ב- MCA; חוט הלהט occluding תוסר לאחר מכן כדי לשחזר את זרימת הדם3. משך זמן קצר סגר גורמת פגיעה של האזור subcortical, ואילו משך זמן ארוך יותר סגר גורמת infarcts באזורים קורטיקליים ו subcortical. המודל השני הוא הדגם מצדו של MCAO הדיסטלי, שכרוך extravascular מצדו של MCA, המרכז לאמנות עכשווית כדי להקטין את זרימת הדם דרך MCA, אחרי אשר שוקמו זרימת הדם דרך הסרת תפרים, מפרצת סרטון4. במודל זה, לאוטם נגרמת באזורים קורטיקליים, שיעור התמותה הוא נמוך. כי מצדו של דגם MCAO/פגיעה reperfusion דורש craniectomy לחשוף את האתר של MCA הדיסטלי, האתר יכול להיות מאושרות בקלות, תוך בחינת השאלה זרימת הדם ב- MCA דיסטלי מופרת במהלך ההליך היא פשוטה.

B6 עכברים התערוכה וריאציות ניכר באנטומיה של שלהם מעגל ויליס; זה עשוי להשפיע על אמצעי האחסון לאוטם בעקבות איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion5,6,7. כיום, בעיה זו ניתן להתגבר באמצעות מצדו של MCA דיסטלי8. במחקר זה, אנו להקים שיטה occluding את זרימת הדם MCA ולאפשר פגיעה reperfusion לאחר פרק זמן מוגדר מראש של איסכמיה. שתיים, כלי סגר של המודל איסכמיה מוחית-פגיעה reperfusion גורם איסכמיה ארעית של השטח MCA דרך מצדו של MCA הדיסטלי הימני, נכון המרכז לאמנות עכשווית, עם זרימת דם משוחזרים לאחר תקופה מסוימת של איסכמיה. דגם MCAO/פגיעה reperfusion זה גורם לאוטם של גודל יציב, בכמויות גדולות של תאים חיסוניים הסתננות מוח איסכמי במוח, גרעון התנהגותית אחרי איסכמיה מוחית – פגיעה reperfusion4.

Protocol

טיפול בבעלי חיים מוסדיים וועדות שימוש של אקדמיה Sinica, טייפה הרפואי האוניברסיטאי אושר פרוטוקול זה לשימוש של חיות ניסוי.

1. MCAO/פגיעה reperfusion מודל

  1. מספקים העכברים עם גישה חופשית לחדר האוכל והמים עד הניתוח.
  2. אוטוקלב כירורגי כלים, לנקות את שולחן הניתוחים וציוד באמצעות אתנול 70%. ללבוש מסכה כירורגית, כפפות סטריליות. השתמש מעקר חרוז יבש כדי לעקר מחדש כלים כירורגיים אם ריבוי ניתוחים העכבר ייערך בניסוי אחד.
  3. עזים ומתנגד של העכבר 8 ל 12-בת (המונים: 25-30 גרם) באמצעות 0.8% קלוראל-הידרייט, באמצעות הזרקה בקרום הבטן. ודא שהעכבר anesthetized לא קיים רפלקס פדלים (כפי נבדק באמצעות צביטה הבוהן המשרד) לאחר האסתטיזציה.
  4. להשתמש הוטרינר משחה למניעת יובש בעין אחר העכבר אמנם זה תחת הרדמה.
  5. השתמש מערכת לחץ דם לא פולשנית לנטר לחץ דם של העכבר.
  6. השתמש מערכת ניטור פיזיולוגיים לעקוב אחר טמפרטורה רקטלית וגזים בדם שלה. לשמור על טמפרטורת הגוף ב- 36.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס.
  7. Subcutaneously להחדיר את העכבר מניעתי אנטיביוטי (25 מ"ג/ק"ג צפאזולין)8.
  8. הנח את העכבר במצב פרקדן על כרית חימום.
  9. להשתמש קוצץ חשמלי כדי לחשוף את העור על ידי גילוח הפרווה של העכבר על אזור הצוואר הגחון, וכן באזור שבין עין ימין אוזן ימין.
  10. השתמש epilating קרם כדי לנקות את הפרווה מהגוף של העכבר ולחטא באתר כירורגית לסירוגין scrbus עם povidione-יוד ו-70% אתנול.
  11. השימוש איריס מספריים לחתוך חתך 1 ס מ באורך קו האמצע בצוואר.
  12. השתמש איריס מלקחיים לנתח בזהירות את המרכז לאמנות עכשווית חופשי תועה מבלי לגרום פגיעה פיזית.
  13. השתמש התפרים משי 5-0 כדי לבודד את המרכז לאמנות עכשווית.
  14. עושים חתך 0.3 ס מ בקרקפת אל נקודת האמצע בין עין ימין אוזן ימין.
  15. השימוש microscissors לחתוך את השריר temporalis לחשוף את עצם העול, squamosal.
  16. תחת מיקרוסקופ ויבתר סטריאו, להשתמש microdrill כדי ליצור חור בקוטר מ מ 2 ישירות מעל MCA דיסטלי צד ימין.
  17. מאתרים ומפסיקים את המטען של MCA דיסטלי צד ימין באמצעות 10-0 בתפר.
  18. Occlude של המרכז לאמנות עכשווית צד ימין באמצעות סרטון מפרצת nontraumatic.
  19. לאחר 10 או 40 דקות של איסכמיה, להסיר את המפרצת קליפים התפר כדי להחזיר את זרימת הדם MCA, המרכז לאמנות עכשווית.
  20. השתמש קליפ תפירה לסגירת החתך בעור על הראש.
  21. חותם את החתכים עור צוואר הרחם באמצעות בתפר אחד ואחריו סגירת עור הצוואר עם תפרים או סיכות9.
  22. Subcutaneously להזריק הבופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) כאב הקלה9.
  23. לשמור על טמפרטורת גוף של העכבר-36.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס על כרית החימום עד זה שיחזר מלאה מן ההרדמה. מחזירה את החיה עברה ניתוח החברה של בעלי חיים אחרים עד זה הוא החלים לחלוטין. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד זה להכרה מספקת.
  24. המקום העכבר לתוך הכלוב בלוק כך זה יכול לגשת מים ובחופשיות צ'או אחרי זה הוא החלים לחלוטין.

2. צביעת כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium

  1. עזים ומתנגד את העכבר עם 0.8% קלוראל-הידרייט באמצעות הזרקה בקרום הבטן.
  2. השתמש מספריים הפעלה כדי לערוף את החיה.
  3. לחשוף את הגולגולת באמצעות מספריים איריס לעשות חתך בעור של הראש.
  4. שימוש הפעלה מספריים כדי לגזור את החלק הפנימי. של העצם הקדמית.
  5. השימוש איריס מספריים לחתוך את הגולגולת לאורך התפר המשונן.
  6. השתמש rongeur של עצם לדחוף הצידה את הקדמית ואת עצם הקודקוד ולחשוף את המוח.
  7. השתמש איריס מלקחיים לנתח את המוח.
  8. להשתמש בעכבר המוח מטריצה סכיני גילוח כדי לקבל פרוסות הילתית 2 מ מ.
  9. מכתים את פרוסות המוח 10 דקות ב 37 ° C עם 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) ב 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח.
  10. לשטוף את המוח 2 x עם 10% פורמלין.
  11. לתקן את המוח בפורמלין 10% בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה.

3. מדידה של גודל לאוטם

  1. לארגן את הסעיפים בשקופית פלסטיק נקי, אוריינט את הסעיפים מ rostral כדי סימטרית.
  2. סרוק את השקופית באמצעות סורק. הנח סרגל מטרי וודא כי היא מופיעה התמונה הסרוקה. נהפוך את השקופית ולסרוק לצד ההפוך.
  3. לחשב את השטח אוטם של כל מקטע באמצעות תוכנת ImageJ.
    1. לפתוח את קובץ התמונה ולהגדיר את קנה המידה של התמונה.
    2. השתמש ביד חופשית הבחירה כדי לבחור את האזור לאוטם.
    3. השתמש את האזורים של מנהל ריבית (ROI) כדי למדוד את השטח של עניין.
  4. לסכם את האזורים אוטם עבור כל מקטע, הכפל את התוצאה בהעובי מקטע כדי להעריך את אמצעי האחסון הכולל אוטם.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש GraphPad מנסרה 6 כדי לקבוע את מובהקות סטטיסטית עם הסטודנט t-מבחן.
    הערה: קווי השגיאה על מגרפים מייצגים לשגיאות תקן של הממוצע (SEMs).
  2. שימוש G * 3.1 כוח לחשב את גודל המדגם המתאים ולבצע ניתוח כוח10.

תוצאות

הליך MCAO/פגיעה reperfusion המיוצר לאוטם בקליפת המוח באזור MCA נכון וגרם גרעון התנהגותית. דרגות שונות של איסכמיה-induced לאוטם נפח (איור 1 א'ב') ואובדן עצביים (איור 1CD) נוצרו בקליפת של האזור MCA נכון דרך עלייה משך מצדו. הפציעה הזאת MCAO/פגיע...

Discussion

המודל העכבר MCAO/פגיעה reperfusion הוא במודל חיה בדרך כלל המועסקים לחקות איסכמיה ארעי אצל בני אדם. מודל זה בעל חיים ניתן להחיל העכברים הטרנסגניים ו נוקאאוט זנים לחקור הפתופיזיולוגיה של שבץ. מספר צעדים בפרוטוקול הם קריטיים במיוחד. (1) microdrill, אליו חייב לשמש בזהירות בעת יצירת חור בגולגולת, עם פעולה לא ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן (ביותר 106-2320-B-038-024, רוב 105-2221-E-038-007-MY3 ו ביותר 104-2320-B-424-001) בית החולים האוניברסיטאי הרפואי טייפה (107TMUH-SP-01). כתב יד זה נערך על-ידי עריכה אקדמית וואלאס.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bone rongeurDienerFriedman
BuprenorphineSigmaB-044
CefazolinSigma1097603
Chloral hydrateSigmaC8383
Dissection microscopeNikonSMZ-745
Electric clippersPetpro
10% formalinSigmaF5304
Germinator dry bead sterilizerBraintree Scientific
Iris ForcepsKarl Klappenecker10 cm
Iris ScissorsDiener9 cm
Iris Scissors STRKarl Klappenecker11 cm
MicrodrillStoeltingFOREEDOM K.1070
Micro-scissors-VannasHEISSH-4240blade 7mm, 8 cm
Mouse brain matrixWorld Precision Instruments
Non-invasive blood pressure systemMuromachiMK-2000ST
Operating Scissors STRKarl Klappenecker14 cm
Physiological Monitoring SystemHarvard Apparatus
Razor bladesEver-Ready
Stoelting Rodent WarmersStoelting53810Heating pad
Suture clipStoelting
TweezersIDEALTEKNo.3
Vetbond3M15672Surgical glue
10-0 sutureUNIKNT0410
2,3,5-Triphenyltetrazolium chlorideSigmaT8877

References

  1. Woodruff, T. M., et al. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).
  2. Chamorro, A., et al. The immunology of acute stroke. Nature Reviews. Neurology. 8 (7), 401-410 (2012).
  3. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - Middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. (47), e2423 (2011).
  4. Lee, G. A., et al. Interleukin 15 blockade protects the brain from cerebral ischemia-reperfusion injury. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 562-570 (2018).
  5. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13 (4), 683-692 (1993).
  6. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 18 (5), 570-579 (1998).
  7. Wellons, J. C., et al. A comparison of strain-related susceptibility in two murine recovery models of global cerebral ischemia. Brain Research. 868 (1), 14-21 (2000).
  8. Doyle, K. P., Fathali, N., Siddiqui, M. R., Buckwalter, M. S. Distal hypoxic stroke: a new mouse model of stroke with high throughput, low variability and a quantifiable functional deficit. Journal of Neuroscience Methods. 207 (1), 31-40 (2012).
  9. Doyle, K. P., Buckwalter, M. S. A mouse model of permanent focal ischemia: Distal middle cerebral artery occlusion. Methods in Molecular Biology. , 103-110 (2014).
  10. Wayman, C., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. Journal Of Visualized Experiments. (108), e53106 (2016).
  11. Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neuroscience Letters. 349 (2), 130-132 (2003).
  12. Florian, B., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neuroscience Letters. 438 (2), 180-185 (2008).
  13. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), 396-409 (2005).
  14. Lin, T. N., Te, J., Huang, H. C., Chi, S. I., Hsu, C. Y. Prolongation and enhancement of postischemic c-fos expression after fasting. Stroke. 28 (2), 412-418 (1997).
  15. Glazier, S. S., O'Rourke, D. M., Graham, D. I., Welsh, F. A. Induction of ischemic tolerance following brief focal ischemia in rat brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 14 (4), 545-553 (1994).
  16. Tachibana, M., et al. Early Reperfusion After Brain Ischemia Has Beneficial Effects Beyond Rescuing Neurons. Stroke. 48 (8), 2222-2230 (2017).
  17. Gan, Y., et al. Ischemic neurons recruit natural killer cells that accelerate brain infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2704-2709 (2014).
  18. Li, M., et al. Astrocyte-derived interleukin-15 exacerbates ischemic brain injury via propagation of cellular immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), E396-E405 (2017).
  19. Wang, S., Zhang, H., Dai, X., Sealock, R., Faber, J. E. Genetic architecture underlying variation in extent and remodeling of the collateral circulation. Circulation Research. 107 (4), (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145reperfusion235 triphenyltetrazolium assayImageJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved