JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד הפתופיזיולוגיה של רטינופתיה סוכרתית proliferative באמצעות רקמות החולה נגזר, טוחנות בניתוח, fibrovascular לתרבות vivo לשעבר ואפיון רקמות יליד תלת מימדי. Ex-vivo תרבות דגם זה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.

Abstract

רטינופתיה סוכרתית (ד ר) microvascular. הסיבוך הנפוץ ביותר של מחלת הסוכרת, אחד המובילים גורמת לעיוורון אצל מבוגרים בגיל העבודה. אין מודלים בבעלי חיים הנוכחי של סוכרת, רטינופתיה חמצן-induced לפתח את השינויים מתקדמת טווח מלא בא לידי ביטוי אנושי proliferative רטינופתיה סוכרתית (PDR). לכן, הבנה של המחלה פתוגנזה ו פתופסיולוגיה הסתמכה בעיקר על השימוש של מקטעים היסטולוגית ודוגמאות בזגוגית, גישות מספקים רק מידע מצב יציב על הגורמים פתוגניים המעורבים. הוכחה גוברת מציין כי התא דינמי-תא ואינטראקציות מטריצה חוץ-תאית תא (ECM) בהקשר של תלת מימד (3D) microenvironments הם חיוניים עבור המחקרים מכניסטית ופונקציונליים לקראת הפיתוח חדש אסטרטגיות טיפול. לכן, שיערנו כי יכול להיות מנוצל הרקמה fibrovascular פתולוגית טוחנות בניתוח עיניים עם PDR לפענח בצורה אמינה את המנגנונים תאית ומולקולרית של המחלה ההרסנית הזאת, כדי לבחון את פוטנציאל קליני רומן התערבויות. למטרה זאת, פיתחנו שיטה עבור תלת-ממד ex-vivo תרבות של טוחנות בניתוח החולה נגזר fibrovascular רקמה (FT), אשר ישמש מודל הרלוונטיים של פתופסיולוגיה PDR האנושי. FTs ביתר explants, בתוך מטריצת פיברין ex-vivo אפיון תרבות ותלת מימד. Immunofluorescence כולה-הר של FTs יליד ותרבויות מובילים מאפשר חקירה יסודית של רקמת חיבור ותהליכים multicellular, הדגשת חשיבות האפיון רקמות ברמת תלת-ממד עבור חשיפת התכונות הרלוונטיות של פתופסיולוגיה PDR. מודל זה יאפשר את ההערכה סימולטני של המנגנונים המולקולריים, תהליכים סלולרי/רקמות ותגובות לטיפול בהקשר מורכבים של אינטראקציות הביוכימי ופיזית דינאמיים בתוך PDR רקמות אדריכלות, microenvironment. מאז מודל זה recapitulates PDR פתופיזיולוגיה, זה יהיה גם לשכנוע בדיקה או לפתח טיפולים חדשים.

Introduction

ד ר הוא סיבוך עינית רציני של סוכרת, מחלה אשר הגיעה לממדים עצומים בשלושת העשורים האחרונים1. עשרים שנה אחרי האבחנה, כמעט בכל חולה עם סוכרת מסוג 1 ו- 60% של חולים עם סוג 2 סוכרת סימנים הנוכחי של רטינופתיה, הפיכת סוכרת כשלעצמה אחד המובילים גורמת לעיוורון בקרב עובדים מבוגרים גיל2. בהתאם לרמה של ניוון microvascular נזק איסכמי, מסווגים ד ר ד ר לא שגשוג (הלא-PDR) ואת ד ר המקדימות (PDR). המחלה בשלב הסופי, PDR, מאופיין כורוידאלית איסכמיה - ו דלקת-induced ותגובות שהותירה את הממשק vitreoretinal. בתנאי שלא טופלו, תהליכים אלה תוביל לעיוורון עקב דימום בזגוגית, פיברוזיס ברשתית, tractional הרשתיות ו- neovascular גלאוקומה3,4. למרות ההתקדמות, אפשרויות הטיפול הנוכחי התמקד רק ד ר בשלבים, כולל בצקת מקולרית סוכרתית ו- PDR, כאשר ברשתית יש כבר התפתח. יתר על כן, שיעור גדול של חולים ד ר לא תועלת armamentarium הטיפול הנוכחי, המציין צורך דחוף טיפולים משופרים4,5,6.

מרובות אניn vivo מחלות התפתחותיות מודלים אחרים, מודלים בעלי חיים סוכרתיים פותחו עד כה, אך אף אחד מהם לא recapitulates בטווח המלא של תכונות פיפטות שנצפו. PDR האנושי7,8. יתר על כן, הוכחה גוברת מציין כי הטיפול תגובות מחוברים בחוזקה את ההרכב ECM כמו גם סידור מרחבי ואינטראקציה בין הסלולר, acellular microenvironment9. לפיכך, אנו, פיתוח מודל הרלוונטית קלינית של PDR האנושי על-ידי ניצול החומר פתולוגיים מטרים הוא בדרך כלל טוחנות מעיני העוברים vitrectomy כחלק הנהלת PDR10כירורגי.

כתב יד זה מתאר הפרוטוקול עבור 3D ex-vivo תרבות, אפיון ניתוח-טוחנות, PDR החולה נגזר מטרים פתולוגי. השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש בפרסום האחרונות הראו דקונסטרוקציה מוצלחת של הנוף רקמות PDR 3D מקורי, החוק הביוגנטי מהתכונות של פתופסיולוגיה PDR כולל האנגיוגנזה ותגובות שהותירה של פרובי מבנים וסקולרית11. מודל זה התגלה גם תכונות רומן לא יכול להיות בקלות מוערכת ממקטעים היסטולוגית דק, כגון במרחב מוגבל אפופטוזיס, התפשטות, כמו גם היווצרות כלי דם איון11. נוזל בזגוגית כבר בשימוש בהצלחה על תרבויות ספרואיד אנדותל תלת-ממד כדי להעריך שלה האנגיוגנזה פוטנציאליים והיעילות של מולקולות angiostatic12על ידי אחרים. בשילוב עם במבחנה 3D תא אנדותל הלימפה (לץ) ספרואיד הלבלוב assay באמצעות PDR הזגוגיות כמו ממריץ, המודל שלנו חשף שהתרומה של שני vitreal מסיסים גורמים כמו גם מקומיים כמו רמזים בתוך רקמת neovascular כדי כמו עדיין ממעטים להבין לץ מעורבות PDR פתופסיולוגיה3,11. ניהול של PDR, ניתוח vitreoretinal הוא הליך שגרתי שבוצעו עדיין מאתגרת. כפי instrumentations כירורגית וטכניקות רואים התקדמות רציפה ותחכום, הסרה שמרנית ובמועד של הדגימה proliferative fibrovascular לא רק משפר את החזון התוצאה, אלא גם מספק חומר רקמות שלא יסולא בפז חקירת PDR תגובות פתופיזיולוגיה וטיפול בהיבטים translational מורכבים של microenvironment רקמה אנושית חיה.

Protocol

מחקר זה אושרה על ידי הועד המוסדי והוועדה האתית של בית החולים של אוניברסיטת הלסינקי. חתום מדעת היה המתקבלים לכל מטופל.

1. הכנת פתרונות, מדיה וציוד

  1. להכין את הציוד הבא: לפני אוסף של הרקמה fibrovascular (FT) כדי להבטיח עיבוד מהיר.
    1. סטרילי-החיטוי שני microdissection פינצטה.
    2. להכין 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על ידי המסת 1 מראש שנשקל PBS טבליה (0.14 M NaCl, אשלגן כלורי, מ' 0.010 פו4-3מ' 0.0027) ב- 900 מ של מים יונים ומערבבים להתמוסס. התאם את עוצמת המים עד 1 L וסטריליים-החיטוי הפתרון מוכן. החנות RT.
    3. אסוף את הפתרון שהוזכרו לעיל וציוד בסל, יחד עם אזמל חד-פעמי סטרילי, לצלחת תרבות עקרה תא 6 ס מ, חמש צלחות תרבות עקרה תא 12-. טוב.
  2. להכין 6 מ"ג/מ"ל פיברינוגן פתרון ב הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) על ידי המסת 30 מ"ג של plasminogen מדולדל פיברינוגן אנושי לתוך 5 מ של HBSS, באמצעות שפופרת 50 מ ל שקוע לתוך אמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס, במשך לפחות שעה.
    הערה: פתרון זה יכול להישמר באמבט מים (37 ° C) במשך 7 שעות (מקסימום 10 h) לפני השימוש.
  3. להכין את האקס vivo בינוני תרבות על-ידי הוספת סרום עגל העוברי 5% (FCS) או בנסיוב אדם 5%, 0.4% תא אנדותל הצמיחה תוספת, 10 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס, הידרוקורטיזון μg/mL 1 ו- 50 gentamycin μg/mL כדי זמינים מסחרית מדיום הגידול תא אנדותל ולשמור באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עד השימוש. לאחסן ב 4 ° C עבור עד חודש.

2. fibrovascular רקמות לנתיחה

  1. לאסוף את הרקמה fibrovascular (FT) כי יש כבר חתכתם ניסויים שעברו ניתוח טרנס-conjunctival microincision vitreoretinal, על-ידי 23 או 20 מד 3 יציאות pars plana vitrectomy כחלק vitreoretinal כירורגית הנהלת PDR.
    הערה: רגל הוא טוחנות באמצעות פילוח ו- delamination, לחתוך אם צורך עם microscissors, להסיר חלל בזגוגית עם microforceps מרתק-סוף תוך-עיני על ידי מנתח מנוסה vitreoretinal. נקטו זהירות צריך לנקוט כדי להסיר ללא פגע, ניזוק FT ללא גרימת נזק למבנים עינית כולל את עצב הראייה או טמפורלית ארקייד כלי הדם שבו הרקמה neovascular פתולוגיים ממוקם בדרך כלל. הגודל של רקמת נכרת הוא משתנה, בדרך כלל הנעים בין 3 ו 50 מ מ2.
  2. לשמור את רגל 6 ס מ תא תרבות מאכל או 1.5 mL שפופרת המכילה 1 מ"ל של PBS סטרילי המוטלות על קרח רטוב, ולהעביר אותו מיד מחקר מעבדה לעיבוד.
    הערה: זה חיוני כי יחידת המחקר (מתקני המעבדה) קרובים פיזית מחדר ניתוח בבית החולים (או אר) כדי למזער את זמני ההעברה של רגל נכרת קטן. במקרה זה ההעברה לוקח פחות מ-5 דקות, explants מוטבעות בתוך פיברין בדרך כלל 1-1.5 h (מקסימום 2 h) לאחר הסרה כירורגית. ההשפעה של זמני ההעברה יותר על התרבות תלת-ממד יצטרך להיבדק.
  3. הכנס את רגל לצלחת תרבות 6 ס מ תא המכיל 1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר (RT, 25 ° C), לרכוש תמונות של הרקמה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוכה עם מטרה 5 x.
    הערה: תמונות נרכשים עבור הערכה איכותני ותיעוד. זה יהיה ניתן לצפות את גודל רקמות, צפיפות ואת כללי הקומפוזיציה (למשל, מבני כלי הדם).
  4. חותכים רגל ~ 1 מ מ2 חתיכות תחת stereomicroscope לנתיחה זקוף, בעזרת פינצטה סטרילי אזמל, microdissection. . תחזיק את הרקמה, ובכן שקועים הציבורית, במקום באמצעות פינצטה microdissection, ולבצע חתכים ברור באמצעות אזמל סטרילי. הימנע קורע FT, כמו זה. תתאים את המבנים fibrovascular מקורי.
  5. מקם כל חתיכה בודדים לבאר של צלחת תרבות 12-ובכן התא המכיל 1 מ"ל של PBS סטרילי.
    הערה: אם יש צורך, בעדינות להפיץ את רגל לצלחת, באמצעות פינצטה microdissection, לפני ביצוע חתכים.

3. יציקה פיברין זקוף ג'ל טיפות אפיון מטרים יליד והתרבות לשעבר Vivo

  1. סטרילי-מסנן הפתרון פיברינוגן מוכן מוכן בשלב 1.2 עם מסנן μm 0.22 רכוב לתוך מזרק 10 מ"ל.
  2. הכן aliquots של פיברינוגן פתרון (25 μL למחזור 1.5 מ ל), תתמיד הכן RT. aliquot עבור פיברין ג'ל / כל חתיכה מטרים שהושג לאחר הקרע, זוג aliquots נוספת לבדיקה של פיברין ג'ל היווצרות.
  3. הכן פתרון של HBSS המכילה 4 יחידות/mL של תרומבין, 400 μg/mL של aprotinin, שנקרא פתרון מכאן והלאה TA, שתמשיכו RT. להכין כמה שיותר פתרון ת א לפי הצורך, בהתאם למספר חתיכות שהושג לאחר ניתוח (25 μL של ת א פתרון משמש עבור כל אחד FT/fibrin ג'ל), ואת סכום נוסף (למשל, 250 μL) עבור בדיקות היווצרות ג'ל פיברין ולהבטיח כי מספיק פתרון זמין ברחבי הליהוק של טיפות ג'ל פיברין.
    הערה: תרומבין נדרש פיברין הפילמור בזמן aprotinin נוספת כדי למנוע השפלה של הג'ל פיברין על ידי פרוטאזות הסלולר לידי FTs13,14.
  4. מבחן העיתוי של פיברין ג'ל היווצרות: להוסיף μL 25 ת א לפתרון הפתרון פיברינוגן 25 μL aliquoted מוכן בשלב 3.2, באמצעות פיפטה אחר מוגדר 50 μL, לערבב בצינור על-ידי pipetting, לוותר על תוך תבשיל התרבות של תאים 6 ס מ , ויוצרים של droplet זקוף.
    הערה: היווצרות ג'ל פיברין צריך להתבצע ~ 1 דקות. אם זה לוקח יותר מ 1.5 דקות, הריכוז של תרומבין בפתרון ת א מוכן בשלב 3.3 יכול להיות מוגברת על ידי הוספת פתרון מלאי נוסף של תרומבין. עשירית של הכרך בתחילה בשימוש של תרומבין פתרון מניות ניתן להוסיף, שוב ושוב, עד היווצרות ג'ל פיברין מתבצע בתוך דקות 1.5. הזמן של פיברין ג'ל היווצרות הוא קריטי עבור שלוש-ממדיות של התרבות, כמו ג'ל מהירה היווצרות (במרחק 1.5 דקות) מונע את החתיכה מטרים מן לשקוע לקרקעית של הג'ל פיברין, ובכך בא במגע עם משטח הפלסטיק 2D של התא צלחת תרבות, אשר יכול להוביל אדהזיה תא 2D ותוצר.
  5. המקום מטר אחד פיסת במרכז אחד טוב של צלחת 24-ובכן באמצעות פינצטה סטרילי ולהסיר כל PBS עודף על-ידי pipetting עם פיפטה μL 0.5-10 כדי להימנע כוח היניקה רגל. במקרה שהרקמה ומודבקת פינצטה, להשתמש עם פינצטה נוספים כדי לסייע את המיקום של פיסת רקמה על הצלחת.
    הערה: ג'לים מטרים/פיברין גם ניתן לצקת בצלחת 48-טוב כדי להפחית את השימוש של נוגדנים. עם זאת, זה יותר מאתגר כפי הרווח מוגבל יותר ויופצו פיברין, אם הוא בא במגע עם הקיר היטב.
  6. להוסיף 25 μL של פתרון ת א 25 μL פיברינוגן הפתרון aliquoted בשלב 3.2, ולהגדיר באמצעות פיפטה עוד 50 מיקס μL בצינור על-ידי pipetting. לוותר על היצירה מטרים מניחים על הצלחת, ובכן, פיפטה לאורך 2 - 3 פעמים על מנת לכלול את החתיכה מטרים בתוך ה-droplet זקוף, מתן מטריצה תלת-ממדיים המקיפים רגל.
    הערה: ודא כי רגל לא aspirated במהלך pipetting כי אין בועות אוויר נוצרות. ודא גם כי ערבוב, היתר, pipetting מבוצעות במהירות כמו הג'ל פיברין יהוו בתוך 1.5 דק ', כפי שנבדקו בשלב 3.4. אם השלכת פיברין ג'לים בצלחת 48-ובכן, השתמש במקום זאת 20 μL של פתרון פיברינוגן וμl 20 ת א פתרון.
  7. חזור על הצעדים 3.5, 3.6 כל החלקים מטרים.
  8. לאפשר את ג'לים פיברין שבמהלכו מאת המקננת הצלחות בסדרה חממה התרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified עם 5% CO2.
  9. לאחר 0.5-1 h, בדוק כי הג'ל פיברין נוצר לחלוטין על ידי בקפידה הטיית הלוח. המשך לשלב 3.10 כאשר הג'ל לא זזה כאשר מטים את הצלחת, המציינת כי היווצרות ג'ל פיברין מלאה.
  10. מכסים את רגל/פיברין ג'לים עם ex-vivo תרבות בינוני (600 μL/טוב בצלחת. ובכן 24) או 300 μL טוב בצלחת. ובכן 48 בתוספת 100 aprotinin μg/mL. Pipette של המדיום בעדינות על ידי היתר drop-wise.
    הערה: כאן, aprotinin משמש כדי למנוע השפלה של הג'ל פיברין פרוטאזות הסלולר לידי FTs13,14. Ex-vivo תרבות בינוני בנוסף ניתן להשלים עם גורמי גדילה רקומביננטי, כגון VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (ראה טבלה של חומרים)11.
  11. מקם את רגל ex-vivo תרבות צלחת בחזרה לתוך 37 ° C, 5% CO2 תא תרבות חממה ותרבות עבור תקופת הזמן הרצוי (למשל, 2 - 18 ימים, תרבות יותר תקופות תצטרך להיבדק). להחליף 50% של המדיום טריים ex-vivo תרבות בינוני כל שלושה ימים.

4. "במטריצת" הדמיה

  1. לרכוש תמונות של רגל ex-vivo תרבויות באותו יום (יום 0), במרווחי זמן קבועים (למשל, כל יום אחר), באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוך, על מנת לעקוב אחר הגידול תלת-ממד.
    הערה: התמונות שהתקבלו יכול לשמש עבור כימות של תוצר מטרים כמו האורך הכולל של שני קטרים בניצב מעבר explant11.

5. יליד מטרים ונקודת תרבות Vivo לשעבר

הערה: ג'לים מטרים/פיברין שניתן תרבותי שמחוץ לתקופת הזמן הרצוי (רגל ex-vivo תרבויות) או קבוע באותו יום (יליד FT) עבור מטרים יליד אפיון11.

  1. לתקן את רגל מקורית או את רגל ex-vivo תרבויות על-ידי החלפת המדיום תרבות 1 מ"ל/טוב של 4% paraformaldehyde בפתרון PBS, עבור h 1-RT. עבור ג'ל מטרים/פיברין מקורית, לתקן 0.5-1 h לאחר תוספת של האקס vivo תרבות בינוני (אם יש לא ספוג של ג'לים פיברין בינוני, קיבוע יפגע להם).
    הערה: לבצע שלב זה בשכונה fume כמו paraformaldehyde הוא מאכל, רעילים ומסרטנים.
  2. לשטוף את ג'לים מטרים/פיברין עם שלושה שוטף 5 דקות ב- PBS (2 מ ל/טוב).
  3. להחליף את PBS עם 2 מ"ל/טוב ל- PBS המכיל אזיד הנתרן 0.02% ולאחסן את ג'לים פיברין קבוע ב 4 ° C עד עיבוד נוסף. חותם הצלחות עם הסרט פרפין על מנת להבטיח ג'לים מטרים/פיברין לא לייבש באחסון.
    הערה: ביצוע שלב זה בשכונה fume כמו אזיד הנתרן הוא רעיל.

6. כולה-הר Immunofluorescence מכתים

הערה: פרוטוקול זה נמשך 5 ימים, יכול להיות מופרע עם incubations לילה במקומות המסומנים. אל תתנו את פיברין ג'לים יבש בכל נקודה. כל השלבים מתבצעים ב- RT, אלא אם צוין אחרת.

  1. הכינו את הפתרונות הבאים לפני תחילת פרוטוקול מוכתמים.
    1. קיבוע שאחרי פתרון: להכין 50: 50 אצטון: מתנול פתרון על ידי ערבוב כמויות שוות של אצטון מתנול (למשל, 50 מ ל). חנות ב-20 ° C. להכין פתרון זה האחרון ביום שלפני ההכתמה. פתרון זה ניתן לאחסן חזרה ב-20 ° C, ניתן להשתמש עבור stainings הבאים.
      הערה: להכין פתרון זה בשכונה fume כמו אצטון, מתנול דליק, מסוכנים לבריאות.
    2. חסימת פתרון: להכין 15% עוברית שור נסיוב (FBS), 0.3% תמצית פנול ethoxylate פתרון ב- PBS מאת הראשון-הוספת 15% FBS כדי PBS. להוסיף תמצית פנול ethoxylate ומערבבים להתמוסס. חנות ב 4 º C.
      הערה: פתרון זה ניתן להכין כמות גדולה מראש, המאוחסן ב- 15 מ"ל aliquotes ב-20 ° C, הקרת לפני השימוש, ביום כאשר מופעל פרוטוקול מוכתמים. השתמש aliquote טריות או טרי המופשרים עבור כל פרוטוקול מוכתמים.
    3. שטיפת פתרון: להכין 1 ליטר ל- PBS בתוספת 0.45% תמצית פנול ethoxylate על-ידי הוספת 4.5 מ ל תמצית פנול ethoxylate מ 995.5 ל- PBS. מערבבים כדי להמיס. החנות RT.
  2. הרם את טיפות בקפידה מהצלחת באמצעות מרית עם קצוות כיכר פלדת אל-חלד. ניתוק ה-droplet קודם מהקצוות לפני הרמת המרכז ולאחר להעביר טוב של 12-ובכן צלחת המכיל 1 מ"ל ל- PBS.
    הערה: לבצע קיבוע שאחרי, שוטף והשלבים חסימה בתבנית זו צלחת.
  3. פוסט-לתקן את טיפות עם 1 מ"ל של 50: 50 קר כקרח פתרון אצטון: מתנול עבור מין ~ 1 (גבול טיפות יהפוך לבן).
    הערה: לבצע שלב זה בשכונה fume כמו אצטון, מתנול הם מסוכנים לבריאות.
  4. לשטוף עם 3-5 מנקי ב 2 מ"ל ל- PBS (טיפות תטבע בפתרון PBS השלמת התייבשות).
    הערה: להימנע מלגעת את טיפות עם קצה פיפטה, כמו לאחר קיבוע שאחרי, שהם נדבקים לפלסטיק. לאורך כל הפרוטוקול, להימנע נוגדן שלאחר תיקון, שואבת, חסימת ושטיפת פתרונות ביניקה, כמו זה עלול לגרום נזק או להשמיד לחלוטין את טיפות. במקום זאת, להטות את הצלחת, הסר בזהירות פתרונות באמצעות פיפטה μL 500-5000.
  5. Centrifuge הפתרון חסימה למשך 15 דקות על 21,000-g ו- 4 ° C כדי להסיר את הלכלוך.
    הערה: הפתרון יכול להיות aliquoted 1.5 mL צינורות עבור צנטריפוגה. הפתרון שאינם בשימוש ניתן להיות מאוחסנים ב 4 ° C, המשמש עבור כל השלבים הבאים הרלוונטיים.
  6. דגירה את טיפות ב- 500 μL חוסם פתרון 2 h-RT.
    הערה: כדי להפחית את עוצמת הקול של חסימת פתרון בשימוש, הצלחת יכול להיות מוטה על תמיכה, ניתן להשתמש μL קטנה כמו 300 של פתרון/רביב.
  7. להכין לתערובת נוגדן ראשוני (לפחות 30 μL/רביב)-דילול המתאים בחסימה פתרון וצנטריפוגה עבור 15 דקות ב 21,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  8. להעביר את טיפות לתוך עגול (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן באמצעות מרית עם קצוות עגול, דגירה לפחות 30 μL droplet של תערובת נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 º C.
  9. למחרת, העברת טיפות לבאר-12 צלחת המכילה 2 מ"ל לרחוץ את הפתרון/טוב, שטיפה עם 5 שלוש דקות שוטף הראשון ולאחר מכן עם שוטף 30 תשע דקות. להשאיר בכביסה האחרונה (2 מ"ל) בן לילה ב 4 º C.
  10. למחרת, לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולהעביר את טיפות לתוך עגול (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן.
  11. במהלך מנקי, להכין לתערובת נוגדנים משניים fluorophore מצומדת המתאים (שבערך מדולל, μL לפחות 30/רביב) בחסימה פתרון וצנטריפוגה למשך 15 דקות על 21,000-g ו- 4 מעלות צלזיוס.
  12. להעביר את טיפות לתוך סיבוב (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן באמצעות מרית עם קצוות עגול, דגירה לפחות 30 μL של תערובת נוגדנים משניים, במשך 4 שעות ב- RT, מוגן מפני אור.
    הערה: לבצע כל incubations הבאים והשלבים כביסה מוגן מפני אור.
  13. להעביר את טיפות לתוך צלחת 12-ובכן המכיל 2 מ"ל של כביסה פתרון/טוב בעזרת מרית עם קצוות עגול, שטיפה עם שלושה שוטף 5 דקות קודם ואחר כך עם ארבעה שוטף 30 דקות. להשאיר בכביסה האחרונה (2 מ"ל) בן לילה ב 4 º C.
  14. למחרת היום, יש לשטוף את ג'ל עם חמש שוטף 30 דקות, ואז שלוש פעמים עם PBS. להשאיר בכביסה האחרונה (2 מ"ל) בן לילה ב 4 º C.
  15. למחרת, להעביר את טיפות לתוך סיבוב (U)-בתחתית צלחת 96-ובכן באמצעות עם קצה עגול, מרית counterstain גרעינים המקננת עם 10 μg/mL הכסט גרעינית (לפחות 30 μL/רביב) במשך 30 דקות ב- RT.
    הערה: הרכבה בינונית בתוספת 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) עבור גרעינים counterstaining לחילופין ניתן להשתמש. בכל מקרה, זה צעד וצעד 6.16 מושמטים, ממשיך ישירות אל שלב 6.17.
  16. להעביר את טיפות לתוך צלחת 12-ובכן המכיל 2 מ של PBS/טוב בעזרת מרית עם קצוות סיבוב ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  17. טען את טיפות על גבי שקופיות מיקרוסקופ כדלקמן:
    1. למרוח שכבה צרה של הקשחת מהיר הרכבה בינונית בקצוות של coverglass מרובע בצורת 22 מ"מ x 22 מ"מ ותנו יבש ~ 1 דקה. לבצע שלב זה עבור כל טיפה בנפרד, כדי להימנע התקשות מוגזמת של המדיום הרכבה.
      הערה: ביצוע שלב זה בשכונה fume כמו המדיום הרכבה מהירה-התקשות הוא מסוכנים לבריאות.
    2. לשטוף את ה-droplet בטבילת בטוב של צלחת 12-ובכן המכיל 2 מיליליטר מים יונים והעבר לשקופית מיקרוסקופ, בעזרת מרית עם קצוות עגול. להסיר עודפי מים באמצעות חתיכה קטנה של נייר סופג.
    3. לוותר על μL 15 הרכבה antifade ללא הקשחת בינוני על גבי ה-droplet.
      הערה: לחלופין, אם לא נעשה שימוש הכסט גרעינית, הרכבה בינונית המכיל 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) יכול לשמש.
    4. בעדינות למקם את מכסה הזכוכית, עם המדיום הרכבה מהירה-הקשחה מול השקופית מיקרוסקופיים, על ה-droplet ואפשר להתפשר.
      הערה: המדיום הקשחת מהיר לדבוק השקופית מיקרוסקופיים, לשמור את ה-droplet במקום.
  18. חזור על צעד 6.17 כל טיפות. הר שתי טיפות בכל שקופית מיקרוסקופ.
  19. תן את השקופיות מילה נהדרת-RT עבור ~ 2 h ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא שהשקופיות הם מוצבים באופן אופקי מוגן מפני אור.
  20. התמונה הילידים מוכתם או שמגבלת מטרים ex-vivo תרבויות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או מיקרוסקופ epifluorescence זקוף מצויד עם פונקצית אופטים אופטי ו 20 x או 40 x אובייקטיבי. השתמש בפונקציה אריח כדי ללכוד אזור רחב יותר של רקמת בבת אחת.

תוצאות

הבנה עמוקה יותר של מאפייני הרקמה fibrovascular PDR וביטוי חלבונים הסתמכה בעיקר על דק היסטולוגית מטרים סעיפים3,15,16,17ודוגמאות בזגוגית. כדי לפתח שיטה מעמיקה של הארגון רקמות 3D והתהליכים physiopathological multicellular PDR, יצאנו...

Discussion

בהתחשב החשיבות של רקמות הרלוונטיים microenvironment עבור תוצאות מכניסטית מולקולרית ותא פונקציונלי אמין, זה הכרחי כדי למצוא גרסאות ניסיוניות המתאימות המספקים סביבה זו רקמה. המתוארים במסמך זה שמחוץ PDR תרבות המודל FTs פיברין-מוטבע מאפשר החקירה על מנגנוני PDR פתופסיולוגיה בהקשר מקורית, מורכבים ול...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים אסירי רשתית רפואי וכירורגי עמיתים, אחיות, כל הצוות של יחידת סוכרת, יחידת הניתוח Vitreoretinal מחלקת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי הלסינקי עבור המשתתפים באופן פעיל בלשכת הגיוס של חולים. אנו מודים Biomedicum יחידת הדמיה מולקולרית על מתקני הדמיה. אנו מודים זולטן צ'רניינקו לסיוע טכני מעולה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים האקדמיה של פינלנד (KL), אוניברסיטת הלסינקי (KL), סיגריד Juselius קרן (KL), קרן ג'והנסון אלבין ק' (KL), מכון הסרטן פינית (KL), קרולינסקה Institutet (KL), פינית העין קרן (SL), עין, קרן בנק רקמות (SL), מרי, קרן Ehrnrooth ג גאורג (SL) ו מענקי מחקר קליני HUCH (TYH2018127 לאחר TYH2016230, SL), לסוכרת (SL, KL, AK, למשל), כמו גם את תכנית הדוקטורט וההתערבות (למשל).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
MicroforcepsMedicon07.60.03Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - SterileSwann-Morton0513Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)Greiner Bio-One391-3210Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-wellGreiner Bio-One392-0049Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mLGreiner Bio-One391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mLGreiner Bio-One525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDFMilliporeSLGV033RSUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mLBraun4606108VUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLFisherFB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-wellNunc142475Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottomGreiner Bio-One392-0019Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless SteelVWR82027-528Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1Menzel/Fisher15727582Used for mounting
Microscope slidesFisherKindler K102Used for mounting
Absorbent paperVWR115-0202Used for mounting
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
PBS tabletsMedicago09-9400-100Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human PlasmaCalbiochem341578
Hanks Balanced Salt SolutionSigma-AldrichH9394-500MLUsed for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serumGibco10270106Used for preparing the blocking solution
Human SerumSigma-AldrichH4522Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/mlBiowestL0011-100
Endothelial cell media MV KitPromocellC-22120Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azideSigma-AldrichS2002Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
AcetoneSigma-Aldrich32201-2.5L-MUsed to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
MethanolSigma-Aldrich32213Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)Sigma-AldrichT9284Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mMLife Technologies62249For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting mediumSigma-Aldrich03989-100mlTOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powderSigma-AldrichT9549-500UN Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powderSigmaA3428Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
NameCompanyCatalog NumberComments
Growth factors
Recombinant human VEGFAR&D Systems293-VE-01050 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFCR&D Systems752-VC-025200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβMilliporeGF3461 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGFMillipore01-10650 ng/ mL final concentration
NameCompanyCatalog NumberComments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)DakoM0823Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)DakoM716501-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)DakoM070129-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68ImmunoWayRLM3161Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)Cell Signalling9664Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)DakoM731429-2Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAPDakoZ0334Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67Leica MicrosystemsNCL-Ki67pUsed at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1R&D SystemsAF2089Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2MilliporeAB5320Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1ReliaTech102-PA32Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1R&D SystemsAF2727Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)MilliporeMAB3757Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)SigmaC6198Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
NameCompanyCatalog NumberComments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgGInvitrogenA-11012Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgGThermo ScientificA-11057Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgGThermo ScientificA-11036Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgGMolecular ProbesA-21468Used at 1:500 dilution
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscopeZeissFor imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscopeOlympusFor FT dissection
LSM 780 confocal microscopeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with ApotomeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT

References

  1. Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
  2. Liew, G., Wong, V. W., Ho, I. V. Mini Review: Changes in the Incidence of and Progression to Proliferative and Sight-Threatening Diabetic Retinopathy Over the Last 30 Years. Ophthalmic Epidemiology. 24 (2), 73-80 (2017).
  3. Loukovaara, S., et al. Indications of lymphatic endothelial differentiation and endothelial progenitor cell activation in the pathology of proliferative diabetic retinopathy. Acta Ophthalmologica. 93 (6), 512-523 (2015).
  4. Stitt, A. W., et al. The progress in understanding and treatment of diabetic retinopathy. Progress in Retinal and Eye Research. 51, 156-186 (2016).
  5. Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies. JCI Insight. 2 (14), (2017).
  6. Gross, J. G., et al. Five-Year Outcomes of Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Ophthalmology. 136 (10), 1138-1148 (2018).
  7. Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Disease Models, Mechanisms. 5 (4), 444-456 (2012).
  8. Villacampa, P., Haurigot, V., Bosch, F. Proliferative retinopathies: animal models and therapeutic opportunities. Current Neurovascular Research. 12 (2), 189-198 (2015).
  9. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models, Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  10. Sharma, T., et al. Surgical treatment for diabetic vitreoretinal diseases: a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 44 (4), 340-354 (2016).
  11. Gucciardo, E., et al. The microenvironment of proliferative diabetic retinopathy supports lymphatic neovascularization. The Journal of Pathology. 245 (2), 172-185 (2018).
  12. Rezzola, S., et al. 3D endothelial cell spheroid/human vitreous humor assay for the characterization of anti-angiogenic inhibitors for the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Angiogenesis. 20 (4), 629-640 (2017).
  13. Pepper, M. S., Montesano, R., Mandriota, S. J., Orci, L., Vassalli, J. D. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis. Enzyme, Protein. 49 (1-3), 138-162 (1996).
  14. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). Journal of Cell Science. 115 (Pt 17), 3427-3438 (2002).
  15. Loukovaara, S., et al. Quantitative Proteomics Analysis of Vitreous Humor from Diabetic Retinopathy Patients. Journal of Proteome Research. 14 (12), 5131-5143 (2015).
  16. Abu El-Asrar, A. M., Struyf, S., Opdenakker, G., Van Damme, J., Geboes, K. Expression of stem cell factor/c-kit signaling pathway components in diabetic fibrovascular epiretinal membranes. Molecular Vision. 16, 1098-1107 (2010).
  17. Loukovaara, S., et al. Ang-2 upregulation correlates with increased levels of MMP-9, VEGF, EPO and TGFbeta1 in diabetic eyes undergoing vitrectomy. Acta Ophthalmologica. 91 (6), 531-539 (2013).
  18. Sugiyama, N., et al. EphA2 cleavage by MT1-MMP triggers single cancer cell invasion via homotypic cell repulsion. Journal of Cell Biology. 201 (3), 467-484 (2013).
  19. Tatti, O., et al. MMP16 Mediates a Proteolytic Switch to Promote Cell-Cell Adhesion, Collagen Alignment, and Lymphatic Invasion in Melanoma. Cancer Research. 75 (10), 2083-2094 (2015).
  20. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
  21. Senger, D. R. Molecular framework for angiogenesis: a complex web of interactions between extravasated plasma proteins and endothelial cell proteins induced by angiogenic cytokines. American Journal of Pathology. 149 (1), 1-7 (1996).
  22. Senger, D. R., Davis, G. E. Angiogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (8), a005090 (2011).
  23. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
  24. Marmorstein, A. D., Marmorstein, L. Y. The challenge of modeling macular degeneration in mice. Trends in Genetics. 23 (5), 225-231 (2007).
  25. Kim, L. A., et al. Characterization of cells from patient-derived fibrovascular membranes in proliferative diabetic retinopathy. Molecular Vision. 21, 673-687 (2015).
  26. Avery, R. L., et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology. 113 (10), e1691-e1615 (2006).
  27. Zhao, L. Q., Zhu, H., Zhao, P. Q., Hu, Y. Q. A systematic review and meta-analysis of clinical outcomes of vitrectomy with or without intravitreal bevacizumab pretreatment for severe diabetic retinopathy. The British Journal of Ophthalmology. 95 (9), 1216-1222 (2011).
  28. Carrion, B., Janson, I. A., Kong, Y. P., Putnam, A. J. A safe and efficient method to retrieve mesenchymal stem cells from three-dimensional fibrin gels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 20 (3), 252-263 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143fibrovascularproliferativeimmunofluorescencevitrectomyneovessel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved