JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.

Abstract

מחזורי, interstitial קטן מאוגד-ממברנה חוץ-תאית שלפוחית (EVs) מייצגים מטרות המבטיחים פיתוח מבחני הרומן סמן prognostic או אבחון, ולשמש סביר שחקנים חשובים ההתקדמות של ספקטרום עצום של מחלות. המחקר הנוכחי מתמקד אפיון שלפוחית מופרש מן התא מרובים, סוגי רקמות כדי להבין את התפקיד של EVs בפתוגנזה של תנאים לרבות הקשורים ניוון מוחיים, דלקת סרטן. עם זאת, באופן גלובלי עקבי וטכניקות לשחזור כדי לבודד ולטהר שלפוחית נשארים בתהליך. יתר על כן, שיטות לחילוץ של EVs של רקמה מוצק שמחוץ מתוארים בקושי. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחילוץ EVs קטן עניין רקמות שלם טרי או קפוא, כולל דגימות המוח ואת הגידול, על אפיון נוסף. נדגים את יכולת ההתאמה של שיטה זו עבור מספר ניתוחים במורד הזרם, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים, immunophenotypic אפיון של שלפוחית, כמו גם כמותיים ספקטרומטר מסה של חלבונים EV.

Introduction

שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EVs) כוללים endosomal, נגזר exosomes קטן שלפוחיות זעירות ממברנה-המחסן יש עניין הביו-רפואית רחבה. EVs קטנות המורכבות אוכלוסיה הטרוגנית של 50-250 ננומטר מאוגד-קרום שלפוחית המכילה חלבונים אקטיביות ליפידים, חומצות גרעין, כי הם האמינו קולקטיבי לשחק תפקידים חשובים שפע של תהליכי מחלה. קידום מחקר במיוחד בהפרות אלה שלפוחית ניווניות, הפרעות פריון, תהליכים זיהומיות, תנאי אוטואימוניות או דלקתיים, ואת הגידול, גרורה1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. במהירות גוברת המחקר הביו-רפואי לתוך המשמעות של EVs בפתוגנזה של המחלה יצר עניין מקבילים בפיתוח שיטות מחמירות הדירים בידוד ולטיהור שלפוחית אלה.

אתגר היסטוריים, ב- EV אפיון היה חוסר היכולת הפרדה מלאה subpopulations EV קטן. אתגר זה נובע במידה רבה הבנתנו המנגנונים המולקולריים שונות המסדירים את להן של שלפוחית ברורים מוגבלת. חופפים גודל, צפיפות מטען ביולוגיים בין subpopulations נוספות convolutes הבחנות אלו. חלק באתגר זה היה שימוש נרחב העשרה טכניקות שונות, מתן עקביות בניתוח במורד הזרם של שלפוחית מבודד מעבר מעבדות, ערעור מהמאמץ העולמי כדי להאיר קטגורית אוכלוסיות EV.

ראוי לציין כי הרוב המכריע של EV אפיון בוצעה מאוסף במבחנה של תרבית תאים supernatant, עם מחקרים מאוחרים יותר ויוו המתארת טכניקות כדי לבודד שלפוחית של נוזלי הגוף בעל חיים או אדם, לרבות פלזמה, שתן , ורוק. בעוד EVs נמצאים בכמויות גדולות במחזור, גם זיהה כי שלפוחית אלה תפקיד חשוב אירועי תקשורת לתא, נמצאים interstitium של רקמות הסלולר. בהקשר של סרטן, interstitial EVs עשוי להיות חשובה במיוחד להתכוונן microenvironment הגידול של תא סרטני זריעה, גידול גרורתי14,15. כתוצאה מכך, יש ערך לפיתוח, אופטימיזציה של טכניקות כדי לחלץ שלפוחית דגימות רקמה מוצק. שיטות אלה תספק אמצעי ללמוד ישירות איברים - או גידול נגזר EVs שנקטפו דגימות קליניים, כולל ביופסיות קטן כריתות איברים חלקיים או מלאים.

במחקר זה, בדו ח הקודם שפרסם שלנו מעבדה16, אנו שואפים כתובת מספר חששות הנוכחי העיקריים ב- EV העשרה מתודולוגיה: 1) כדי לתאר שיטה לשחזור כדי לבודד ולטהר EVs בסטנדרטים הגבוהים ביותר כיום מתקבלים בשדה; 2) כדי לנסות לבודד subpopulations EV קטן מאוד מועשר בנגזר endosomal exosomes; ו 3) כדי לספק פרוטוקול על החילוץ של שלפוחית אלה של דגימות רקמה מוצק לצורך אפיון נוסף.

לאחרונה, Kowal ועמיתיו תיאר הדרגתי צפיפות iodixanol בקנה מידה קטן יחסית כדי להפריד ולטהר subpopulations EV עם יעילות רבה יותר מאשר סוכרוז דומות צפיפות מעברי צבע17. במחקר מצוטט, דנדריטים, נגזר תא EVs בשבי שבריר צפיפות נמוכה יחסית, בקנה אחד עם צפיפות של 1.1 g/mL, היו מועשר מאוד בחלבונים endosomal האמין להיות הכי עקבי עם שיעור גבוה של exosomes נוכח בזה שבר. על פי המחברים, חלבונים אלה exosomal "בתום לב" כללה גידול הרגישות ג'ין 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 ו- חלבונים annexin מספר17. אחר כך התאמנו בטכניקה זו כדי להצליח בשיטה של דיסוציאציה רקמות מתוארת על ידי פרז גונזאלס ואח18 ו פרוטוקול עוקבות צנטריפוגה דיפרנציאלית לבודד כל הנגזרות המוח EVs16. אנחנו גם הפגינו השירות של שיטה זו של אפיון EV proteomes על-ידי שילוב פרוטוקול רציפים עבור במורד הזרם כמותיים ולמשפט השוואתי ספקטרומטר מסה של חלבון vesicular, שתואר קודם לכן על ידי המעבדה שלנו19. עבודה זו הוקרב זה מהמעבדה היל, שבו היו EVs מועשר מאזור הקליפה הקדמית של המוח20.

במחקר זה, אנו להרחיב על טכניקה זו, להרחיב את היישום של פרוטוקול שפורסם לאחרונה מן המעבדה שלנו את בידודה של EVs של גידולים מוצקים ריאות. לידע שלנו, זהו המחקר הראשון לתאר את פרוטוקול להעשיר EVs מ ex דגימות הגידול vivo. בהתחשב להתעניינות של EVs כמו הרומן אבחון סמנים ביולוגיים ותפקידם tumorigenesis, שיטה זו צפויה להוכיח ערך מספר גדל והולך של חוקרי מדעי. מבחינה קלינית, interstitial EVs יכול הנמל ערך אבחוני רב, בפרט דגימות איפה הערכה היסטולוגית היא מוגבלת. תקוותנו היא כי השיטה שמפורטות כאן תספק בסיס שיטה לשחזור לקצור EVs מטרי או קפוא בעלי חיים או אדם ניתוח דגימות, לסלול את הדרך לעבודה עתידית לחשוף התפקידים משמעותית בפתוגנזה של המחלה אלה קטן שלפוחית עשוי לשחק.

Protocol

כל המוח התקבלו עם אישור של שימוש חיה מוסדיים ו טיפול הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מדינת פלורידה. סכום כולל של 12 מוח העכבר (3 המוח של כל קבוצת גיל: 2, 4, 6, ו- 8 חודשים) מ- C57BL/6 J שימשו רקע עבור EV החילוץ, כפי שתואר לעיל16. ריאות הגידול דגימות נתרמו בנדיבות על ידי ד ר Mandip Sachdeva תחת אישור של פלורידה לחקלאות, IACUC אוניברסיטת מכני. גידולים ריאות נשאבו מתוך שורת תא אדנוקרצינומה האנושי H1975 גדלו ב עכברים עירום nu/nu Balb/c immunodeficient. נתוני הגידול נציג שתי משכפל מודגשים במחקר זה.

הערה: סקירה סכמטי של שיטת טיהור וניקוי בידוד שלפוחית מסופק באיור1.

1. רקמות דיסוציאציה, צנטריפוגה דיפרנציאלית

  1. הכינו 10 מיליליטר דיסוציאציה מאגר (10 מ"ג פפאין; 5.5 מ מ L-ציסטאין; 67 מיקרומטר מרקפטואתנול 1.1 מ מ EDTA) שינה-E בינוני לכל כ 0.4-1.0 g של רקמות. שים לב כי כל הפתרונות המשמש EV העשרה של טיהור צריך להיות מדולל במים מסוננים הנדסה גנטית.
  2. להוסיף רקמה שלם טרי או קפוא דיסוציאציה מאגר צינור חרוטי 50 מ ל, וכן דגירה במים חמים אמבט ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות רקמות יכול להיות לחתוך לחלקים קטנים לפני הדגירה במידת הצורך.
  3. בעקבות הדגירה, מוסיפים מעכבי פרוטאז, פוספטאז עבור ריכוז סופי 1 x למאגר דיסוציאציה המכיל את הרקמה.
  4. יוצקים את הפתרון המכיל את הרקמה לתוך מהמגן דאונס התאמה רופף, בעדינות מביצועם הרקמה באמצעות כ 30 קווים איטיים לדגימה. מספר קווים עשוי להיות מותאם בהתבסס על רקמות עקביות.
  5. העברת הפומבית רקמות במאגר צינור חרוטי 50 מ ל ו צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה את התאים ואת והשריד רקמה סיבית או מלוכדת.
  6. להעביר את תגובת שיקוע צינור חרוטי נקי 50 מ ל ו צנטריפוגה ב 2,000 x g 10 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה ולהשליך פסולת הסלולר גדול.
  7. להעביר את תגובת שיקוע שוב צינור חרוטי נקי 50 מ ל ו צנטריפוגה ב 10,000 x g למשך 40 דקות ב- 4 ° C עד הצניפה שלפוחית גדול רצויה או גופים מוות קטן.
    הערה: גלולה זו יכולים להיגאל עבור לימוד נוספים של שלפוחית גדול יותר במידת הצורך.
  8. Decant את תגובת שיקוע דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לתוך צינור ultracentrifugation מ ל 12 נקי.
    הערה: ייתכן דגימות רקמה בצפיפות שהותירה תור הודעות ' לא לסנן בקלות. הדוגמיות הללו ניתן לסנן דרך מסננת תא 40 µm ולאחר מכן עבר מחטים קטנות באופן סדרתי (18 גרם, 20 גרם, 22 גרם) לפני סינון דרך המסנן 0.45 מיקרומטר.
  9. Ultracentrifuge הדגימה ב x 100,000 g עבור 2 h-4 ° C עד הצניפה EVs קטן.
  10. Decant את תגובת שיקוע ולהשאיר את צינורות ultracentrifugation הפוכה למשך 5-10 דקות, הקשה לעיתים קרובות כדי להסיר שאריות נוזל בצדדים של צינורות. נוזל שיורית יכול גם להיות aspirated באמצעות פיפטה של ואקום שואבת.
  11. מחדש להשעות EV גלולה ב- 1.5 מ של 0.25 M סוכרוז מאגר (10 מ מ טריס, pH 7.4). חשוב להבטיח re-שיכוך מלא של בגדר בשלב זה. כדי לעשות זאת, לכסות את הצינורות עם מצלמות-מיקרוסקופים לפני vortexing EVs לתוך פתרון. רוק הצינורות ultracentrifuge למשך 15-20 דקות בטמפרטורת החדר לפני שילוב מערבולת הסופי.
  12. בקצרה centrifuge הצינורות-מהירות לא יותר מ- 1,000 x g לשחזר ההשעיה נוזלים בתחתית הצינורית.
  13. להמשיך בשלבים הדרגתיים טיהור שלהלן, או אם יש צורך, לאחסן EV ההשעיה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

2. צפיפות הדרגתיות טיהור

  1. להוסיף 1.5 מ של 60% iodixanol (מניות פתרון במים) למאגר סוכרוז/טריס 1.5 mL המכיל EVs כדי ליצור פתרון הסופי המכיל 30% iodixanol. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב פתרון ביסודיות. להיות זהיר כדי להימנע מאובדן פתרון בקצה פיפטה, כמו גם ריכוז גבוה iodixanol צמיגה למדי.
  2. העברת 30% iodixanol בופר המכילה EVs לחלק התחתון של צינור ultracentrifugation 5.5 mL.
  3. להכין לפחות 1.5 מ"ל של פתרונות iodixanol 20% ו-10% עבור דגימה במים הנדסה גנטית מהפתרון 60% iodixanol מניות.
  4. מודדים מ 1.3 ל 20% iodixanol ובזהירות שכבה על גבי השכבה התחתונה מעבר צבע באמצעות מזרק עם מחט 18 גרם. כדי למנוע ערבוב השכבות-הממשק צפיפות, לשמור על השיקוע של המחט בקשר עם החלק הפנימי של הצינור ultracentrifugation מעל מניסקוס ולהוסיף את הפתרון dropwise.
  5. שכבת 1.2 מ של 10% iodixanol פתרון מעל השכבה iodixanol 20% תוך שימוש באותה השיטה כאמור לעיל.
  6. בזהירות לאזן ולטעון הצינורות ultracentrifugation לתוך הרוטור דליים, צנטריפוגה ברוטור סווינג-דלי ב 268,000 x g למשך 50 דקות ב 4 º C. הגדר את מהירות האצה והאטה לצנטריפוגה תעריפי המינימום המותר כדי למנוע הפרעה של השכבות צפיפות.
  7. תווית עשרה צינורות microcentrifuge 1.5 mL עבור כל דגימה שיתאימו שברים 1 עד 10 של המילוי ההדרגתי צפיפות. שבר 1 מיועדת כמו השבר העליון שיוסרו קודם, בעוד שבר 10 הוא השבר התחתון האחרון הוסר.
  8. לאחר השלמת ultracentrifugation הדרגתיות, בעדינות להסיר את הצינורות הדליים הרוטור, מקום בעל יציבה. לעיתים קרובות ניתן לראות להקה לעין של שלפוחית השבר של עניין. פיפטה 10 טורי שברים של µL 490 מהחלק העליון של מעבר הצבע לתוך הצינורות המתאימים. יהיה כמות קטנה של הנוזלים שנותרו בחלק התחתון של הצינור סביר מכיל חלבונים משחיתה. דוגמה זו שניתן שנמחקו או שייעשה בו שימוש בתור שבר 11 במידת הצורך.
  9. למדוד את מדדי השבירה של שברים בעזרת של משאבות-מעבדות. זה יכול להתבצע גם במילוי הדרגתי שליטה לפעול במקביל אם לדוגמה שימור נחוצה. Pipette µL 20-30 של כל שבר המכיל iodixanol על גבי המשטח משאבות-מעבדות ולאחר הערכת הצפיפות על-ידי השוואת את מדדי השבירה כדי iodixanol ידוע צפיפות. שימו לב כי שברים יכול להיות מאוחסן בן לילה הפתרון המכילות iodixanol במידת הצורך לפני שתמשיך לצעד רחיצת ultracentrifugation הבא.
  10. העברת כל שבר צינור ultracentrifugation מ ל 12 נקי. הוסף 5 מ של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS; 137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, 2 מ מ ח'2PO4, pH 7.4) שפופרת ואת תערובת מאת pipetting לאט לאט למעלה ולמטה.
    הערה: PBS נוספו הדגימות צריך להיות ללא חלקיקים, מובטחת באמצעות סינון סטרילי PBS דרך מסנן מיקרומטר 0.22 ואחסון בטמפרטורת החדר, כדי להימנע משקעים מלח.
  11. להוסיף אוטם 6 נוספים ל- 1 x PBS אל הפסגה ולערבב שוב בזהירות.
  12. Ultracentrifuge הצינורות ב x 100,000 g עבור 2 h-4 ° C עד מחדש הצניפה שלפוחית קטנה. Decant את תגובת שיקוע והקש על הצינורות יבש לפני פירוק של שלפוחית לניתוח חלבון (שלב 3) או re-השעיה של EVs לניתוח מורפולוגיות (שלב 5).

3. פירוק ואישור Immunoblot של חלבונים EV

הערה: אם שימור שלפוחית כל אפיון מורפולוגיות או פעילות ביולוגית רצוי, חוקרים יכולים להמשיך ישירות בשלב 5. בניסויים הראשונית, או לפני ניתוח ספקטרומטר מסה, שברים כל התאושש צריך להיות מנותח על ידי immunoblot כדי לאשר שברים עם חלבונים EV.

  1. כדי lyse EVs לניתוח חלבון, להוסיף µL 40 פירוק חזקה מאגר (5% מרחביות, 10 מ מ EDTA, pH טריס-HCl 120 מ מ 6.8, 2.5% מרקפטואתנול, אוריאה מ' 8) עם התוספת של מעכבי פרוטאז EV צניפה בצינור ultracentrifuge.
    הערה: אם תנאים שאינם בהפחתת הם הרצויה לגילוי נוגדנים של חלבונים, להחליף את המים הנדסה גנטית מרקפטואתנול במאגר של פירוק חזק.
  2. להבטיח מלאה re-השעיית צניפה והמסה של EVs במאגר על-ידי הצבת מצלמות-מיקרוסקופים על ultracentrifugation הצינור, vortexing נמרצות, ואז נדנדה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני מערבולת הסופי.
  3. בקצרה צנטריפוגה ב x 1000 גרם במשך 30-60 s כדי לשחזר את אמצעי האחסון המדגם כולו. להעביר את הדגימה צינור microcentrifuge 1.5 mL החדש, חנות ב-20 ° C ל-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף.
  4. כדי להתכונן מטוהרים lysates ניתוח immunoblot, להוסיף מאגר מדגם x Laemmli (10% מרחביות, 250 מ מ pH טריס 6.8, 1 מ"ג/מ"ל bromophenol כחול, 0.5 M DTT, גליצרול 50%, 5% מרקפטואתנול) 5 הדגימות עבור ריכוז סופי של 1 x.
    הערה: אם התנאים שאינם בהפחתת הם הרצויה, להחליף את DTT מרקפטואתנול במים הנדסה גנטית.
  5. אם homogenate רקמות כל הפקדים הם הרצויה, lyse הרקמה ב שתנן המכילות חזקה פירוק מאגר שתוארו לעיל עם מעכב פרוטאז, ואז צנטריפוגה ב x 10,000 ג'י 10 דקות למחוק את הנותרים מטריצה חוץ-תאית, תאים שלמים, או פסולת הסלולר ללא פגע. להוסיף 5 מאגר מדגם x Laemmli homogenate רקמות על ריכוז סופי של 1 x.
  6. מרתיחים את המאגר מדגם המכיל דוגמאות homogenate EV או רקמות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות ולאחר מכן טען נפח שווה (מן המקבילה של 0.1-0.3 גרם להקים הרקמה בחומר; 1-2 µg של חלבון מטוהרים EV) שברים 1-10 לתוך ג'ל מרחביות-דף 10%. לטעון שווה מסה של רקמה homogenate. ייתכן שיהיה צורך נפח גדול של דוגמאות לזיהוי באמצעות נוגדנים פחות רגישים.
  7. להמשיך עם אלקטרופורזה בג'ל וניתוח תספיג כמו בעבר מפורט21 לאשר EV חלבונים ב- lysates מטוהרים ולהשוות בין השפע היחסי EV בחלקים.
    הערה: ברגע EV חלבון הוכח reproducibly בחלקים עקבית, לשטוף את ultracentrifugation הסופית המתוארים שלב 2.12 עשוי להיות מוגבל שברים הדרגתי של עניין.

4. EV חלבון כמת

  1. שימוש assay מבוססי פלורסצנטיות דטרגנט, אוריאה-תואם אם רגיש כימות של חלבונים EV רצוי לצורך ניתוח נוסף (ראה טבלה של חומרים). שים לב כמה מבחני מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית תואם עם הכחול bromophenol קיים במאגר מדגם Laemmli, הקלה על פירוק ישירה של בגדר EV (ב- 2.12 שלב) במאגר הזה אם מועדף.
  2. אם ערכת כימות חלבון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית הנ ל משמש, ספוט 1 µL של הדגימה או סטנדרטי לפחות לשכפל על נייר הסינון שסופקו ולהמשיך כימות חלבון על פי הוראות היצרן.

5. אפיון של מורפולוגיה EV

  1. כדי לבחון כל שלפוחית לאחר צנטריפוגה סופית לרחוץ ב- 2.12 צעד, ביסודיות מחדש להשעות EV גלולה ב- PBS חינם חלקיק 1 x. חנות EVs ב 4 ° C לא יותר שבוע עד עיבוד כדי להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה.
    הערה: . זה מועיל בעבר אישרו שברים בעקביות המכילה חלבון EV מועשר על-ידי ניתוח immunoblot להגבלת המורפולוגיים כדי שברים של עניין.
  2. לבצע מעקב ניתוח על כל דגימות EV כדי לקבוע את ריכוז והגודל של שלפוחית בהכנות, כמו בעבר מפורט22ננו-חלקיק.
  3. לאפיין EV מורפולוגיה ואשר מדידות גודל על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של שלפוחית, אם רצונך בכך. EM רשתות ניתן להכין המתלים שלפוחית בעקבות צעד 5.123, או לחילופין יכול להיות מעובד כמו ההכנות בלוק24 של כדורי בעקבות צעד 2.12.

6. בג'ל לטיהור ועיכול טריפסין לניתוח ספקטרומטר מסה

  1. אם איפיון proteomes EV באמצעות ספקטרומטר מסה היא הרצויה, טען שווה מסה (לפחות 10 µg של חלבון) של שברים המכיל EVs לתוך ג'ל לזיהוי טרומי כדי להפריד ולטהר חלבונים. ג'לים טרומי היצרן שסופקו המועדפות כדי להפחית את הרמות של פוטנציאל לזיהום חלבונים (למשל, קרטין) להיות מוחדרים הדגימות.
  2. תריץ את דגימת לפחות 0.5 אינצי'ם לתוך הג'ל לזיהוי לטיהור חלבון, ולאחר מכן לתקן, כתם עם צבע Coomassie, כאמור תיאר בפירוט25.
  3. חותכים המסלול. ודוחפים 1 מ3 קוביות לעיכול טריפסין, כמו בעבר מפורט19,26.
  4. טען µL 5 פפטיד מתעכל מדגם LC-MS/MS מכשיר להפרדה על עמודה אנליטית, לאחר מכן ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה בהתאם לפרמטרים שצוינו בפרט16.

תוצאות

מבט סכמטי של רקמות דיסוציאציה, צנטריפוגה דיפרנציאלית, טיהור הדרגתי של שלפוחית מוצג באיור1. אישור מורפולוגיות ו immunophenotypic של EVs מטוהרים הדרגתי מודגשת באיור2. דיאגרמה של צפיפויות לשחזור בעקבות ultracentrifugation של המילוי ההדרגתי iodixanol 10-30% מוצג, עם ש?...

Discussion

עניין מדעי הרבה נוצרה לגבי התפקידים ש-evs קטן לשחק את microenvironment הגידול, וכן התפתחות האיברים, התבגרות, ופועלים. באופן כללי, מחקר זה מספק זרימת עבודה מיטביים עבור החילוץ של EVs שלם כל המוח או דגימות הגידול. ואילו כאן פשוט נדגים את הישימות של טכניקה זו EVs ריאות נגזר הגידול, שיטה זו יכול בקלות להיות מ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה ד ר ריצ'רד Nowakowski פלורידה המדינה אוניברסיטת מעבדה חיה המשאבים עבור מתן ודאגה לבעלי החיים השתמשו לפתח פרוטוקול זה, עם כל הכבוד. אנו מודים שיה ליו ר ראקש סינג, פלורידה המדינה אוניברסיטת Translational מדעי המעבדה לקבלת סיוע עם העבודה ספקטרומטר מסה המשמש אפיון שלפוחית במורד הזרם, וכן במתקן חמ ע מדע ביולוגי הדמיה משאבים עבור השימוש של המיקרוסקופ האלקטרוני שידור במחקר זה. לבסוף, אנו מודים ד ר Mandip Sachdeva (פלורידה A & M באוניברסיטת) על תרומה של דגימות הגידול בשימוש בפיתוח של שיטה זו. מחקר זה נתמך על ידי מענקים משרד הבריאות של פלורידה אד אתל מור אלצהיימר המחלה מחקר תוכנית הוענק D.G.M., J.M.O (6AZ11), המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס R01CA204621 הוענק D.G.M.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 µm filterVWR28145-505
12 mL ultracentrifuge tubesBeckman Coulter331372
5.5 mL ultracentrifuge tubesBeckman Coulter344057
anti-Alix antibodySanta Cruzsc-7129
anti-Calnexin antibodySanta Cruzsc-11397
anti-CD63 antibodyAbcamab59479
anti-CD81 antibodySanta Cruzsc-9158
anti-Flotillin 2 antibodySanta Cruzsc-25507
anti-HSC70 antibodySanta Cruzsc-7298
anti-Syntenin-1 antibodySanta Cruzsc-100336
anti-TSG101 antibodySanta Cruzsc-7964
EZQ protein quantification kitThermoFisher ScientificR33200
FA-45-6-30 rotor Eppendorf5820715006
FEI CM120 Electron MicroscopeTSS Microscopy
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)Genetex27171
HALT phosphatase inhibitor (100x solution)ThermoFisher Scientific78420
HALT protease inhibitor (100x solution)ThermoFisher Scientific78438
Hibernate E mediumThermoFisher ScientificA1247601
MLS-50 swinging-bucket rotorBeckman Coulter367280
NanoSight LM10Malvern
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge Beckman Coulter393315
Optima XE-100 ultracentrifugeBeckman CoulterA94516
OptiprepSigmaD155660% iodixanol in sterile water solution
Q Exactive HF Mass SpectrometerThermoFisher Scientific
rabbit anti-goat IgGGenetex26741
rabbit anti-mouse IgGGenetex26728
Refracto 30PX (refractometer)Mettler Toledo51324650
S-4-104 rotorEppendorf5820759003
SW 41 Ti swinging-bucket RotorBeckman Coulter333790
Tabletop 5804R centrifugeEppendorf22623508

References

  1. Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
  2. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  3. Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
  4. Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
  5. Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
  6. Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
  9. Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
  10. Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
  11. Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  12. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  13. Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
  14. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  15. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  16. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
  17. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
  18. Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
  19. Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
  20. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
  21. Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
  22. Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
  23. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
  24. Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
  25. Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
  26. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  28. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
  29. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
  30. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  31. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  32. Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
  33. Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes - large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144exosomesex vivooncosomes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved