JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הנה, שני מבחני תפוקה בינונית עבור הערכה של השפעות על Ca2 +-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי מתוארים. מבחני אלה יכולים לשמש בקלות ובמהירות מסך כמויות גדולות של תרכובות עבור אפקטים על Ca2 +-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי.

Abstract

Ca2 +-איתות חיונית כדי תפקוד נורמלי תא הזרע ואת פוריות הגבר. באופן דומה, התגובה acrosome חיוני על היכולת של תא זרע אנושי כדי לחדור את pellucida zona להפרות את הביצית. לכן זה עניין רב לבדיקת תרכובות (למשל, כימיקלים סביבתיים או מועמדים סמים) על השפעתם על Ca2 +-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי גם לבחון את ההשפעות השליליות פוטנציאליים על תפקוד תאי זרע אדם או לחקור תפקיד אפשרי כמו מניעה. כאן, מתוארים שני מבחני תפוקה בינונית: 1) מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay עבור הערכה של השפעות על Ca2 +-איתות זרע אנושי, ואת וזמינותו cytometric 2) על התמונה להערכה של תגובה acrosome זרע אנושי. מבחני אלה יכולים לשמש מסך מספר רב של תרכובות עבור אפקטים על Ca2 +-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי. יתר על כן, מבחני ניתן להשתמש כדי ליצור עקומות מנה-תגובה מאוד ספציפי של תרכובות בודדים, לקבוע additivity/הסינרגטיות פוטנציאליים עבור תרכובות שניים או יותר, וכדי ללמוד את מצב תרופתי של פעולה באמצעות עיכוב תחרותי ניסויים עם מעכבי CatSper.

Introduction

מטרת מבחני שני המתוארים כאן היא לבחון את ההשפעות על Ca2 +-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי, כפי שהוצגה עבור מספר תרכובות מספר פרסומים העסקת אלו מבחני1,2, 3,4,5,6,7. Ca2 +-איתות התגובה acrosome הם פונקציה חיונית לחיי שגרה תא הזרע האנושי והן פוריות הגבר.

המטרה הכוללת של תא זרע אנושי הוא כדי להפרות את הביצית. כדי להיות מסוגל בהצלחה וישר להפרות את הביצית, הפונקציות של תא הזרע חייב להיות מוסדר בחוזקה במהלך המסע של תא הזרע דרך באיברי הרבייה הנקביים8,9. מהפונקציות תא הזרע מוסדרים באמצעות תאיים Ca2 +-ריכוז [Ca2 +]אני (למשל, זרע תנועתיות כימוטקסיס, acrosome התגובה)10. כמו כן, תהליך התבגרות שנקרא capacitation, אשר הופך את תא הזרע מסוגלים להפרות את הביצית, הוא מוסדר באופן חלקי על ידי [Ca2 +]אני10. Ca2 +-הבלטת ממד Ca2 +-ATPase משאבות11 לשמור על קיפול כ 20.000 Ca2 +-מעבר צבע על פני קרום תאי זרע אדם, עם מנוחה [Ca2 +]אני של 50-100 ננומטר. אם Ca2 + מותר לעבור את קרום התא (למשל, דרך הפתח של Ca2 +-ערוצי), זרם גדולה למדי של Ca2 + מתרחשת, והוליד העלאת [Ca2 +]אני. עם זאת, גם נושאת תא הזרע Ca תאיים2 +-חנויות, אשר יכול לשחרר Ca2 + ו, לכן, גם לתת לעלות העלאת [Ca2 +]אני12. מעניין, כל ערוץ בתיווך Ca2 +-זרם בתאי זרע אדם כה נמצאה להתרחש באמצעות CatSper (חתוליוניים ערוץ של Sperm), אשר מתבטאת רק תאי זרע11. בתאי זרע אנושי, CatSper מופעל על ידי ליגנדים אנדוגני פרוגסטרון פרוסטגלנדינים דרך ליגנד ברורים, מחייב אתרי13,14,15, שמוביל מהיר Ca2 +-זרם לתוך תא הזרע. שני מקורות עיקריים ליד הביצה מספקים רמות גבוהות של אלה ליגנדים אנדוגני. אחד הוא נוזל הזקיקים מכיל רמות גבוהות של פרוגסטרון16. הנוזל הזקיקים הוא שוחרר מן בוגרת זקיקים יחד עם הביצה-ביוץ, mixes עם הנוזל בתוך ה-oviducts17. המקור העיקרי הוא תלולית התאים המקיפים את הביצית ולשחרר רמות גבוהות של פרוגסטרון פרוסטגלנדינים. הפרוגסטרון-induced Ca2 +-זרם בתוך תאי הזרע הוכח לתווך כימוטקסיס לקראת9,ביצה18, לשלוט19,תנועתיות הזרע20 ולעורר את acrosome תגובה21. מפעילה של אלה בודדים [Ca2 +]אני-פונקציות זרע מוסדר בסדר הנכון, בזמן הנכון הוא קריטי עבור הפריה של ביצה8. בקו זה, שיוצרת פרוגסטרון-induced Ca2 +-זרם נמצאה שיש לשייך מופחתת פוריות הגבר22,23,24,25,26 ,27,28,29 ו CatSper תפקודית הוא חיוני עבור פוריות הגבר26,30,31,32, 33,34,35,36.

כמו תאי הזרע להגיע הביצה, רצף אירועים חייב להתבצע לדישון להתרחש: 1) תאי הזרע חייב לחדור את שכבת תאים cumulus שמסביב, 2) לאגד zona pellucida, 3) exocytose את התוכן acrosomal, התגובה acrosome כביכול 37, 4) לחדור את zona pellucida, ו- 5) מיזוג עם קרום ביצה כדי להשלים דישון38. כדי להיות מסוגל לעבור את השלבים, להפרות את הביצית, תא זרע קודם לעבור capacitation11, שמתחיל כמו תאי הזרע לעזוב את נוזל הזרע המכיל גורמים "decapacitating"39 לשחות לתוך הנוזלים של הנקבה באיברי הרבייה עם רמות גבוהות של ביקרבונט, אלבומין37. Capacitation מעבד את תאי הזרע יכול לעבור hyperactivation, צורה של תנועתיות עם מכות נמרצת של שוטון, וכן acrosome תגובה37. תנועתיות Hyperactivated נדרש עבור חדירה של40zona pellucida, acrosome מכיל אנזימים hydrolytic שונים לסייע בתהליך זה חדירה41. בנוסף, התגובה acrosome מעבד את תאי הזרע מסוגלים פיוזינג עם הביצה על ידי חשיפת חלבונים ספציפיים קרום על פני הזרע הכרחי עבור זרע-ביצה פיוז'ן42. כתוצאה מכך, יכולת לעבור התגובה hyperactivation ו- acrosome הם שניהם נדרש להפריה מוצלחת של ביצה40,42. בניגוד מה כבר ראיתי עבור העכבר תאי זרע43,44,45, תאי זרע אנושי רק כי הם acrosome-שלם ניתן לאגד zona pellucida46. כאשר תאי הזרע האנושי מאוגדים את pellucida zona להם לעבור את התגובה acrosome לחדור zona pellucida41 והן לחשוף חלבונים ספציפיים ממברנה הנדרשים עבור המיזוג עם ביצה38. העיתוי של התגובה acrosome זרע אנושי ולכן קריטי להפריה להתרחש.

כמתואר לעיל, Ca2 +-מערכת אזעקה היא חיונית עבור זרע נורמלי תא פונקציה8, זה, לכן, עניין רב כדי שניתן יהיה מסך מספר רב של תרכובות עבור אפקטים על Ca2 +-איתות בתאי זרע אדם. באופן דומה, ככל האנושי היחיד תאי הזרע עוברים acrosome התגובה בבית המקום והזמן הנכון יכול לחדור את pellucida zona לדשן את הביצה46,47, זה גם עניין רב כדי שניתן יהיה לבדוק את תרכובות ביכולתם להשפיע על התגובה acrosome זרע אנושי. לשם כך, מתוארים שני תפוקה בינונית מבחני המיון: 1) assay עבור אפקטים על Ca2 +-איתות תאי זרע אנושי, ואת וזמינותו 2) על היכולת לגרום תגובה acrosome תאי זרע אנושי.

Assay 1 הוא בינוני-תפוקה Ca2 +-איתות וזמינותו. טכניקה המבוססת על הקורא צלחת זו קרינה פלואורסצנטית עוקב אחר שינויים בזריחה כפונקציה של הזמן בו זמנית בבארות מרובים. Ca2 +-רגיש הפלורסנט, Fluo-4 ישד K עבור Ca2 +≈ 335 ננומטר הוא תא-permeant בדמות אסתר AM (acetoxymethyl). באמצעות Fluo-4, זה אפשרי למדוד שינויים [Ca2 +]i לאורך זמן, לאחר התוספת של תרכובות לעניין תאי הזרע. וזמינותו פותחה על ידי המעבדה של טימו Strünker 201113 , מאז שימש במספר מחקרים כדי תרכובות מסך עבור אפקטים על Ca2 +-איתות זרע אנושי1,2,3, 4,5. גם שיטה דומה שימש למסך סמים מספר מועמדים48. בנוסף, וזמינותו זו היא שימושית גם עבור הערכת מצב תרופתי של פעולה1,2,3,4,5, עקומות מנה-תגובה1, 2,3,4,5, עיכוב תחרותי1,2, additivity1,2והסינרגטיות3 של תרכובות של עניין.

Assay 2 הוא assay התגובה תפוקה בינונית acrosome. טכניקה זו מבוססת על cytometer התמונה מודדת את הכמות של קיימא acrosome הגיב תאי זרע מדגם, באמצעות שלושה צבעי פלורסנט: propidium יודיד (PI), מצמידים FITC לקטין של אפון השדה (FITC-PSA) ולאחר Hoechst-33342. וזמינותו היה שונה מכל שיטה דומה מבוססי cytometry זרימה על-ידי Zoppino et al.49 , שימש ב מחקרים מספר6,7. באשר Ca2 +-איתות assay, assay התגובה acrosome הזה יכול לשמש גם כדי להעריך עקומות מנה-תגובה, עיכוב, additivity והסינרגטיות של תרכובות של עניין.

Protocol

איסוף וניתוח של דגימות זרע אנושי של הפרוטוקולים עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה במחקר של אזור הבירה של דנמרק. כל דגימות זרע הושגו אחרי מדעת מתורמים מתנדבים. לאחר הלידה, הדגימות היו מלא תשוחררנה. על הנוחות שלהם כל תורם קיבל תשלום של 500 DKK (בערך $75 דולר ארה ב) עבור כל דגימה. הדגימות היו נותח ביום של משלוח. ולאחר מכן הושמד מיד לאחר הניסויים מעבדה.

הערה: התפוקה בינונית2 +Ca-איתות assay מתואר שלבים 4-5 ואת וזמינותו התגובה acrosome תפוקה בינונית שלבים 6-7. פרוטוקול להכין בינוני נוזל תובל אנושי (HTF+) מתואר בשלב 1, הטיהור של תאי זרע עבור מבחני מתואר בשלבים 2-3.

1. הכנת נוזל תובל אנושי (HTF+) בינוני

הערה: שימוש מבחנות הנפחי בגדלים המתאימים, 1 ליטר מדידה גליל, של פגים, מלחי כמפורט בטבלה 1 ו לטבלה 2, מים מטוהרים, 0.2 µm הנקבוביות ומסנן צינורות פלסטיק 50 מל.

  1. להכין מלאי פתרונות של מלחי במים מטוהרים (טבלה 1).
    1. להוסיף את כמות המלח המפורטים בטבלה 1 אל בקבוק הנפחי של הגודל המתאים, להוסיף מים מורתחים קצת מתחת לנפח הרצוי ומערבבים היטב בעזרת של פגים.
    2. כאשר מלח להתמוססות מלאה, להסיר את המגנט מים מטוהרים לאמצעי האחסון הסופי הרצוי.
  2. העברת מניות הפתרון לבקבוק ולאחסן עד השימוש.
    הערה: פתרונות מניות ניתן לשמור, לעשות שימוש חוזר עבור תקופות זמן ארוכות יותר: גלוקוז, HEPES ב-20 ° C ופתרונות מניות אחרים בטמפרטורת החדר (RT).
  3. להכין 1 ליטר של HTF+ מדיום מפתרונות מניות (טבלה 2).
    1. ודא כי כל הפתרונות מניות הם התפרקה לחלוטין ולא מעורבב היטב לפני השימוש.
    2. להוסיף את כמות המניות פתרון ומלח המופיעים בטבלה 2 ל' 1 מדידת גליל ולהוסיף מים מורתחים 900 מל.
    3. מערבבים היטב בעזרת של פגים ולהתאים pH כדי 7.35 עם פתרון NaOH.
    4. להסיר את המגנט ולהוסיף מים מורתחים 1,000 מ.
  4. פילטרט סטרילי של HTF+ בינוני עד 0.2 µm נקבובית לסנן, בינוניים HTF+ aliquot צינורות פלסטיק 50 מל, וחנות ב 4 ° C עד השימוש.
  5. רק לפני הפעלת ניסוי, להוסיף µL 165 של Na-פירובט aliquot 50 מ ל להשיג ריכוז Na-פירובט הסופי של 0.33 מ מ.
    הערה: אדם בינוני נוזלים תובל ניתן גם לקבל מספקי מסחריים שונים. בעת שימוש המדיום3– HCO 4 מ מ, דגימות יכול להיות מודגרות בשלמותם סגור באינקובטור בלי תוספת CO2 באוויר ללא נשתל גדול ב- pH. אם חממה2 CO זמין, ניתן לחשב את הכמות המתאימה של CO2 משתמשת את משוואת הנדרסון-האסלבאך ולא להשתמש בו. אם משתמש המדיום3– HCO 25 מ מ, דוגמאות צריך להיות מודגרות בשלמותם פתוח בחממה2 CO עם אויר המכיל כמות המתאימה של CO2 (תלוי הלחץ האטמוספרי, בדרך כלל בין 5-10%) כדי למנוע את הסחף ב- pH. ניתן לחשב את הסכום המדויק של CO2 באמצעות משוואת הנדרסון-האסלבאך.

2. טיהור תאי זרע תאי דרך בשחייה (איור 1)

הערה: מיכל פלסטיק נקי פעורת לשימוש את דגימת הזרע, אינקובטור, צינורות פלסטיק 50 מל, ארון תקשורת עבור הנחת צינורות פלסטיק 50 מל-בזווית של 45°, בינוני HTF+ (מוכן ב שלב 1 או שהושג מספק מסחרי), צנטריפוגה וכן בנסיוב אדם אלבומין (HSA).

  1. להשיג דגימת זרע אנושי טרי שנתרמו מיוצר באמצעות אוננות, פלטה לתוך מיכל פלסטיק נקי פעורת. השתמש רק דגימות זרע זה למלא את הפרמטרים שנקבעו על-ידי המדריך מעבדה מי בחינה ועיבוד של זרע אנושי.
  2. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות לאפשר זה הופך לנוזל.
  3. לחמם 50 מ של HTF+ בינוני עם 4 מ מ HCO3– 37 מעלות צלזיוס.
  4. המקום נקי 50 מ ל צינורות פלסטיק במעמד בזווית של 45 מעלות (כדי להגדיל את שטח הפנים בין נוזלים). השתמש צינור 1 לכל מיליליטר זרע raw.
  5. להוסיף 4 מ"ל של המדיום HTF+ preheated כל אחד הצינורות.
  6. בזהירות פיפטה 1 מ"ל של דגימת זרע נוזלי לתחתית של כל שפופרת המכילה 4 מ של HTF טרופה+. למנוע שחרור של בועות אוויר.
  7. סגור את המכסים, דגירה הצינורות ב 37 ° C עבור 1 h.
  8. בעדינות מחוק לגמרי, להעביר כל כך הרבה של השבר העליונים (HTF+ עם תאי תאי זרע) ככל האפשר צינור חדש פלסטיק 15 מ"ל, תוך תשומת לב ששום דבר מן השבר התחתון (זרע עם תאים מתים immotile) אינו כלול. באופן כללי, זה בטוח להעביר 3.5 מ של השבר העליונים, מבלי להפריע את השבר התחתון. כדי להימנע מערבולות אוויר יניקה, לחתוך את מ מ 1-2 החיצוני של קצה פיפטה בזווית של 45° כדי להשיג פתח גדול.
  9. למלא את הצינור פלסטיק 15 מ"ל עם HTF+ תאים לשטוף את הצינור ב x 700 g 10 דקות ב- RT. centrifuge
  10. בעדינות תשאף להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא הזרע ב 2 מ של HTF+.
  11. להעביר 20 µL של ההשעיה זרע שתי שפופרות פלסטיק קטנות להערכת ריכוז הזרע (ראה שלב 3).
  12. למלא את הצינור פלסטיק 15 מ"ל עם HTF+ תאים לשטוף את הצינור ב x 700 g 10 דקות ב- RT. centrifuge
  13. בעדינות תשאף להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא הזרע עד 10 x 106 תאים/מ"ל (מבוסס על ריכוז תא העריך בשלב 2.11).
    1. עבור ניסויים באמצעות האו ם capacitated תאי זרע (Ca שוטף2 +-איתות assay)
      1. Resuspend בתאים HTF+ עם 4 מ מ HCO3–.
      2. להוסיף 30 µL של האדם אלבומין (HSA) (100 מ"ג/מ"ל) לכל mL HTF+ להגיע לריכוז הסופי של 3 מ"ג/מ"ל.
      3. לסגור את העפעפיים ואת תקופת דגירה של ≥1 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    2. עבור ניסויים באמצעות capacitated תאי זרע (acrosome התגובה assay)
      1. Resuspend בתאים HTF+ עם 25 מ מ HCO3–.
      2. הוספת µL 30 של HSA (100 מ"ג/מ"ל) לפי mL HTF+ להגיע לריכוז הסופי של 3 מ"ג/מ"ל.
      3. לצרף מכסים ברפיון, דגירה ≥ 3 שעות ב 37 ° C עם הכמות המתאימה של CO2 (ראה שלב 1, בדרך כלל בין 5-10% CO2).

3. ספירת תאי זרע

הערה: תאי זרע גם ניתן לספור באופן ידני50 או שימוש cytometer התמונה51, כפי שמתואר כאן. שימוש cytometer של התמונה, vortexer, S100 מאגר, קלטת-SP1, בשחייה טיהור תאי זרע (להכין בשלב 2).

  1. לדלל עם µL 20 aliquot כדי פקטור של 10, 20, 30, 50 או 90 במאגר S100 באמצעות צינור 2 מ"ל התחתון עגול על פי ריכוז הצפוי (הערכה על ידי בדיקה ידנית של בגדר בשלב 2.10). שימוש דילול הקרוב ביותר לריכוז צפוי (קרי, אם ריכוז תאי זרע6 15 x 10 לכל mL לאחר בשחייה צפוי ואז לדלל את דגימת זרע 20 µL עם µL 380 S100 מאגר [גורם לדילול 20]).
  2. לערבב היטב עבור 10 s באמצעות מערבל מערבולת במהירות הפנימי של 700 סל ד מקסימלי, לטבול את SP1-הקלטת לתוך הדגימה והקש על הבוכנה לבן מלא עד וביופסיה aliquot של המדגם לתוך בקלטת.
  3. לפתוח את cytometer תמונה, מקם את הקלטת במגש ולהפעיל וזמינותו ספירה של PI צבעונית האנושי תאי זרע Assay לפי הגורם דילול יישומית (שנבחרו בשלב 3.1).
  4. חזור על שלב 3.1-3.3 עם עוד דגימת µL 20, באמצעות פקטור דילול הקרוב למקום הריכוז נמדד המתקבל המדגם הראשון 20 µL.
  5. חישוב הממוצע תא הזרע ריכוז של שני המדדים.
  6. מתכוון להכפיל זרע תא ריכוז עם האחסון המקורי כדי לקבל ספירת זרע מוחלט (בשלב 2, לאמצעי האחסון המקורי הזה הוא 2 מ"ל).

4. מדידה של שינויים ב Ca תאיים חינם2 +-ריכוז ([Ca2 +]אני) באמצעות Ca2 +- fluorimetry (איור 2)

הערה: להשתמש בקורא צלחת פלורסצנטיות, 384 צלחות רב טוב, Fluo-4 בבוקר, תאי זרע מטוהרים בשחייה (שלב מוכן ב 2), תרכובות עניין שולטת היטב גם חיוביים ושליליים, פיפטה משחזר אוטומטית ו פיפטה של ערוץ 12.

  1. להכין של 2 מ מ Fluo-4 בבוקר המניות על-ידי הוספת µL 22.7 של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) בקבוקון של 50 µg Fluo-4 בבוקר ומערבבים היטב את הצינור.
  2. להוסיף על aliquot של µL 700 זרע התאושש בשחייה השעיה (capacitated או capacitated האו ם כמו מחולקת לרמות בשלב 2) מבחנה חדשה. µL 700 זרע מדגם הוא הכמות הדרושה כדי לנתח שורה אחת של בארות 24 בצלחת 384-microwell (משמש לבדיקת פקדים 3 ותרכובות 9 ב- doublets).
  3. להוסיף µL 3.5 של Fluo-4 אני Fluo-4 פתרון מניות AM µL 700 של השעיה זרע בריכוז הסופי של 10 מיקרומטר.
  4. דגירה דוגמת עבור 45 min ב- 37 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.
  5. צנטריפוגה מדגם ב x 700 g למשך 10 דקות, תשאף ולמחוק את תגובת שיקוע כדי להסיר עודפי Fluo-4.
  6. Resuspend צנפה ויטראז'ים ב HTF+ 5 x 106 תאים/מ ל (קרי, שימוש 2 x הנפח של התא ההשעיה נלקח בשלב 4.2)
  7. להכין דילולים של תרכובות ופקדים (ניתן לבצע בתקופות דגירה, צנטריפוגה בשלב 4.4 ו 4.5, בהתאמה).
    1. לדלל תרכובות, כמו גם פקד שלילי (מאגר עם רכב), פקד חיובי (פרוגסטרון) HTF+. לדלל תרכובות ופקדים 3 x הריכוז הסופי הרצוי, כפי שהם מדולל 1:3 בעת הוספתם את תאי הזרע בשלב 4.16.
    2. למקם את הצינורות עם דילולים בארון תקשורת עם המרחק בין צינורות התואמים המרחק בין קצות פיפטה פיפטה 12-ערוץ המשמש בשלב 4.16.
  8. השתמש פיפטה של ממסר אוטומטי (24 שלבים של 50 µL).
    1. מיקס Fluo-4 מוכתמת זרע מדגם בעדינות pipetting את הסכום כולו למעלה ולמטה פעם אחת.
    2. להוסיף aliquots של 50 µL הבארות 24 שורה בצלחת 384-microwell.
  9. הכנס את הצלחת microwell קורא צלחת זריחה ב 30 מעלות צלזיוס, סגור את המגירה.
  10. בחר את הפרוטוקול המתאים עבור Fluo-4. לרגש זריחה ב- 480 ננומטר, פליטה הרשומה ב- 520 ננומטר. השתמש בזמן המהיר ביותר האפשרי מחזור עם ההגדרה.
    הערה: להשתמש לפחות 10 הבזקות אופטיקה טוב והתחתון, במידת האפשר.
  11. בחר טוב בשורה ולהתאים רווח לערך היעד של 20%.
  12. להתחיל את המדידה.
  13. בקרת התוכנית הבסיסית במהלך המחזורים הראשונים 5.
    1. אם המדידה פלורסנט או ירידה לאורך זמן, לעצור את הניסוי, להתאים מחדש את הרווח, להתחיל את הניסוי שוב.
    2. אם הבסיס שונה מאוד בין בארות בודדים בשורה, או pipetting בשלב 4.8 היה unprecise או המדגם שהעריכה לא מספיק טוב לפני pipetting. למחוק את הניסוי.
    3. אם המדידה פלורסנט השוואה בין הבארות בשורה ויציבה במהלך המחזורים הראשון 5, המשך לשלב הבא.
  14. לאחר 10 מחזורים (משמש עבור בסיסית), השהה את הניסוי.
  15. הוצא את המגירה עם לוחית microwell.
  16. בעזרת פיפטה של 12 ערוצים (2 צעדים של 25 µL), במהירות להוסיף 25 µL של פתרונות מוכנים של תרכובות ופקדים (מתוך שלב 4.7) כדי שהכפילויות טוב 12 (24 וולס) של שורה. פתרונות יהיה מדולל 1:3, כמו הבארות שכבר מכילים 50 µL של דגימת זרע מוכתם.
  17. המשך המדידה מהר ככל האפשר (מגירה תיסגר אוטומטית) כדי למנוע חסר כל אותות פלואורסצנט המושרה על ידי תרכובות הוסיף ופקדים. שינויים קרינה פלואורסצנטית (ΔF) לאחר התוספת של תרכובות ופקדים עכשיו יילכדו.
  18. להפעיל את הניסוי עד אותות פלואורסצנט נצפו מתוך הפקד חיובי ותרכובות עניין.
  19. לעצור את הניסוי ולייצא את הנתונים פלורסצנטיות raw לנתח את זה כמו שלב 5.
    הערה: אני בדרך כלל Fluo-4 שימש Ca2 +-fluorophore רגיש וזמינותו, אבל אחרים Ca2 +-fluorophores רגיש יכול לשמש גם אם עירור, ספקטרום הפליטה מתאים עם מסננים בקורא צלחת זריחה. בהתאם הבחירה של fluorophore, ודא כי רמת רווח מוגדרת ברמה 'בטוחים' איפה הפסגות פלורסנט המושרה בטווח המדידה של המכשיר. ניתן לבדוק זאת על-ידי הוספת ionomycin לבאר בודדת בקביעה רווח מסוים. אם זה המושרה אות ניאון מעל הסף, הנמך את הרווח ונסה שוב. יש להשתמש Pluronic F-127 לעזרת הטעינה של Fluo-41,13, אך התגלה כי זה לא הכרחי2. מספר השורות נמדד בו-זמנית מקסימלי תלויה בשני גורמים. 1) זמן המחזור של המכשיר: אם זמן המחזור ארוך מדי, פסגות המושרה ב [Ca2 +]אני עלול לפספס. למדוד את מספר מרבי של שתי שורות בו-זמנית, כדי לשמור על זמן המחזור נמוך; 2) את המהירות של pipetting בשלב 4.16: באמצעות פיפטה של 12-ערוץ, זה אפשרי להוסיף במהירות פתרונות שונים 12 הבארות כפולים 12 (24 וולס) של שורות 1-2 (למשל, שורה אחת מודגרות מראש עם רכב, שורה אחת מודגרות מראש עם מעכב) , בלי להחסיר הפסגות2 + Ca המושרה. עם זאת, לא מומלץ לנסות להוסיף פתרונות שונים 24 שתי שורות למדידת בו זמנית, כמו טיפים pipetting יהיה חייב להיות מוחלפים בין שני השלבים pipetting רציפים, לפיה Ca המושרה2 + פסגות יכול לפספס.

5. ניתוח של הנתונים מ- Ca2 +- fluorimetry

  1. פתח את נתוני קרינה פלואורסצנטית raw שהושג וייצא בשלב 4.
  2. לחשב את ממוצע מבארות כפולים. אם קיימים הבדלים גדולים בין כפילויות, למחוק נתונים מן הבארות ספציפיים.
  3. להגדיר תוכנית בסיסית כמו המחזורים הראשונים 10.
  4. חישוב ΔF/F0 (%) ככל שהאחוזים שינוי קרינה פלואורסצנטית (ΔF) לאורך זמן לאחר תוספת של תרכובות ופקדים ביחס פלורסצנטיות הבזליים רשע (F0) במהלך מחזורי הראשון 10 (בסיסית).
  5. אם באמצעות הנתונים בדור של עקומות מנה-תגובה, להחסיר את המדידה של שליטה שלילי מן הבארות אחרים, כדי להסיר לכלוכים pipetting.

6. מדידה של תגובה Acrosome

הערה: להשתמש cytometer של התמונה, אינקובטור, צבעי פלורסנט: פאי, FITC-PSA ו- Hoechst 33342, תרכובות של עניין, כמו גם פקדים חיוביים ושליליים, פתרון immobilizing המכיל NaHCO 0.6 מטר3 ו- 0.37% (v/v) פורמלדהיד במים מזוקקים, שקופית A2 ולאחר capacitated בשחייה מטוהרים תאי זרע (להכין בשלב 2).

  1. להכין פתרון מכתימים המכילה פאי (5 µg/mL), FITC-PSA (50 µg/mL) ו Hoechst-33342 (100 µg/mL) HTF+, מערבבים אותו היטב באמצעות מערבל מערבולת, להגן עליו מפני אור עד השימוש.
  2. להכין פתרונות של תרכובות ופקדים 10 x הריכוז הסופי הרצוי, כפי שהם 1:10 מדולל בשלב 6.5. תמיד כוללים פקד שלילי (הרכב), שני פקדים חיובי: פרוגסטרון 10 מיקרומטר הריכוז הסופי וריכוז ionomycin 2 מיקרומטר הסופי.
  3. העברת aliquots של 240 µL תאי זרע capacitated (להכין בשלב 2) צינורות פלסטיק.
  4. להוסיף 30 µL של צביעת לפתרון כל שפופרת. הריכוז הסופי של כתמי יהיה: 0.5 µg/mL PI, µg 5/FITC-PSA mL ו- µg/mL 10 Hoechst-33342.
  5. להוסיף 30 µL של פתרונות עם פקדים או תרכובות כל שפופרת (1:10 דילול).
  6. מערבבים את הדגימות בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים או vortexing מתון. עקב לחץ מכני, להימנע מערבוב יתר.
  7. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  8. להכין צינורות פלסטיק חדש עם 100 µL של פתרון immobilizing המכיל NaHCO 0.6 מטר3 ו- 0.37% (v/v) פורמלדהיד במים מזוקקים, אחד לכל מבחנה.
  9. לאחר דגירה, מערבבים את הדגימות היטב בעזרת pipetting, ולהוסיף 50 µL של המדגם מבחן צינור עם 100 µL של פתרון שיתק.
  10. לפני טעינת לאהלי שקופיות A2, מערבבים את הדגימה היטב על ידי pipetting. למלא את החדרים בקפידה עם µL כ-30 ללא יצירת בועות אוויר.
    הערה: במהלך הדגירה, תאי הזרע תאי נוטים לצבור. תא גושים יכולים להפריע את המידות (למרות שהם אינם כלולים). לכן, ערבוב יסודי על-ידי pipetting לאחר דגירה חשוב מאוד. באופן דומה, בועות אוויר בתוך התאים יכולים להפריע את המידות. לכן, למלא את התא לאט, לשנות את הזווית של פיפטה אם הקצוות של הנוזל עומדים לפגוש וליצור בועת אוויר.
  11. במקום השקופית טעון על המגש של cytometer התמונה וסגור את המגש.
  12. בחר את הפרוטוקול FlexiCyte ואת התקשורת פרסמו.
    1. בחר את ההגדרות הבאות עבור פרוטוקול FlexiCyte: מספר ערוצים אנליטית: 2; מיסוך ערוץ: UV (LED365), זה ערוץ המשמש סגמנטציה; ערוץ 1: כחול (LED475), זמן החשיפה 3,000 ms, מסנן פליטה 560/35; ערוץ 2: ירוק (LED530), חשיפה זמן 500 ms, מסנן פליטה 675/75; המספר המינימלי של תאים שנותחה: 5000; לא לכלול תאים צבור: כן.
  13. חזור על שלב 6.9-6.12 עד כל דוגמאות נמדדו.

7. ניתוח של נתוני תמונה Cytometry

  1. פתוח נתונים שהושגו בשלב 6.
  2. צור שתי החלקות הבאים להעריך את המידות.
    1. ליצור חלקת פיזור עוצמת Hoechst-33342 לעומת אזור Hoechst-33342 סולמות biexponential. זה מגרש ניתן לשער Hoechst-33342 חיובי אובייקטים שנמצאים גם קטן מדי או גדול מדי כדי להיות תאי זרע אנושי.
    2. ליצור חלקת פיזור עוצמת FITC-PSA ועוצמה PI סולמות biexponential. מגרש זה יכול לשמש כדי התחת כמות acrosome הגיב תאי זרע על ידי שימוש של שער מזרחי שמפריד מארבע הקבוצות על העלילה (איור 3): 1) PI חיובית והקבוצה חיובי FITC-PSA: Acrosome הגיב nonviable תאי זרע; 2) שלילי PI וקבוצת FITC-PSA חיובי: Acrosome הגיב תאי זרע קיימא; 3) PI חיובי ו- FITC-PSA שלילי קבוצה: Acrosome ללא פגע nonviable תאי זרע; ו- 4), פאי שלילי ו FITC-PSA שלילי קבוצה: ללא פגע Acrosome תאי זרע בר קיימא.

תוצאות

נציג תוצאות ניסוי בדיקת ההשפעה של תרכובות 4 (A, B, C ו- D) יחד עם חיובי (פרוגסטרון) ושליטה שלילי (מאגר) על [Ca2 +]i זרע אנושי באמצעות של תפוקה בינונית Ca2 +-איתות assay ניתן לראות באיור 4a. ב- איור 4b, עקומת תגובת המינון של פרוגסטרון מוצג, אש...

Discussion

התפוקה בינוני Ca2 + איתות assay מבוסס על מדידות של זריחה של יחיד microwells המכיל תאי זרע וכ-250,000. האות שנתפסו בממוצע של כל תאי זרע בודדים בתוך הבאר. וזמינותו ובכך מספק שמידע מרחבי לגבי איפה בפרט תא הזרע [Ca2 +]אני משתנה, כמה גדול שיעור של תאי הזרע בשינוי [Ca2 +]אני לוקח מקום או ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להכיר את המעבדה של טימו Strünker על הפיקוח של AR, הזוהמה שלכם במהלך השהייה שלהם במעבדה שלו. יתר על כן, ברצוננו להודות עמיתינו המחלקה של גדילה, רבייה, בית החולים האוניברסיטאי קופנהגן, Rigshospitalet לסיוע שלהם עם הגדרת מבחני שני אלה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מדנמרק חדשנות קרן (גרנט מספרים 005-2010-3 ו- 14-2013-4).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm pore filterThermo Fisher Scientific, USA296-4545
1 L measuring cylinderThermo Fisher Scientific, USA3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubesEppendorf, Germany30120086 and 0030120094
12-channel pipetteEppendorf, Germany4861000813
384 multi-well platesGreiner Bio-One, Germany781096
15 and 50 mL platic tubesEppendorf, Germany0030122151 and 30122178
A2-slideChemoMetec, Denmark942-0001
Automatic repeater pipetteEppendorf, Germany4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)Sigma-Aldrich, GermanyL0770
Fluo-4 AMThermo Fisher Scientific, USAF14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate readerBMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342ChemoMetec, Denmark910-3015
Human serum albumin (HSA)Irvine Scientific9988For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometerChemoMetec, Denmark970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)ChemoMetec, Denmark910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 bufferChemoMetec, Denmark910-0101
SP1-cassetteChemoMetec, Denmark941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

References

  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157 (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33 (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31 (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. , (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. , (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21 (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471 (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471 (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352 (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21 (1), 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7 (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28 (4), 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288 (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29 (3), 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10 (1), 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61 (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60 (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14 (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30 (12), 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60 (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11 (8), 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33 (6), 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33 (10), 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84 (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18 (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11 (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542 (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13 (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3 (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142 (6), 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48 (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140 (22), 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99 (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29 (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27 (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. , 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97 (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1 (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145CatSperAcrosome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved