JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

נתאר פרוטוקול מקיף ומעשי פלורסצנטיות שחזור לאחר photobleaching ניסויים עם חיים תאים. למרות הפרוטוקול שימש כדי למדוד את הניידות של צהוב הניאון מתויג חלבון p62 במבנים המושרה, כמו aggresome, ניתן להחיל אותה למגוון רחב של מערכות מיקרוסקופ וחלבונים פלורסנט.

Abstract

קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP) היא טכניקה מיקרוסקופית שניתן לכמת ניידות חלבונים בתאים חיים. בניסוי FRAP טיפוסי, מצב יציב פלורסצנטיות נצפית על ידי הדמיה חוזרות עם אור לייזר בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, מולקולות פלורסנט הם במהירות ובאופן בלתי הפיך לקוי באמצעות חשיפה קצרה אור לייזר בעוצמה גבוהה. מידע על חלבון ניידות מתקבל על-ידי ניטור ההתאוששות של זריחה. השתמשנו FRAP כדי לקבוע את הניידות של p62 במבנים דמויי aggresome מושרה (ALIS) ב מקרופאגים מאתר לאחר גירוי עם ליפופוליסכריד (LPS). בגלל פרוטוקולים רבים FRAP הקיים או לא שלם או מורכבים, המטרה שלנו הייתה לספק פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, מעשית וישירה לניסויים FRAP עם תאים חיים. כאן, אנו מתארים RAW264.7 מקרופאג תרביות תאים עם צהוב הניאון חלבון-p62 (YFP-p62), אינדוקציה של ALIS באמצעות חשיפת התאים LPS ולאחר שיטה שלב אחר שלב של איסוף prebleach postbleach FRAP תמונות ונתונים וניתוח. לבסוף, נדון גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת עריכת ניסוי FRAP.

Introduction

קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP) היא טכניקה מיקרוסקופית שניתן לכמת חלבון דינאמיקה של חיים תאים1,2. הפופולריות של FRAP גדל כתוצאה מהזמינות מסחרי נרחב של סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי עם רזולוציה גבוהה, מהירות ורגישות לייזר, "קשת" של מקודדים גנטית חלבונים פלורסנט, כגון ירוק ניאון חלבון (GFP), חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)3. חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית הם התמזגו כדי חלבון עניין כדי לאפשר לוקליזציה subcellular של החלבון עניין. בניסוי FRAP טיפוסי, קרינה פלואורסצנטית מצב יציב באזור רכישה של עניין (ROI) בתוך תא הוא ציין באמצעות הדמיה חוזרות ונשנות של רועי זה עם אור לייזר בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, מולקולות פלורסנט הן במהירות ובאופן בלתי הפיך לקוי בקבוצת משנה מוגדרים מראש של רכישת רועי, ןלהל האקונומיקה רועי, על ידי חשיפה קצרה אור לייזר בעוצמה גבוהה. כמו חלבונים חדשים מולבן לחדש חלבונים מולבן לאורך זמן, המהירות ואת עוצמת קרינה פלואורסצנטית השחזור של האקונומיקה ROI מספק מידע אודות חלבון ניידות (איור 1)4.

האינטרס שלנו בקביעת הניידות של אוביקוויטין מחייב חלבון p62 (הידוע גם sequestosome-1) במבנים דמויי aggresome מושרה (ALIS) ב מקרופאגים RAW264.7 מאתר לאחר גירוי עם ליפופוליסכריד (LPS) הביאה אותנו כדי לסקור את FRAP ספרות. למרבה הצער, רבים מן הפרוטוקולים הקיימים FRAP הם חלקיים או מורכבים באופן מופרז5,6,7,8,9. חלקם אינם מספקים מידע מפורט אודות הגדרות לייזר, קרן נתיב תצורה, התמונה רכישה פרמטרים5,6,7,8,9. אחרים להשמיט פרטים חשובים לגבי ניתוח נתונים, כגון כיצד הנושא של אקונומיקה רועי להיסחף6,9 או כיצד לחשב פרמטרים חשובים שחזור, לרבות שבר ניידים (נז), שבר משותק (אניf), ואת המחצית של השחזור (t½)5,7. לעומת זאת, אחרים דגש רב מדי על נוסחאות מתמטיות מורכבות המשמש לחישוב Mf, אניf, ו- t1/25,6,8,9. לכן, המטרה שלנו היא לספק פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, מעשית וישירה לניסויים FRAP עם תאים חיים.

Protocol

1. RAW264.7 מקרופאג תרביות תאים

  1. תרבות RAW264.7 100,000 תאים (טבלה של חומרים) תרבות שלמה בינוני (של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM)) (טבלה של חומרים) המכילים 4.5 g/L גלוקוז בתוספת 10% סרום שור עוברית (טבלה של חומרים ) ו פניצילין/סטרפטומיצין (טבלה של חומרים) על גבי לא מטופל 35 מ מ זכוכית-התחתון מנות (טבלה של חומרים) ולמקם את הכלים חממה2 37 °C/5% CO. למחרת היום, transfect את התאים באמצעות polyethylenimine 1 מ"ג/מ"ל (פיי) (טבלה של חומרים).
  2. לערבב 1.5 μg של YFP-p62 עם μL 8 של פיי לתוך μL 166 של DMEM ללא סרום (בסיס בינוני ללא סרום שור בעובר ו פניצילין/סטרפטומיצין).
  3. שהתערובת תרביות תאים מורכבים לשבת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני הוספת את התערובת לתוך כל צלחת.
  4. להוסיף בעדינות את מתחמי למדיום הקיים עם תאים ורוק לצלחת.
  5. המקום צלחת 37 ° C /5% CO2 מגשים בן לילה.
  6. למחרת בבוקר, תשאף המדיום רלוונטי, ולאחר מכן לשטוף פעם בינונית מלאה. להוסיף 2 מיליליטר בינוני שלם לצלחת ולאפשר את התאים להתאושש עד למחרת.

2. אינדוקציה של ALIS עם ליפופוליסכריד (LPS)

  1. למחרת, תשאף המדיום של הלוחות, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של שלם בינוני המכיל 10 ננוגרם למ"ל LPS (טבלה של חומרים). לאפשר את הצלחות על תקופת דגירה של 5 שעות בחממה2 37 °C/5% CO.
  2. לאחר הטיפול LPS, תשאף המדיום, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של Tyrode קר, סטרילי מאגר המכיל 145 מ"מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, גלוקוז 10 מ מ, 1.5 מ מ CaCl2, MgCl 1.0 מ מ2ו 10 מ מ HEPES (pH 7.4) לשטוף את הצלחת.
  3. האחות המאגר ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של המאגר של Tyrode קר, סטרילית בתוספת μg/mL 10 nocodazole (טבלה של חומרים). לאפשר את צלחות דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות לפני FRAP הדמיה וניתוח.
    הערה: השימוש מאגר של Tyrode המכיל HEPES כמו תרכובת חציצה מאפשר הדמיה להתבצע בטמפרטורת החדר. Nocodazole שימש כדי להקטין את תנועת ALIS microtubules. תרבות בינוני מכיל ביקרבונט כמו תרכובת חציצה הדורשים CO2 למאגר. אחרת, ביקרבונט הכלול שינויים בינוני pH בהיעדרו של CO2.

3. הגדרת של מיקרוסקופ קונפוקלי ולאחר בחירת האזור עניין

  1. לייזר בחירה והגדרה נתיב קרן
    1. השתמש בכל מתאימים קונאפוקלית מיקרוסקופ (טבלה של חומרים) מצוידים עם תוכנה AIM או זן (טבלה של חומרים) או תוכנות הדמיה מתאימים.
    2. בחר את השורה 514 ננומטר לייזר ארגון/2, כפי YFP יש עירור שיא פליטת nm ו שיא 512-527 ננומטר. לחץ על לחצן ייבוא ולאחר מכן לחץ על לחצן לייזר . בחלון בקרת לייזר, לחץ על ארגון/2 458, 477, 488, 514 nm, מכן לחץ על לחצן ' המתנה '. לאחר ההמתנה ~ 3 דקות הלייזר להתחמם, לחץ על הלחצן על (איור 2א).
    3. להגדיר את עוצמת הלייזר של הקו 514 של לייזר ארגון/2 ננומטר ל- 100% (8.6 א). לחץ על לחצן ייבוא ולאחר מכן לחץ על לחצן לייזר . בחלון בקרת לייזר, הזן 100 בתחום הפלט [%] ולאחר מכן לחץ על לחצן Enter (איור 2א).
    4. הגדר את השידור של הקו 514 של לייזר ארגון/2 ננומטר 5%. לחץ על לחצן ייבוא , ואז לחצן ערוצים . בחלון בקרת סריקה , לחץ על לחצן ערוצים ולאחר מכן לחץ על התיבה הלבנה מרובע שבצד הטקסט 514 nm בעמודה קו פעיל להפעלת הקו 514 ננומטר לייזר. הזן 5 בתחום שידור [%] קו לייזר nm 514 (איור 2D).
    5. להגדיר המפצל ראשי קרן ודיקרואיק זוהר (האופט Farb פקידה (HFT)) למיקום HFT 458/514/561 כך הלהקות האלה הם הסיט את הדגימה על עירור. לחץ על לחצן ייבוא , ואז על כפתור Config . בחלון בקרת תצורה , לחץ על לחצן מצב ערוץ , ואז על הכפתור ברצועה בודדת . לחץ על לחצן HFT , ולאחר מכן בחר HFT 458/514/561 מתוך התפריט הנפתח (איור 2B).
    6. הגדר המפצל קרן ודיקרואיק זוהר המשני הראשון (Neben Farb פקידה 1 (NFT1)) למצב המראה , אשר יסיטו 100% של האור כדי המפצל קרן ודיקרואיק זוהר המשני השני (Neben Farb פקידה 2 (NFT2)). לחץ על לחצן ייבוא , ואז על כפתור Config . בחלון בקרת תצורה , לחץ על לחצן מצב ערוץ , ואז על הכפתור ברצועה בודדת . לחץ על לחצן NFT1 ולאחר מכן בחר המראה מתוך התפריט הנפתח (איור 2B).
    7. הגדר המפצל קרן ודיקרואיק זוהר המשני השני (NFT2) למיקום NFT 515 כדי להבטיח את אורכי הגל < 515 nm ישתקף, אורכי גל > 515 nm ישודרו. לחץ על לחצן ייבוא , ואז על כפתור Config . בחלון בקרת תצורה , לחץ על לחצן מצב ערוץ , ואז על הכפתור ברצועה בודדת . לחץ על לחצן NFT2 ולאחר מכן בחר NFT 515 מתוך התפריט הנפתח (איור 2B).
    8. להגדיר את מסנן פליטה ארוך לעבור (LP) (EF) LP 530, כך אורכי גל > 530 ננומטר יועברו אל הצינור האופטיקה (PMT, גלאי). לחץ על לחצן ייבוא , ואז על כפתור Config . בחלון בקרת תצורה , לחץ על לחצן מצב ערוץ , ואז על הכפתור ברצועה בודדת . לחץ על לחצן מסנן פליטה ולאחר מכן בחר LP 530 מתוך התפריט הנפתח (איור 2B).
    9. בחר ערוץ 3. לחץ על לחצן ייבוא , ואז על כפתור Config . בחלון בקרת תצורה , לחץ על לחצן מצב ערוץ , ואז על הכפתור ברצועה בודדת . לחץ על התיבה הלבנה מרובע שבצד הלחצן Ch3 .
  2. הגדרת רכישת התמונה
    1. בחר את התוכנית-עדשה אפוכרומטית 63 x / 1.40 שמן אובייקטיבי (טבלה של חומרים). הצג את הדגימה דרך העיינית של המצלמה מיקרוסקופ ולמקם את ALIS במרכז שדה הראייה. לחץ על לחצן ייבוא , ואז על כפתור מיקרו . בחלון בקרת מיקרוסקופ , לחץ על המטרה, ולאחר מכן בחר התוכנית-עדשה אפוכרומטית 63 x / 1.40 שמן אובייקטיבית מתוך התפריט הנפתח.
    2. הגדר את גודל המסגרת 512 x 512 פיקסלים, מהירות סריקה ל- 8, עומק 12 סיביותנתונים. לחץ על לחצן ייבוא , ואז לחצן סריקה . בחלון בקרת סריקה , לחץ על הלחצן ' מצב ' ועל לחצן מסגרת , ואז ללחוץ על כפתור 512 . Enter 8 בשדה מהירות סריקה , הקש Enterולאחר מכן לחץ על לחצן 12 סיביות (איור 2C).
    3. הגדר את הסריקה הממוצע 1 וזום אופטי ל- 3. לחץ על לחצן ייבוא ולאחר מכן לחץ על הלחצן סריקה . בחלון בקרת סריקה , לחץ על לחצן החץ למטה של השדה מספר ממוצע סריקה ולאחר מכן בחר 1 מתוך התפריט הנפתח. הזן 3 בשדה זום אופטי, ולאחר מכן הקש Enter (איור 2C).
    4. הגדר את חריר רווח 1.95 יחידות אוורירי , גלאי כדי 582 (מתחת הרוויה). לחץ על לחצן ייבוא , ואז לחצן סריקה . בחלון בקרת סריקה , לחץ על הלחצן ' ערוצים ', הזן 196 בשדה חריר ולאחר מכן הקש Enter. הזן 582 בתחום גלאי רווח ולאחר מכן הקש Enter (איור 2D).
    5. ודא כי נקבע קו לייזר 514 nm ארגון/2 בחזקת 100% (8.6 א). לחץ על לחצן ייבוא , ואז על כפתור לייזר . בתפריט הבקרה לייזר , הערך בשדה פלט [%] צריך להיות 100 (איור 2א).
    6. ודא כי נקבע קו לייזר 514 nm ארגון/2 שידור 5%. לחץ על לחצן ייבוא , ואז לחצן סריקה . בחלון בקרת סריקה , הערך בשדה שידור [%] עבור הקו 514 ננומטר לייזר צריך להיות 5 (איור 2D).
    7. יוצרים על מרובע בצורת ROI (רכישה ROI) הכוללת את מידות 150 x 150 הפיקסלים (194.6 מיקרומטר2). לחץ על לחצן ייבוא , ואז לחצן ערוך רועי . רועי ערוך בתפריט, לחץ על סמל מלבן, ולאחר מכן לחץ וגרור בחלון התמונה כדי ליצור ריבוע בעל מידות 150 x 150 הפיקסלים (194.6 מיקרומטר2) (איור 1א').
      הערה: רכישת רועי כולל ALIS (a) של עניין, (ב) שטח של קרינה פלואורסצנטית אינה ALIS (פקד ROI), לפחות 20 x 20 פיקסלים (3.3 מיקרומטר2) ו- (ג) על שטח של מעט אין קרינה פלואורסצנטית (רקע ROI) לפחות 20 x 20 פיקסלים (מיקרומטר 3.3 2) (איור 1א'). חשוב לכלול פקד רועי ברכישת רועי כך photobleaching שעלולות להתרחש עם הדמיה חוזרות ונשנות יכול להיות נשלט. רכישת רועי המוגדר כאן יהיה האזור היחיד ייסרקו. לייזר חוזרות סריקה בתוך נכס רועי רק יגבילו את photobleaching רועי מאשר, למשל, photobleaching את התא כולו או מספר תאים, ואסף מספר הפיקסלים ב- PMT (גלאי) יהיה גדול יותר ממספר פיקסלים הנאספים PMT (גלאי) לאחר סריקה של כל התא או מספר תאים.
    8. הגדרת זמן הסדרה כזו כי הרכישה רועי נסרק 35 פעמים, פעם אחת כל 30 s. לחץ על לחצן ייבוא ולאחר מכן על הלחצן הזמן . בחלון הזמן סדרת שליטה , לחץ על לחצן מדריך להתחיל סדרת ועל לחצן ידני להפסיק סדרה . הזן 35 שדה סדרה לעצירה ידנית, הקש enter ולאחר מכן לחץ על לחצן עיכוב מחזור שניה 30.0 (איור 2E).
    9. להגדיר את הפקד אקונומיקה כך photobleaching יתרחשו לאחר סריקה מספר 5, כדי לאסוף 5 תמונות prebleach של רכישת ROI. לחץ על לחצן ייבוא , ואז לחצן ערוך אקונומיקה . בחלון בקרת אקונומיקה , לחץ על הריבוע הלבן ליד אקונומיקה לאחר מספר סריקות. הזן 5 בשדה מספר סריקה ולאחר מכן הקש על מקש Enter (איור 2F).
      הערה: תמונות prebleach ו- postbleach כדאי לרכוש בעומק באותו האופטי.
    10. ליצור צורה עגולה מלבין רועי בתוך ALIS בעל קוטר 10-פיקסל (אזור = 0.8 מיקרומטר2). לחץ על לרכוש | עריכת אקונומיקה | הגדרת אזורים. בחלון מלבין אזורים , לחץ על הסמל מעגל . לחץ וגרור בחלון התמונה כדי ליצור עיגול בעל קוטר 10-פיקסל (אזור = 0.8 מיקרומטר2) (איור 2F).
    11. הגדר איטראציות עד 300. לחץ על לחצן ייבוא , ואז לחצן ערוך אקונומיקה . בחלון בקרת אקונומיקה , הזן 300 בשטח איטראציות, ולאחר מכן הקש על מקש Enter (איור 2F).
    12. הגדר את השורה 514-ננומטר לייזר ארגון/2 בחזקת 100% (8.6 א) ואת 100% שנחוו בעת האקונומיקה. לחץ על לחצן ייבוא , ואז לחצן ערוך אקונומיקה . בחלון בקרת אקונומיקה , לחץ על התיבה מרובע לבן משמאל 514 nm. הזן 100 בתחום שידור [%] עבור 514 ננומטר לייזר השורה ולאחר מכן לחץ על לחצן Enter (איור 2F).
      הערה: מספר האיטראציות צריך להיקבע מדעית. זה משתנה בהתאם fluorophore את הגודל של מבנה זה להיות מולבן, הלייזר.
  3. איסוף נתונים
    1. להתחיל בניסוי FRAP. לאסוף את התמונות prebleach 5 קודם את התמונה postbleach הראשונה, ואז לחשב את עומק אקונומיקה על פי המשוואה הבאה.
      figure-protocol-12200
      אם עומק אקונומיקה < 90, לעצור את הניסוי ולמחוק את הנתונים, כפי העומק אקונומיקה לא הספיק. כאשר עומק אקונומיקה ≥90, לאסוף נתונים, לצורך ניתוחם עם תמונה עיבוד תוכנית, תוכנית גיליון אלקטרוני (טבלה של חומרים).
      הערה: כאשר הסחף של ALIS ≥ 3 מיקרומטר, לעצור את הניסוי ולמחוק את הנתונים, כפי זה כמות הסחף תמונה לא יכול להיות מתוקנות על ידי ניתוח עם תוכנת עיבוד תמונה (טבלה של חומרים). כאשר הוא הסחף של ALIS < 3 מיקרומטר, לאסוף את הנתונים עבור ניתוח נתונים עם תמונה עיבוד תוכנית, תוכנית גיליון אלקטרוני (טבלה של חומרים).
    2. איסוף נתונים FRAP מכל 10 מ 10 תאים עם פחות מ-3 מיקרומטר של סחיפה של ALIS. לאחר מכן, להעביר את הקבצים .lsm המטרה מחשב אישי לניתוח נתונים.
  4. ניתוח נתונים בתוכנית עיבוד תמונה
    1. נכונות עבור התמונה להיסחף על ידי יישור או התאמת (קרי, רישום) הערימה של הזמן-סדרת תמונות של רכישת ROI. כדי לעשות זאת, לפתוח כל קובץ .lsm המטרה עם תוכנית עיבוד תמונה (טבלה של חומרים), ולאחר מכן בחר תוספים | רישום | StackReg | תרגום. בשלב הבא, בחר תוספים | רישום | StackReg | מכניקה של גוף קשיח10.
    2. הגדרת מנהל רועי כדי למדוד את עוצמת האות של האקונומיקה ROI. בחר לנתח | כלים | רועי מנהל. בחרו בכלי אליפסה , ואז לצייר עיגול ב האקונומיקה רועי בקוטר של 10 פיקסלים ולאחר מכן לחץ על לחצן הוסף .
    3. הגדרת מנהל רועי כדי למדוד את עוצמת האות של הפקד ROI. במנהל רועי, בחר בכלי מלבן , ואז לצייר ריבוע של 20 x 20 פיקסלים באזור רועי הבקרה ולאחר מכן לחץ על לחצן הוסף .
    4. הגדרת מנהל רועי כדי למדוד את עוצמת האות ברקע של רועי. במנהל רועי, בחר בכלי מלבן , לצייר ריבוע של 20 x 20 פיקסלים באזור רועי רקע ולאחר מכן לחץ על לחצן הוסף .
    5. שנה את ROIs. לאחר הוספת את ROIs שינותח במנהל רועי, לשנות את שמם אקונומיקה רועי, רועי שליטה, על רקע ההשקעה בהתאם.
    6. מידה עוצמת האות ב ROIs. לבחור אקונומיקה רועי, רועי שליטהעל רקע רועי, ולאחר מכן בחר יותר | ריבוי אמצעי. ודא כי למדוד את כל הפרוסות 35 ו שורה אחת לכל פרוסה שנבחרו. בחלון המידות להגדיר , ודא כי רק מתכוון וערך אפור נבחרה.
      הערה: אלה הנתונים הגולמיים FRAP (איור 1B).
    7. הדבק את התוצאות לתוכנית של גליון נתונים (טבלה של חומרים). לשלוט עותק האקונומיקה רועי, רועי, עוצמת אות רועי רקע תוצאות ואז להדביק אותם על עמודות הנקרא מלבין רועי, רועי שליטה, רקע רועי, בהתאמה בתוכנית גיליון אלקטרוני (טבלה של חומרים).
  5. ניתוח נתונים בתוכנית גיליון אלקטרוני
    1. רקע-לתקן עוצמת האות של האקונומיקה רועי ושליטה ROI (איור 1א, ג). השתמש בכלי הוספת פונקציה בתוכנית גיליון אלקטרוני (טבלה של חומרים) כדי להפחית את הערכים בעמודה בשם רועי רקע מתוך הערכים בעמודה בשם רועי אקונומיקה. להחסיר את הערכים בעמודה שכותרתו רועי רקע מתוך הערכים בעמודה שכותרתו שליטה ROI. תווית עמודות חדשות אלה תוקנו רועי אקונומיקה על ההשקעה שליטה מתוקן.
    2. לנרמל את האות ב האקונומיקה רועי לאות מתוקן-הרקע של הפקד ROI (איור 1א', ד). השתמש בפונקציה להוסיף בתוכנית גיליון אלקטרוני (טבלה של חומרים) כדי לחלק את הערכים בעמודה שכותרתו מתוקן רועי אקונומיקה לפי הערכים שבעמודה שכותרתו מתוקן רועי שליטה. תווית עמודה חדשה זו רועי אקונומיקה של תיקן מנורמל.
    3. לנרמל את אות העמודה רועי אקונומיקה של תיקן מנורמל הממוצע של הערכים prebleach 5 האקונומיקה ROI (איור 1א', E). חישוב הממוצע של הערכים prebleach 5 האקונומיקה ROI. בשלב הבא, לחלק את הערכים בעמודה תווית רועי אקונומיקה של תיקן מנורמל באמצעות הממוצע של הערכים prebleach 5 האקונומיקה ROI. תווית עמודה חדשה זו מנורמל מתוקן Prebleach הממוצע אקונומיקה רועי.
  6. שבר נייד ואת המחצית של שחזור נתונים עקומת-מצויד
    1. עקומת התאמה הנתונים רועי מנורמל, המתוקן אקונומיקה באמצעות תוכנית עיבוד תמונה (טבלה של חומרים). בתוכנית עיבוד הדמיה (טבלה של חומרים), בחר נתח | כלים | עקומת התאמה. עותק postbleach מנורמל, תיקן את ערכי הזמן המתאים, וערכים של רועי אקונומיקה ואז להדביק אותם החלון יותר כוסית עקומה . בחר שחזור מעריכי מתוך התפריט הנפתח יותר כוסית עקומת ולאחר מכן בחר מתאים.
    2. לחשב את Mf מן הפרמטרים של הפונקציה שחזור, אשר מספק ערכים עבור: 'a,' שבר מתאוששת לאט; 'b', קצב ההחלמה; 'c', שבריר באמצעי במהירות. חישוב Mf על-ידי חיבור הערכים עבור 'a' ו 'c' לתוך משוואת Mf = + ג לחשב אתf באמצעות המשוואה אניf = 1 - Mf. לחשב t½ על ידי החלפת הערך עבור 'b' לתוך המשוואה figure-protocol-17490 ואז פתרון עבור t1/2. 11

תוצאות

המוצגות כאן הן התוצאות של ניסוי טיפוסי שבו השתמשנו FRAP לבחון את מידת הניידות של p62 ב- ALIS בתאים RAW264.7 מטופלים עם LPS h 3-512. איור 3 א מציג הנתונים הגולמיים המתקבל מלבין, לשלוט, רקע רועי לאחר הערימה של תמונות היו מיושרים כדי לתקן עבור כמויות קטנות (< ~ 3 מיקרומטר) של התמונה סחיפה של ALIS. קרינה פלואורסצנטית YFP-p62 ב- ALIS הזה ב prebleach ו postbleach מוצג באיור 3E ו- 1 וידאו משלימים. איור 3 B מראה נתונים אלה לאחר תיקון רקע. איור 3 ג מראה נתונים אלה לאחר תיקון עבור קרינה פלואורסצנטית בפקד ROI. איור 3 D מציגה נתונים אלה מנורמל ל פלורסצנטיות הממוצע של הערכים prebleach 5 האקונומיקה רועי. די בניסוי זה היה מידת הלבנה (אקונומיקה עומק = 91.94). קרינה פלואורסצנטית YFP-p62 בתוך זה ALIS התאושש לאט, כמו t1/2 = 128.27 s (2.14 דקות). YFP-p62 לא היה חלבון מאד ניידים בניסוי זה, כמו Mf = 21.97 ואניf = 78.03.

figure-results-1238
איור 1 : דיאגרמה של תא RAW264.7 והשלבים לניתוח תמונה אחרי הדימויים FRAP מיושרים לתיקון התמונה הסחף של ALIS. (א) תרשים של תא RAW264.7 המתארים ALIS מספר אקונומיקה, שליטה לבין הרקע ROIs בתוך הרכישה ROI. (B) תיאור אידאלית של raw FRAP נתונים להשיג מלבין, שליטה ורקע ROIs בלוח א (ג) של גרף אידאלית של הנתונים הגולמיים FRAP כי כבר תוקנו-רקע. (ד) גרף אידאלית מתוקן-רקע FRAP נתונים נרמלו כדי קרינה פלואורסצנטית בפקד רועי. (E) אידאלית גרף נתונים FRAP מנורמל והיא תוקנה-רקע נרמלו זריחה prebleach ב האקונומיקה ROI. קיצורים: Con = שליטה; BG = רקע. איור זה שונה מ- Rabut ו- ellenberg החוקרים למסקנה4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2273
איור 2: תמונות של ממשק המשתמש לתוכנה AIM (טבלה של חומרים) לבחירה לייזר, קרן נתיב, ותצורה של התמונה פרמטרים רכישה עבור הניסויים FRAP. (א) לייזר לשלוט המסך מציג את ארגון/2 קווי לייזר, פלט ו- tube הנוכחי השתמש. תצורה (B) שולטים המסך מציג את הקרן הפיצול, פליטה לסנן מההגדרות שנעשה בהן שימוש. (ג) סריקה לשלוט המסך מציג את ההגדרה המשמש עבור ייבוא תמונות. סריקה (D) לשלוט על המסך מציג את חריר, גלאי רווח, היסט מגבר, מגבר רווח והגדרות שידור עבור שורת 514 ארגון/2 ננומטר לייזר. (E) סדרת זמן לשלוט המסך מציג את הזמן בסדרה ההגדרות המשמשות. מלבין (F) לשלוט המסך מציג את prebleach ואת postbleach פרמטרים שנעשה בהם שימוש. קיצורים: HFT = הופט Farb פקידה (ספליטר ראשי קרן ודיקרואיק זוהר); NT1 = Neben Farb פקידה 1 (ודיקרואיק זוהר הראשון משני לשגר הפיצול); NT2 = Neben-Farb-פקידה-2 (הפיצול השני משני קרן ודיקרואיק זוהר); EF = מסנן פליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3535
איור 3 : ניסוי FRAP נציג בחקר דינמיקה YFP-p62 ב- ALIS בתאים RAW264.7. (א) זריחה Raw נתונים בעוצמה אקונומיקה, שליטה של רקע ROI. (B) כי הנתונים שניתנו בלוח A אחרי מלבין ושליטה רועי היה תוקנה על ידי קרינה פלואורסצנטית ברקע רועי. (ג) כי הנתונים שניתנו פאנלים A ו- B לאחר נרמול עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב האקונומיקה רואי חשבון עבור קרינה פלואורסצנטית בפקד מתוקן-רקע ROI. (יח) כי הנתונים שניתנו פאנלים A-C לאחר נרמול עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב מנורמל והיא תוקנה-רקע המלבין רועי לממוצע של הערכים prebleach קודם 5 האקונומיקה ROI. Mf = 21.97, אניf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (דקות 2.14) ועומק אקונומיקה = 91.94. (E) תמונה של ALIS prebleach (1.5 דקות), postbleach (0, 6 ו- 16 דקות). סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר, תקף עבור כל לוחות. קיצורים: Con = שליטה; BG = רקע; קור = תיקן; . נורם. = מנורמל; ממוצע = average. איור זה שונה מקייב ואח12אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4837
1 וידאו משלימים: ALIS טיפוסי ב macrophage RAW264.7 לפני ואחרי photobleaching. קרינה YFP-p62 פלואורסצנטית איטי להתאושש לאחר photobleach; לפיכך, p62 הוא לא חלבון מאד ניידים. עבור ניסוי זה, Mf = 25.62, אניf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7.38 דקות) ועומק אקונומיקה = 90.19. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. וידאו זה שונתה קייב ואח12אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

Discussion

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, מעשיים, פשוטים FRAP ניסויים עם תאים חיים. בזאת, הפרוטוקול שימש כדי למדוד את הניידות של YFP-p62 ב- ALIS ב מקרופאגים RAW264.7, אבל זה יכול להיות מיושם רבים של הלייזר סריקת מערכות מיקרוסקופ קונפוקלי גנטית המקודדים חלבונים פלורסנט זמינים כעת. עבור כל מערכת מיקרוסקופ, טייס הניסויים הם קריטיים עבור קביעת פרמטרים FRAP אופטימליים, כולל רכישה, אקונומיקה, ומידות שליטה רועי, עוצמת לייזר photobleaching, ייבוא תמונות prebleach ו- postbleach. סביר לצפות פרמטרים FRAP אופטימליים כדי להיות שונה עבור כל מקודדים גנטית פלורסנט חלבון ותא קו.

גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת עריכת ניסוי FRAP כוללים (א) להשגת מתאימים אקונומיקה עומק, (ב) השימוש צעד הלבנת קצרה, postbleach (ג) דבר המאפשר זמן מספיק כדי לבחון את תפקוד החלמה מלאה, יעילות (ד) photobleaching, (ה). cytotoxicity עם חוזרות FRAP, (נ) ההכללה של פקד עבור אובדן פלורסצנטיות עקב הדמיה חוזרות ונשנות. אנו ממליצים כי אקונומיקה עומק, אשר יכול להיות מחושב על פי המשוואה המפורטת בסעיף 3.3.1, להיות ≥9013. כאשר הוא מלבין עומק < 90, מידת ההתאוששות זריחה postbleach לזלזל, ואת הערכים של אניf, Mf, ו- t1/2 יהיו שגויים. למרות משך ועוצמת פעימות לייזר בתדר אקונומיקה עשויים להשתנות בין ניסויים FRAP, חשוב כי הצעד photobleaching להיות קצר ומהיר באופן משמעותי יותר מאשר הפונקציה שחזור זריחה. אם לא, אז כמות משמעותית של קרינה פלואורסצנטית שחזור יכול להתרחש במהלך השלב הלבנת. עם זמן ארוך מלבין, קרינה פלואורסצנטית שחזור במהלך השלב הלבנת לא ניתן למדוד ולאחר שזה יוביל מדידות שגויות של אניf, Mf, ו-t1/2. בנוסף, כדי להשיג את הערכים הנכונים עבור אניf, Mf, ו-t1/2, רכישת רועי להתייחס postbleach עד רמת קרינה פלואורסצנטית האקונומיקה רועי הגיע מישור. לדוגמה, בניסויים שלנו FRAP, לא היה הבדל בין ה-אניf, Mfו- t1/2 ערכים כאשר הבחנו פלורסצנטיות YFP-p62 ב האקונומיקה רועי 32.2 דקות postbleach לעומת כאשר הבחנו YFP-p62 ב האקונומיקה ROI עבור מין נמצא 15.1 postbleach; לפיכך, הגענו למסקנה כי הפונקציה שחזור הגיעו מישור דקות נמצא 15.1 postbleach12. לגבי יעילות photobleaching, photobleaching עולה עם הריבוע של מקדם זום אופטי14. לפיכך, שימוש בעדשות זום אופטי גבוה היא חיובית על photobleaching המהירה אבל יכול לגרום photobleaching לא רצויה במהלך הרכישה; האחרון יכול להיות אחראים על ידי הדמיה פקד ROI. Photobleaching חוזרות היא להימנע ככל זה יכול להוביל הדור של מינים חמצן תגובתי ציטוטוקסיות (ROS). עם זאת, מידת ROS דור עקב חשיפה לייזר בעוצמה גבוהה הוא נמוך יותר עבור חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית מאשר כימי fluorophores (למשל, נוגדנים פלורסנט)15, האבחון שנוצר נוטים יותר להגיב בתוך גנטית פלורסנט החלבונים המקודדים מאשר עם מולקולות אחרות התא4. בנוסף ההסתברות גדלה של יצירת ROS ציטוטוקסיות, photobleaching חוזרות היא ניזונה גם ככה קשה לשלוט. בסופו של דבר, למרות שידור נמוכה לייזר משמש כדי לרכוש כל התמונות ללא אקונומיקה, כמה photobleaching תמיד יתרחשו, אשר חייבים להיות מבוקרים. פקדים אפשרי בשביל זה כוללים ניטור קרינה פלואורסצנטית בפקד ROI במסגרת הרכישה, רועי, קבלת תמונות בקרה בתא מולבן שכנות, ביצוע בקרת ניסויים עם ההגדרות זהים לאלה המשמשים ניסויים photobleaching אבל בלי האירוע photobleaching.

Disclosures

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ד ר סת Robia אוניברסיטת לויולה שיקגו על הערותיו יקר על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט 1R01NS073967-01A1 כדי ג'ואנה ג Bakowska.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle MediumHycloneSH30022.01High Glucose (4.5 g/L)
Fetal bovine serumGemini Bio-Products100-106
Glass bottom dishesMatTekP35G-1.5-14-C35 mm
ImageJ softwareNational Institutes of HealthN.A.
Lipopolysaccharide (LPS)SigmaL4391
NocodazoleSigmaM1404
Penicillin-streptomycin solutionCorning30-002-Cl100×
Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil objectiveCarl Zeiss MicroImaging, Inc4407629904000000
Polyethylenimine (PEI)Polysciences23966-1linear (MW 25,000)
RAW 264.7 murine macrophagesATCCTIB-71
Zeiss confocal microscopeCarl Zeiss MicroImaging, IncLSM 510

References

  1. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  2. Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).
  3. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).
  4. Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).
  5. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  6. Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells. Methods. 37 (2), 154-164 (2005).
  7. Hildick, K. L., Gonzàlez-Gonzàlez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).
  8. Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. Photobleaching assays (FRAP & FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).
  9. Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons. Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).
  10. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  11. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  12. Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).
  13. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery. Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).
  14. Centonze, V., Pawley, J. Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen. Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).
  15. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145 photobleachingFRAPp62sequestosome 1aggresome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved