לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה לdecellularization והיווצרות הידרוג'ל עוקבות אחר הקרנה של שומן החלב של מורלין לאחר ההקרנה vivo ex.

Abstract

קרינה היא טיפול עבור חולים עם סרטן שד שלילי משולשת. ההשפעה של הקרינה על מטריצה החילוץ (ECM) של רקמת השד בריא תפקידה בהישנות המקומי באתר הגידול העיקרי אינם ידועים. כאן אנו מציגים שיטה לdecellularization, ליטוטיזציה ולייצור של הידרוג ECM הנגזרים מרפידות שומן החלב של מורלין. תוצאות מוצגות על האפקטיביות של התהליך decellularization, ופרמטרים rheological העריכו. GFP-ו לוציפראז-התווית תאים סרטן השד כדוריות בהידרוג הפגינו גידול התפשטות של הידרוג הוקרן. לבסוף, phalloidin כתמים המשלים היה מועסק להמחיש את הארגון השלד של תאים סרטניים כימוס. המטרה שלנו היא להציג שיטה עבור בדיית הידרולים עבור מחקר מתורבת המחקים את הסביבה רקמת השד vivo התגובה שלה קרינה על מנת ללמוד התנהגות תא הגידול.

Introduction

סרטן מאופיין התפשטות עודפת של תאים שיכולים להתחמק אפופטוזיס וגם גרורות לאתרים מרוחקים¹. סרטן השד היא אחת הצורות הנפוצות ביותר בקרב הנקבות בארה ב, עם מוערך 266,000 מקרים חדשים ו 40,000 מקרי מוות ב 2018². אגרסיבי במיוחד וקשה לטיפול סוג המשנה הוא סרטן שד שלילי משולשת (TNBC), אשר חסר קולטן אסטרוגן (ER), קולטן פרוגסטרון (PR), ואת גורם הצמיחה באפידרמיס האנושית (HER2). טיפול בהקרנות משמש בדרך כלל בסרטן השד כדי למנוע תאים סרטניים שיורית בעקבות כריתת גוש, אבל מעל 13% מהחולים TNBC עדיין לחוות הישנות באתר הגידול העיקרי³.

ידוע כי טיפול בהקרנות יעיל ב גרורות והישנות משום שילוב של כריתת הגוש ותוצאות הקרינה באותה הישרדות לטווח ארוך כמו כריתת שד⁴. עם זאת, הוא הוכח לאחרונה כי הטיפול בקרינה קשורה הישנות מקומית לאתר הגידול העיקרי בהגדרות החיסונית^5,6. כמו כן, ידוע כי הקרינה משנה את מטריצה החילוץ (ECM) של רקמות נורמליות על ידי גרימת פיברוזיס⁷. לכן, חשוב להבין את התפקיד של שינויי קרינה ECM המושרה בכתיב התנהגות תא הגידול.

Decellularized רקמות שימשו מודלים מבחנה ללמוד מחלה^8,9. הרקמות הdecellularized האלה שומרות על הלחנה של ECM ומכואיאת הקומפלקס בvivo ECM. זה decellularized רקמת ecm יכול להיות נוסף מעובד מתעכל לטופס מחודשת ידרו ecm הידרוג שיכול לשמש כדי ללמוד צמיחת תאים פונקציה^10,11. לדוגמה, הידרוג זריקות המופק decellularized ליפוף האדם ומרקמת שריר הלב שימש שיטות שאינן פולשני של הנדסת רקמות, ו הידרוג'ל נגזר רקמת ריאות חזירי היה מנוצל כשיטת מחוץ גופית של בדיקות תא גזע של mesenchymal המצורף והכדאיות^12,13,14. ההשפעה של נזק לקרינה נורמלית רקמות על מאפייני ECM, עם זאת, לא נחקרו.

הידרולים הנגזרים מ-ECM יש את הפוטנציאל הגדול ביותר לחקר מבחנה בתופעות vivo. כמה חומרים אחרים נחקרו, כולל קולגן, פיברומין, ו מטריצות, אבל קשה לעשות בצורה מלאכותית את הרכב של ECM¹³. יתרון של שימוש ב-ecm הידרוג נגזר הוא כי ecm מכיל את החלבונים הדרושים וגורמי גדילה עבור רקמה מסוימת^14,15. הקרנה של רקמה נורמלית במהלך כריתת הגוש גורמת לשינויים משמעותיים ב-ECM, וניתן להשתמש בהידרוג הנגזר של ECM כדי ללמוד את האפקט הזה באופן מתורבת. שיטה זו יכולה להוביל ליותר מורכב ומדויק יותר במודלים של מחלות חוץ-גופית.

במחקר זה, אנו חשופים שומן החלב מורטין רפידות (MFPs) כדי קרינה ex vivo. MFPs היו decellularized והפכו לפתרון טרום ג'ל. הידרולים הוקמה עם תאים 4T1 מוטבע, קו תא מוראן TNBC. התכונות הרטיאוולוגיות של חומר ההידרוג'ל נבדקו, והדינמיקה של תאי הגידול הוערכו בתוך ההידרוג'לים. הידרולים המציא התפשטות MFPs לקרינה משופרת תא הגידול. מחקרים עתידיים לשלב סוגי תאים אחרים כדי ללמוד אינטראקציות תא תאים בהקשר של הישנות סרטן בעקבות הטיפול.

Protocol

לימודי בעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ואנדרבילט.

1. הכנה והקרנה vivo ex של MFPs

1. הקריבו עכברים Nu/Nu (8 – 10 שבועות) באמצעות שיתוף₂ חנק ואחריו פריקה צוואר הרחם.
2. לנקות את העור באמצעות 70% אתנול.
3. לאסוף רפידות שומן החלב (MFPs) מפני עכברים הוקרב באמצעות מספריים טרום מעוקר ומלקחיים בצינור 15 מ ל חרוט המכיל מדיה RPMI מלאה (RPMI שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-10% סרום בקר עוברי) (לראות את הטבלה של חומרים ).
4. הקרינים דגימות ל-20 Gy באמצעות מקור צסיום.
5. להביא את mfps לקרינה ומדיה מלאה RPMI לתוך הקבינט אבטחה טיחות. התקשורת תהיה תלויה בקו התאים כדי לגדול בהידרוג'ל הסופי. מילוי 6 ס"מ או 10 ס מ מנות עם מספיק מדיה כדי להטביע את MFPs. בעבור 6 ס"מ מנות, להשתמש 8 מ ל של מדיה, ו עבור 10 ס"מ מנות, להשתמש 20 מ ל של מדיה.
6. דגירה של 37 ° c/5% בחממה₂ במשך יומיים. ניתן לכוונן את משך הזמן בחממה.
7. לשטוף את הרקמות בתמיסת מלח מתכלה (PBS), למחוק לחות עודפים, ומקום MFPs לתוך 15 מ"ל שפופרות חרוט לאחסון ב-80 ° c עד decellularization. שלב קפוא זה מסייע לשלב הdecellularization והמדגם צריך להיות מוקפא גם אם הצעדים הבאים מוכנים אחרת.

2. Decellularization (מותאם להפניות^12,16,17)

הערה: הליך זה הותאם משיטות שפורסמו בעבר התמקדו באדיפוז decellularization, שכללה את חומר הניקוי היוני של הנתרן במקום נתרן dodecyl סולפט כדי להסיר דנ א ביעילות^{12,16 ,} . ^{שבע עשרה}

1. ביום 1, להסיר mfps קפוא מ-80 ° c ולהפשיר בטמפרטורת החדר.
2. לאחר הופכה, היבש MFPs בקצרה על מחיקה משימה עדינה. שוקלים את MFPs באמצעות קנה מידה אנליטי.
3. באמצעות זוג מלקחיים עם מספריים או אזמל, לחלק רקמות עד 3 מ"מ x 3 מ"מ x 3 מ"מ דגימות למחקר של ECM שלם ואת הרקמה הנותרת לייצור הידרוג'ל.
   הערה: מספר הדגימות תלוי במספר שיטות הבדיקה, לדוגמה, אוסף של שתי דגימות מתואר להלן: אחד להטבעת פרפין (שלב 2.5) ואחד להקפאה במדיום הטבעה קריוסטט, אם תרצה (ראה את רשימת החומרים וצעד 2.6).
4. . שוקלים את הרקמות במקרה של הטבעה בפרפין, המשיכו לשלב 2.5. אם הקפאה בהקפאה הטבעה בינונית לצורך שיבוץ, המשך לשלב 2.6.
5. בכיפה כימית, יש לטבול את הרקמה ב-10% (NBF) (לראות את טבלת החומרים) במשך 24 שעות ב -4 ° c. לרחוץ 3 פעמים ב-PBS עבור 5 דקות כל אחד. השקיעו את הרקמה ב -30% סוכרוז תמורת 48 h ב -4 ° c.
   1. שוקלים את הרקמה עכשיו. שהפיסה הזו הוסרה . המשך לצעוד 2.6
6. בשכונה כימית, מקום חתיכות MFP בקלטת עם תוויות הכין מדיום הטבעה קריוסטט. הוסף עוד בינוני הטבעה קריוסטט כדי לכסות את הרקמה.
   1. מניחים את הקלטת לתוך גביע של 2-מתילבוטאן (לראות את הטבלה של חומרים) כי הוא מקורר מראש עם חנקן נוזלי. הגביע צריך מספיק 2-מתילבוטאן לכסות את החלק התחתון, אבל לא מספיק כדי להטביע את הקלטת כי מדיום הטבעה קריוסטט לא צריך לגעת 2-מתילבוטאן. תן את הקלטת לשבת 2-מתילבוטאן עד מדיום הטבעה קריוסטט קופא והופך אטום.
   2. עטוף את הקלטות בנייר הכסף, התווית והשאר ב-80 ° צ' עד שהוא משמש לסיכום.
      הערה: הרקמות ממוקמות מיד במדיום הטבעה של קריוסטט היו מנות ב 5 יקרומטר בעוד רקמות מודבטים בסוכרוז היו מנות ב 30 יקרומטר כדי לשמור על מורפולוגיה אדיפוציטוטה.
7. השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה הנותרת.
   הערה: חתיכות רקמה ניתן למקם גם ב 10% NBF עבור 24 – 48 h, שטף ב-PBS, ועזב ב 70% אתנול עד הטבעה פרפין. בעקבות הטבעה, 5 מקטעי יקרומטר ניתן להשתמש עבור המטאוקסילין ו אאוזין (H & E) כתמים (ראה סעיף 7 להלן).
8. מניחים את MFPs ב 6 מנות ס מ עם 5 מ"ל 0.02% טריפסין/0.05% הפתרון EDTA. מריסת ב37 מעלות צלזיוס עבור 1 h רסס ונגב את הכלים עם 70% אתנול לפני הצבת בחממה.
9. השתמש 0.7 מ"מ משתמשים כדי לשטוף את MFPs עם מים מוכי (די) על ידי שפיכת מים על הרקמה שלוש פעמים. השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה בין שוטף.
10. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. מניחים רקמות בגביע שלפני-אוטוקלאוד המכיל בר מהומה בגודל כראוי. לכסות את הרקמות עם 60 mL של 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (לראות את הטבלה של חומרים) עבור 1 גרם של רקמה ומערבבים עבור 1 h בטמפרטורת החדר. השתמש במינימום של 20 מ ל.
11. להשליך את הרקמה. והתכולה לתוך מסננת לשטוף את הגביע עם די מים ולשפוך על רקמות. . אני חוזר עוד פעמיים השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה בין rinses.
12. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. מניחים רקמות ומערבבים בחזרה באותם כוסות, ומכסים עם 60 mL של 4% חומצה deoxycholic לכל 1 גרם של רקמה. מערבבים 1 h בטמפרטורת החדר. השתמש במינימום של 20 מ ל.
13. השלכת רקמות ותוכן לתוך מסננת שינוי. לשטוף את הגביע עם מים DI ולשפוך על רקמות. . אני חוזר עוד פעמיים השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה בין rinses.
14. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל.
15. מניחים רקמות בגביע אותו עם מים טריים שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין. מכסים בחוזקה את סרט הפרפין. השאירו את הלילה ב -4 ° c.
16. שטוף מכוניות וספלים לשימוש למחרת.
17. ביום השני, לנקז את התוכן במבחנה לתוך מסננת. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל.
18. מקום MFPs בגביע זהה עם בר המהומה בגודל כראוי. כיסוי עם 60 mL 4% אתנול/0.1% מהחומצה peracetic פתרון לכל 1 גרם של רקמה. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
19. מזבלה רקמה ותוכן לתוך מסננת 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה. . הציבו את התוכן בחזרה לגביע לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי אותו עם 60 mL של 1x PBS עבור 1 גרם של רקמה. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. . חזור על זה פעם אחת
20. מזבלה רקמה ותוכן לתוך מסננת 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה. הציבו את התוכן בחזרה לגביע. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 mL DI מים עבור 1 גרם של רקמה. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. . חזור על זה פעם אחת
21. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. להשליך את הרקמה. והתכולה לתוך מסננת השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה.
22. הציבו את התוכן בחזרה לגביע. לכסות את הרקמות עם 60 mL של 100% n-propanol per 1 g של רקמות. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים 1 h בטמפרטורת החדר.
23. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. מזבלה רקמה ותוכן לתוך מסננת 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה.
24. הציבו את התוכן בחזרה לגביע. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי אותו עם 60 mL של מים DI 1 g של רקמה. השתמש במינימום של 20 מ ל. מערבבים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. . חזור שלוש פעמים
25. להשליך את הרקמה. והתכולה לתוך מסננת חזור על שלבים 2.3 – 2.6 כדי לאסוף פיסות של רקמה עבור סוכות הדגירה והקפאת בינונית הטבעה קריוסטט.
26. רקמת יבש לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ושוקל. מניחים בשפופרת בעלת תווית של 15 מ ל. להקפיא ב-80 ° c בלילה.

3. ליזוזציה

1. הסירו את 15 הצינורות מ-80 ° c ומניחים על קרח יבש. שמרו דגימות קפואות על קרח יבש עד לליאופליזר.
2. הסר כובעים. השתמש בגומייה כדי לחבר משימה עדינה למחוק למעלה כדי לכסות את הפתח. שימו דגימות על הליאופליזר. לפחות יומיים
3. הסירו דגימות מהליאופליזר והניחו צינורות על קרח יבש. להסיר מגבונים משימה עדינים שוקל כל דוגמה בקנה מידה אנליטי. הצמד כמוסות ומקום בשעה-80 ° c בלילה.

4. כרסום

1. ממלאים מיכל רדוד עם חנקן נוזלי. להסיר דגימות ממקפיא-80 ° c. שוקלים כל היתר.
2. מניחים דגימה אחת בחומר המליטה. השתמש בכפפות קריוגניים. כדי להחזיק את חומר המליטה בחנקן הנוזלי
3. השתמש בסחוס המחובר למקדח ידני כדי לטחנת את המדגם. מיל ב 1 דקות מרווחי לבדוק את ההתקדמות ולהסיר יד כדורית מחנקן נוזלי. מיל למינימום של 5 דקות.
4. חזור על כל הדגימות. רסס ונגב את חומרי המליטה והזיפים באתנול בין כל דוגמא.
5. לאחסן דגימות אבקה בתוך 15 שפופרות mL ב-80 ° c עד מוכן לשימוש.
   הערה: ניתן להשתמש בדגימות באופן מיידי או מאוחסן בין לילה.

5. מערך הידרוג'ל

1. אם מאוחסן ב-80 ° c בלילה, להסיר ולהפשיר בטמפרטורת החדר. בעוד הפשרה, לחשב את המשקל הדרוש של פפסין (לראות את הטבלה של חומרים) ואת נפח של חומצה הידרוכלורית (HCl) הדרושים עבור כל מדגם שתוצאתו פתרון עם 1% w/v לדוגמה אבקה ו 0.1% w/v פפסין ב 0.01 מ ' hcl. מוסיפים את הפנסין ל-hcl כדי ליצור פתרון של הפנסין-HCl.
2. הוסף אבקת דגימה ופתרון pepsin-HCl לשפופרת של 15 מ ל. הוסף בר מהומה קטן, ומערבבים עבור 48 h.
3. מניחים את הצינורות על הקרח 5 דקות. לחשב את הנפח הדרוש של 10x PBS הדרושים עבור כל מדגם שתוצאתו פתרון עם ריכוז 1x PBS. הוסף את הנפח המתאים של 10x PBS לכל צינור.
4. הוסף 10% v/v 0.1 M NaOH לכל פתרון כדי להגיע ל-pH 7.4. השתמש בנייר pH כדי לבדוק בנפרד.
   הערה: ניתן לאחסן פתרון ג'ל ב-4 ° צ' לשבוע אחד.

6. תאים Encapsulating בהידרוג'לים

1. שימוש בתאים המסומנים ב-GFP ולוציפראז
   1. באמצעות הפתרון pH 7.4 ג'ל, להשעות מחדש את התאים GFP-ו-לוציפראז-התווית בתאי 4T1 לריכוז של 500,000 או 1,000,000 תאים/mL של תמיסת ג'ל. הוסף 16 μL של פתרון התאים ג'ל לכל באר של שקופית קאמרית של 16 היטב. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.
   2. הוסף 100 μL של מדיית RPMI מלאה לכל טוב. המשך הדגירה עבור 48 h ב 37 ° c. התאים GFP-ו לוציפראז-התוויות ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופ הזריחה ב 0 שעות, 24 שעות, ו 48 שעות לאחר הגגנציה.
      הערה: ניתן למדוד את התפשטות התא עבור התאים GFP-ולוציפראז המסומנים ב-4T1 בשימוש כאן על ידי הוספה (S)-4, 5-Dihydro ידרו-2-(6-הידרוxy-2-בנזוטילקסיל) -4-טיזולקרבוקסילית חומצה אשלגן מלח (לראות את ה וביצוע דימות ביולומינציה באמצעות מערכת דימות ביולומינסנציה (ראה טבלת חומרים). לאחר הדמיה ביולומינסנציה, שלד התא יכול להיות דמיינו (ראה סעיף 10).
2. שימוש בתאים ללא תווית
   1. באמצעות הפתרון pH 7.4 ג'ל, להשהות מחדש את התאים 4T1 בלתי מסומן לריכוז של 500,000 או 1,000,000 תאים/mL של תמיסת ג'ל. הוסף 16 μL של פתרון התאים ג'ל לכל באר של 16-היטב שקופית קאמרית וצלחת 96-באר. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c.
   2. הוסף 100 μL של מדיה לכל באר. המשך הדגירה עבור 48 h ב 37 ° c.
      הערה: ניתן למדוד את הכדאיות של התא (ראה סעיף 11). ניתן להשתמש בשקופית הקאמרית של 16 היטב לדימות, והצלחת 96-באר יכולה לשמש לשימוש בקוונפיקציה.

7. H & E צביעת

1. עבור formalin-קבוע, פרפין רקמה מוטבעת, לטבול שקופיות המכיל 5 יקרומטר סעיפים פעמיים ב 100% קסילין (5-10 דקות) עבור דה-פראפיזציה. מימה מחדש על ידי מיזוג משנה ב 100%, 95%, 85%, ו 70% אתנול עבור 5 דקות כל אחד ואחריו די מים עבור 5 דקות. המשך לשלב 7.6.
2. עבור מקטעי רקמות קפואים, לקחת סעיפים מיד ממקפיא לטבול אותם ב 10% NBF עבור 10 דקות. לשטוף ב-1x PBS שלוש פעמים עבור 5 דקות כל אחד. לשטוף במים עבור 5 דקות.
3. כתמים של גרעינים עם המטאוקסילין במשך 3 דקות. לשטוף את הריצה מי ברז.
4. להבדיל על ידי טבילה 1 – 2 פעמים ב 0.3% חומצת אלכוהול (0.3% HCl ב 70% אתנול). לשטוף את הריצה מי ברז עבור 5 דקות.
5. הוסף סוכן בלובינג עבור 30 s. לשטוף את הריצה מים הברז עבור 5 דקות. לטבול ב 95% אתנול עבור 30 s.
6. מודטה עם אאוזין עבור 90 s בטמפרטורת החדר. הדמיים ב 3 שינויים של 100% אתנול עבור 5 דקות כל אחד.
7. הטבול פעמיים ב 100% קסילן עבור 5 דקות כל אחד. הוסף את המדיה הDPX0 לשקופית והוסף שמיכות. תן לזה לרפא לילה לפני הדמיה.

8.1-([4-(xylyzo) "אזו" -2-נפתלי מכתים

1. להכין 1-([4-(Xylyzo) מגרד] אזו -2-פתרון נפתלי.
   1. להוסיף 0.5 g של 1-([4-(Xylyzo) xylyl] אזו) -2-מאבקה לגביע עם 100 mL פרופילן גליקול. חום ל-95 – 100 ° צ' תוך כדי ערבוב לפחות 30 דקות. מניעת הטמפרטורה עולה על 100 ° c.
   2. להסיר את הגביע מהחום ולאפשר קריר מעט. שופכים פתרון דרך נייר כיתה 4 מסנן איכותי כדי להסיר את כל החלקיקים שיורית.
      הערה: ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר ויש לסנן דרך מסנן מזרק 0.45 יקרומטר מיד לפני הצביעת.
2. . כתם של חתכים קפואים
   1. הסרת שקופיות מ-80 ° c מקפיא ואוויר יבש עבור 30 דקות. לפני מגניב 10% NBF ב-20 ° c עבור 30 דקות בצנצנת Coplin. תקן את השקופיות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. שטוף במים די 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד.
   2. להסיר את המים העודפים באמצעות ניגוב משימה עדינה לפני הפרופילן גליקול 2 פעמים עבור 5 דקות כל אחד. הסר שקופיות מפרופילן גליקול. אין לשטוף.
   3. מניחים שקופיות לתוך מזרק מסוננים שמן אדום כתמים הפתרון עבור 3 h בטמפרטורת החדר.
   4. להבדיל על ידי הצבת שקופיות ב 85% פרופילן גליקול עבור 5 דקות. לשטוף דגימות ב-PBS פעמיים עבור 5 דקות כל אחד.
   5. דגימות מכתמים עם המטאוקסילין. במשך 30 שנות לשטוף את הריצה מי ברז עבור 5 דקות ולאחר מכן למקם את השקופיות ב-DI מים.
   6. דוגמאות מטען באמצעות בינוני מימית מבוסס הרכבה ולאפשר מדיה יבש לילה לפני הדמיה.

9. ראולוגיה

1. הביאו פתרונות קדם-ג'ל משלב 5.4 למטר הקרח.
2. הצמדת זרוע וצלחת של 25 מ"מ למשטח הזכוכית. פתח את תוכנת ה-rheology במחשב המחובר לרטימטר.
3. לבצע מיפוי הסיבוב ולקבוע את הפער אפס. . הרם את היד כשאתה מסיים
4. פיפטה 500 μL של ג'ל מקדים על הצלחת. הנמך את היד עד שהפתרון שלפני ג'ל תופס לחלוטין את הפער בין הצלחת לבין הזרוע. שיהיה שמרני מכיוון שהורדת היד מעבר לנקודה זו תגרום לתמיסת מקדם ג'ל לשפוך מהצד.
5. בצעו סריקת תדר על התמיסה שלפני ג'ל מ-0.1 – 100 Hz לאחר שנותרה ב-37 ° c למשך 30 דקות.
6. הרימו את זרוע הרטימטר. כשאתם מושלמים נגב נוזל עם מחיקת משימה עדינה. לשטוף עם מים די לנגב עם מחיקה עדין משימה. חזור על שלבים 9.4 – 9.6 עם דוגמאות נוספות.

10. פאלודין המשלים כתמים של F-actin

1. הביאו את הפתרון המשלים לטמפרטורת החדר. צנטריפוגה בקצרה במהירות נמוכה לפני הפתיחה. מספיק לפתור את הבעיה ולאחסן את השאר ב-20 ° c.
2. לדלל 1000x phalloidin מניות הפתרון המשלים לפתרון עבודה של 1x על ידי הוספת 1 μL פתרון מלאי 1 mL 1x PBS + 1% בסרום בפרה אלבומין (BSA). זה הופך מספיק עבור 10 בארות (100 μL/ובכן).
   הערה: ניתן להשתמש ברגיל 1x PBS, אבל 1x PBS + BSA הוא המועדף כדי למנוע המשלים phalloidin לדבוק השפופרת. אל תאחסן פתרון זה לאחר השיטת הפעולה. 1 μL של צבע פלורסנט כחול (לראות את הטבלה של חומרים) פתרון עובד ניתן להוסיף כתם עבור גרעינים. פתרון העבודה עשוי להתבצע על ידי ערבוב 1 μL של 20 מ"מ צבע פלורסנט כחול עם 11.3 μL 1x PBS.
3. מנושף מדיה מבארות (שלב 6.1). לשטוף בארות עם 1x PBS.
4. הוסף 10% NBF. בארות הדגירה עם 10% NBF עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. . הסר את הסופרנטאנט לרחוץ 3 פעמים עם PBS עבור 5 דקות בכל פעם.
5. הוסף 0.1% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol ב-PBS במשך 5 דקות. מטפי ורוחץ 3 פעמים עם PBS עבור 5 דקות בכל פעם.
6. הוסף 100 μL של פתרון עבודה משלב 10.2 לכל באר. . מיכל החום בטמפרטורת החדר מטפי ורוחץ 3 פעמים עם PBS עבור 5 דקות בכל פעם. השאר בערוץ הPBS ב -4 ° c.
7. מתיף ומסיר בארות מהאטם. בשקופית הקאמרית השתמש בפינצטה האף המחט כדי להסיר את האטם מהשקופית. הרכבה ודגימות שמיכות באמצעות מימית ההרכבה מבוסס בינוני. אפשר לרפא (5 דקות).
8. להתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית ב עירור/פליטה של 590/618 ננומטר.

11. שיטת הכדאיות

1. שטפו את התאים באמצעות ה-PBS של דולסקו (DPBS). הוסף 100 μL של DPBS המכיל 1 μM calcein AM ו 2 μM אתידיום הומודימר לכל טוב. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. תמונה של 16-היטב שקופית קאמרית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית. הכלב הטוב ביותר (calcein AM) ניתן לצפות ב עירור/פליטה = 494/517 nm. אתידיום הומדימר ניתן לצפות ב עירור/פליטה = 528/645 ננומטר.
3. לקרוא את הצלחת 96-באר על קורא צלחת באמצעות אותם אורכי גל בשלב 11.2.

תוצאות

MFPs היו decellularized בעקבות הקרנה באמצעות ההליך המוצג באיור 1A. MFPs pre-decellularization (איור 1B) ו-post-Decellularization (איור 1b) מוצגים. Decellularization אושרה באמצעות המטאוקסילין ו-אאוזין (H & E) כתמים, ו-1-([4-(Xylylazo) "אזו" -2-נפתלי מכתים שימש להערכת תוכן השומנים (איור 2). תכונו...

Discussion

שיטה זו של יצירת הידרוג'ל תלויה במידה רבה בכמות של הרקמה ההתחלתית. מוריין MFPs הם קטנים, והתהליך הdecellularization מביא לירידה משמעותית בחומר (שולחן 1). התהליך יכול לחזור עם יותר MFPs כדי להגדיל את התשואה הסופית. כרסום הוא צעד חשוב נוסף שעלול לגרום לאובדן החומר. אחרים הראו הצלחה עם טחנת קריוגני...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128	-
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387	-
AR 2000ex Rheometer	TA Instruments	10D4335	rheometer
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G	-
calcein acetoxymethyl (calcein AM)	Molecular Probes, Inc.	C1430	-
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth Chemistry & Biology	L-8820	(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt
DPX Mountant for Histology	Sigma-Aldrich	06522-500ML	-
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133	-
Eosin-Y with Phloxine	Richard-Allan Scientific	71304	eosin
ethidium homodimer	Molecular Probes, Inc.	E1169	ethidium homodimer-1 (EthD-1)
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926-500ML	-
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	aqueous based mounting medium
FreeZone 4.5	Labconco	7751020	lyophilizer
Hoechst 33342 Solution (20 mM)	Thermo Scientific	62249	blue fluorescent dye
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148-500ML	-
IVIS Lumina III	PerkinElmer	CLS136334	bioluminescence imaging system
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500	-
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O0625-25G	1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinder	OPS Diagnostics, LLC	CG-08-02	-
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	-
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887-5G	pepsin
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML	-
Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757)	abcam	ab176757	phalloidin conjugate
Propylene glycol	Sigma-Aldrich	W294004-1KG-K	-
Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent	Richard-Allan Scientific	7301L	bluing agent
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211	-
RPMI Medium 1640	Gibco	11875-093	-
Sodium deoxycholate, 98%	Frontier Scientific	JK559522	deoxycholic acid
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	-
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056	-
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-4	-