ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

Summary

רומן, חיסוני התאמה לניקוי רקמות הרקמה כמו הדמיה 3D האולטימטיבי של איברים הממס נקי לאפשר הדמיה 3D של זיהום המוח וירוס כלבת הסביבה הסלולרית המורכבת שלה. עבה, נוגדן מתויג פרוסות רקמת המוח נעשים שקופים להגדיל את עומק ההדמיה כדי לאפשר ניתוח תלת-ממד על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ.

Abstract

ההדמיה של תהליכי זיהום ברקמות ובאיברים על ידי immunolabeling היא שיטה מרכזית בביולוגיה זיהום מודרני. היכולת להתבונן וללמוד את ההפצה, tropism, שפע של פתוגנים בתוך רקמות האיברים מספק נתונים מרכזי על פיתוח המחלה והתקדמות. באמצעות שיטות מיקרוסקופ קונבנציונאלי, אימונויניום מוגבל בעיקר לחלקים דקים המתקבלים פרפין-מוטבע או מדגמים קפואים. עם זאת, מישור התמונה 2D מוגבל של סעיפים דקים אלה עשוי להוביל לאובדן מידע חיוני על המבנה המורכב של איבר נגוע ההקשר הסלולר של הזיהום. המודרנית multicolor, חיסוני מכתים לניקוי רקמות הרקמה כעת לספק דרך מהירה יחסית וזולה ללמוד בנפח גדול 3D התמונה ערימות של רקמת איבר נגוע וירוס. על-ידי חשיפת הרקמה לממיסים אורגניים, היא הופכת לשקופה בצורה אופטית. זה תואם את מדדי השבירה של המדגם ובסופו של דבר מוביל לירידה משמעותית של פיזור אור. כך, בשילוב עם מטרות ארוכות בטווח העבודה הפנוי, מקטעי רקמות גדולים עד גודל של 1 מ"מ ניתן לתמונה על ידי מיקרוסקופ מיקרוסקופית לייזר קונפוקלית וקד מקובל (clsm) ברזולוציה גבוהה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להחיל הדמיה עמוקה רקמות לאחר ניקוי רקמות כדי להמחיש התפלגות וירוס כלבת במוח נגוע על מנת ללמוד נושאים כמו פתוגנזה וירוס, התפשטות, tropism, והפלישה neuroinvasion

Introduction

טכניקות היסטולוגיה קונבנציונאלי להסתמך בעיקר על חלקים דקים של רקמות איברים, אשר יכול באופן מטבעו לספק רק התובנות 2D לתוך סביבת 3D מורכבת. למרות שניתן לעשות זאת בעיקרון, שחזור תלת-ממדי ממקטעים דקים סדרתיים מחייב קווים טכניים מסוימים לפריסה ולאחר מכן ביישור סיליקו של התמונות הנרכשים¹. יתר על כן, שחזור חלק של כרכים z לאחר חיתוך מיקרוטום הוא קריטי כמו גם ממצאים מכניים וחישוביים יכולים להישאר בגלל רישום התמונה האופטימלי הנגרמת על ידי מטוסי התמונה לא חופפים, וריאציות מכתים, ופיזית , הרס רקמות על ידי. למשל, להב המיקרו-טומה לעומת זאת, חיתוך אופטי טהור של דגימות רקמה עבה שלמים מאפשר רכישה של מטוסי תמונה חופפים (דגימה מראש), ובכך, מקלה על שחזור תלת-ממד. זה, בתורו, מועיל מאוד לניתוח של תהליכים זיהום באוכלוסיות תאים מורכבות (למשל, רשתות נוירואליות בהקשר של התאים גליה המקיפים והחיסונית). עם זאת, מכשולים הטבועה של מקטעי רקמה עבים כוללים פיזור אור חדירה נוגדן מוגבלת לתוך הרקמה. בשנים האחרונות, מגוון של טכניקות פותחה ממוטבת להתגבר על בעיות אלה^{2,3,4,5,6,7,8 ,} מיכל בן ^{10 ,} מיכל ^{עשור ,} מיכל בן ^{11 ,} מיכל ^{בן 12 , 13}. ביסודו של דבר, רקמות היעד הפכו שקופים באופן שקוף על ידי טיפול עם מימית^{2,3,4,5,6,7 ,8,9} או אורגני מבוסס הממס^10,11,12,13 פתרונות. המבוא של 3disco (3disco הדמיה של איברים הממס נקי)^11,12 ו udisco העוקבת שלה (3disco האולטימטיבי הדמיה של האיברים הממס נוקה)¹³ סיפק מהיר יחסית, פשוט, ו זול הכלי עם יכולות סליקה מצוינות. המרכיבים העיקריים של פרוטוקול סליקה הם ממיסים אורגניים טרט-butanol (יפורסם), בנזיל אלכוהול (BA), בנזיל בנזואט (BB), ו diphenyl אתר (dpe). הפיתוח והתוספת של iDISCO (immunolabeling מאופשר 3D הדמיה של איברים הממס נוקה)¹⁴, פרוטוקול חיסוני תואם, היוו יתרון נוסף על שיטות קיימות ואיפשר את התיוג העמוק ברקמה של אנטיגנים של עניין, כמו גם אחסון לטווח ארוך של דגימות מוכתם חיסוני. כך, השילוב של iDISCO¹⁴ ו udisco¹³ מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של חלבונים המסומנים נוגדנים בסעיפים רקמות גדולות (עד 1 מ"מ) באמצעות clsm קונבנציונאלי.

שימור מבנה מורכב של איבר בכל שלושת הממדים חשוב במיוחד לרקמת המוח. נוירונים מהווים תת הטרוגנית התאית מאוד עם מורפולוגיות 3D מגוונים מאוד מבוסס על התחזיות הneurite שלהם (נבדק על ידי Masland¹⁵). יתרה מזאת, המוח מורכב ממספר תאים ותאי משנה, כל אחד מהם מורכב מאוכלוסיות שונות של תת-משנה ומיחס אליו, כולל תאים גליאל ונוירונים (שנבדקו על ידי פון ברטלד ואח '¹⁶). כווירוס נוירוטרופי, וירוס הכלבת (rabv, נבדק על ידי fooks ואח '¹⁷) מדביק בעיקר נוירונים, באמצעות מכונות ההובלה שלהם לנסוע בכיוון נסיגה לאורך אקסונים מהאתר העיקרי של זיהום למערכת העצבים המרכזית (cn). הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1א) מאפשר זיהוי חיסוני בסיוע ויזואליזציה של התאים הנגועים RABV ו-rabv ב גדול, בערימות תמונה קוהרנטית שהתקבלו מרקמת המוח נגוע. הדבר מאפשר הערכה ברזולוציה גבוהה משוחדת, תלת-ממדית של סביבת הזיהום. זה חל על רקמת המוח ממגוון של מינים, ניתן לבצע מיד לאחר קיבעון או אחרי אחסון לטווח ארוך של דגימות של פאראפורמלדהיד (בתחתית), ומאפשר אחסון והדמיה מחדש של דגימות מוכתם ומנוקה במשך חודשים.

Protocol

שימוש בחומר המוח המאוחסן בארכיון באמצעות RABV. מחקרים ניסיוניים בעלי חיים בהתאמה הוערכו על ידי טיפול בעלי חיים אחראי, השימוש, וועדת האתיקה של משרד המדינה לחקלאות, בטיחות מזון, ודיג ב קלנבורג-מערב פומרניה (LALFF M-V) וקיבל אישור עם הרשאות 7221.3-2.1-002/11 (עכברים) ו-7221.3-1-068/16 (חמוסים). טיפול כללי ושיטות המשמשות בניסויים בבעלי חיים נעשו בהתאם להנחיות המאושרות.

התראה: פרוטוקול זה משתמש בחומרים רעילים ו/או מזיקים שונים, כולל המתנול, מימן (meoh), מי חמצן (H₂O₂), נתרן אזיד (נאן₃), יפורסם, BA, BB, ו dpe. MeOH ו-יפורסם הם דליקים מאוד. הימנע מחשיפה על-ידי לבישת ציוד הגנה אישי מתאים (מעיל מעבדה, כפפות והגנת עיניים) וביצוע ניסויים בתוך מכסה המנוע. לאסוף פסולת בנפרד במיכלים המתאימים ולהיפטר ממנו על פי התקנות המקומיות. וירוס כלבת מסווג כרמת בטיחות ביולוגית (BSL)-2 הפתוגן והוא יכול, לכן, בדרך כלל להיות מטופלים תחת תנאי BSL-2. פעילויות מסוימות, כולל הליכים שעשויים לייצר אירוסולים, לעבוד עם ריכוזי וירוסים גבוהים, או לעבוד עם lyssaviruses הרומן, עשוי לדרוש סיווג BSL-3. מניעה טרום חשיפה מומלצת לעובדים בעלי סיכון גבוה, כולל מטפלים בבעלי חיים ועובדי מעבדה^18,19. התייחס לתקנות הרשות המקומיות.

1. קיבוע רקמת המוח והסדר

1. לתקן דגימות מוח בנפח מתאים של 4% בתחתית מלוחים באגירה פוספט (PBS [pH 7.4]) עבור לפחות 48 h ב 4 ° צ' (עם יחס רקמות משוער של 1:10 [v/v]).
2. לשטוף את דגימות רקמות 3x ב PBS עבור לפחות 30 דקות כל לשטוף ולאחסן אותם 0.02% נאן₃/PBS ב 4 ° צ' עד השימוש.
3. מקטע את הרקמה לתוך מקטעים בעובי 1 מ"מ באמצעות רטט (קצב הזנת להב: 0.3 – 0.5 מ"מ/s, משרעת: 1 מ"מ, עובי פרוסה: 1,000 μm).
4. כדי לשמור על רצף הפרוסה הנכון, אחסן כל אחד מסוגי הרקמה בנפרד בצלחת של לוחית התרבות של התאים המרובים. הוסף 0.02% NaN₃/PBS ואחסן את מקטעי הרקמה ב -4 ° צ' עד השימוש.

2. לדוגמה טרום טיפול עם מתנול

הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור הטיפול במדגם משמש את המטרה הכוללת של שיפור הנוגדן והפחתת הרקמה האוטומטית של רקמות על ידי חשיפה MeOH ו-H₂O₂, בהתאמה¹⁴.

1. להכין 20% (v/v), 40%, 60%, ו 80% MeOH פתרונות במים מזוקקים. למשל, עבור 20% MeOH, להוסיף 10 מ"ל של 100% MeOH ל 40 mL של מים מזוקקים בספינה מתאימה לאיטום ולערבב על ידי היפוך זה.
2. העבירו את הדגימות לכלי בגודל סביר (למשל, 5 מ ל שפופרות תגובה). לדאוג לשימוש בחומרים עמידים כימית כדי ריאגנטים בשימוש בפרוטוקול זה. למשל, שים לב כי בעוד פוליפרופילן מתאים, הפוליסטירן אינו.
   הערה: מפרטי עוצמת הקול בפרוטוקול זה מתייחסים ל-5 שפופרות תגובה mL. אם נעשה שימוש בכלי קיבול אחר, התאימו את אמצעי האחסון בהתאם.
3. מודאת הדגימות ב 4 מ ל של כל ריכוז של הסדרה המוכנה של פתרונות MeOH בסדר עולה עבור 1 h כל אחד.
4. מודאת הדגימות 2x עבור 1 h כל אחד טהור (100%) שבילי.
5. לצנן את הדגימות עד 4 ° צ' (למשל, במקרר מוגן מעבדה).
6. הכנת פתרון הלבנה (5% H₂O₂ ב meoh) על ידי, למשל, דילול 30% H₂O 2 מלאי פתרון ב 1:6 טהור (100%) . והירגע בארבע מעלות צלזיוס
7. הסר את 100% MeOH מתוך דגימות קירור ולהוסיף 4 מ ל של פתרון הלבנת מקורר (5% H₂O₂ ב meoh). המלון משלב בין לילה ב -4 ° c.
8. החלף את הפתרון הלבנת עבור 4 מ ל של 80% MeOH ו-דגירה עבור 1 h. המשך להשתמש בסדרה המוכנה של פתרונות MeOH בסדר יורד עבור 1 h כל אחד עד הדגימות כבר מודבטים עבור 1 h ב 4 מ ' של 20% MeOH.
9. שטוף את דגימות 1x עבור 1 h עם 4 מ ל של PBS.

3. כתמים חיסוני

הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור כדי למנוע גידול בחיידקים, להוסיף נאן₃ לריכוז הסופי של 0.02% לפתרונות בסעיף זה. דגימות רקמות הן חדירות נוספות על ידי טיפול עם דטרגנטים nonionic טריטון X-100 ו רצף 20. סרום רגיל משמש לחסימת כריכת נוגדנים שאינה ספציפית. גליצין והפארין מתווספים להפחתת הרקע האימונוולאבילינג¹⁴.

1. לשטוף את הדגימות 2x עבור 1 h כל אחד ב 4 מ ל של 0.2% טריטון X-100/PBS.
2. הפריית הדגימות עבור 2 ימים ב 37 ° c עם 4 מ ל של 0.2% טריטון X-100/20% DMSO/0.3 M גליצין/PBS.
3. לחסום את הקשירה לא ספציפית של נוגדנים על ידי הדגירה של דגימות עבור 2 ימים ב 37 ° c ב 4 מ ל של 0.2% טריטון X-100/10% DMSO/6% סרום רגיל/PBS.
   הערה: השימוש בסרום רגיל מאותו מינים הנוגדן המשני הועלה כדי להשיג תוצאות החסימות האידיאליות.
4. מודדת את הדגימות 2 מ ל של פתרון הנוגדן העיקרי (3% סרום רגיל/5% DMSO/לפטין [PBS-רצף 20 עם הפארין] + נוגדן ראשי/נוגדנים) במשך 5 ימים ב 37 ° c. לרענן את פתרון הנוגדן העיקרי לאחר 2.5 ימים.
   1. עבור לפטין, ליצור מחדש את מלח הפארין נתרן במים מזוקקים לעשות 10 מ"ג/mL פתרון מניות (לאחסן את הפתרון, מצוטט, ב 4 ° c). הוסף את הפתרון מניות ל 0.2% רצף 20/PBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL.
      הערה: בחירת דילול הנוגדן הנכון עשוי לדרוש אופטימיזציה. בדרך כלל, ריכוזי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים הם נקודת התחלה טובה.
5. רוחצים את הדגימות ליום אחד ב-4 מ ל של פטין, החלפת מאגר הכביסה לפחות 4x – 5x במהלך היום והשארת הכביסה הסופית על הלילה.
6. מודדת את הדגימות 2 מ ל של פתרון נוגדן משני (3% סרום רגיל/לפטין + נוגדן/נוגדנים משני) עבור 5 ימים ב 37 ° c. לרענן את פתרון הנוגדן המשני לאחר 2.5 ימים.
   1. לדלל את הנוגדן/נוגדנים משני ב 1:500 בפתרון נוגדן משני (כלומר, 4 μL ב 2 מ ל).
7. רוחצים את הדגימות ליום אחד כמתואר בשלב 3.5, ומשאירים את השטיפה הסופית בלילה.

4. מכתים גרעיני

הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור אם אין כתמים גרעיניים נדרש או את הספקטרום עירור/הפליטה של ל-PRO-3 נדרש עבור עירור או זיהוי של fluorophore אחר, לדלג על שלב זה.

1. לדלל את הכתם חומצות גרעין ל-PRO-3 ב 1:1000 בשנת לפטין ו-דגירה את דגימות 4 מ ל של פתרון מכתים גרעיני עבור 5 h.
2. רוחצים את הדגימות ליום אחד כמתואר בשלב 3.5, ומשאירים את השטיפה הסופית בלילה.
   הערה: לאחר הניקוי ניתן לאחסן את הדגימות ב-PBS ב-4 ° צ' עד לניקוי אופטי.

5. ניקוי רקמות

הערה: בצע את כל שלבי הדגירה עם תנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. . להגן על הדגימות מהאור דגימות הרקמה מיובשות בסדרה מדורגת של פתרונות יפורסמו. כאשר החיסוני דורש פתרונות מימית, כל הליכי הצביעת צריך להסתיים לפני ניקוי רקמות. סיווג אופטי והתאמת מדד השבירה מושגת על ידי טיפול עם תערובת של BA, BB, ו DPE. הפתרון סליקה בתוספת עם DL-α-tocopherol כמו נוגד חמצון¹³.

1. הכינו 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% ו-96% מפתרונות יפורסם במים מזוקקים. למשל, עבור 30% יפורסם, להוסיף 15 מ ל של 100% יפורסם עד 35 mL של מים מזוקקים בכלי האיטום המתאים ולערבב ידי היפוך.
   הערה: יפורסם בנקודת התכה של 25 עד 26 ° c; לכן, הוא נוטה להיות מוצק בטמפרטורת החדר. כדי להכין פתרונות יפורסמו, לחמם את הבקבוק האטום היטב ב 37 ° c בחממה או באמבט מים.
2. מייבשים את הדגימות עם 4 מ ל של כל ריכוז של הסדרה המוכנה של פתרונות יפורסם בסדר עולה עבור 2 h כל אחד. השאירו את ה-96% יפורסם בלילה.
3. מייבשים את הדגימות עוד יותר בטהור (100%) יפורסם במשך 2 שעות
4. הכנת ניקוי פתרון BABB-D15.
   הערה: BABB-D15 הוא שילוב של BA ו-BB (BABB) אשר מעורבב עם DPE ביחס של x: 1, שבו x מצוין שם הפתרון, במקרה זה 15.
   1. עבור BABB, מערבבים תואר ראשון בשני חלקים ב-BB.
   2. מערבבים BABB ו DPE ביחס של 15:1.
   3. הוסף 0.4 vol% DL-α-tocopherol (ויטמין E).
      הערה: לדוגמה, עבור 20 מ ל של BABB-D15, לערבב 6.25 mL של BA עם 12.5 mL של BB. להוסיף 1.25 mL של DPE ומוסף אותו עם 0.08 mL של DL-α-tocopherol.
5. נקה את הדגימות בניקוי התמיסה עד שהן שקופות באופן שקוף (2 – 6 שעות).
6. הדגימות ניתן לאחסן ב 4 ° c ב BABB-D15, מוגן מפני אור, עד הרכבה והדמיה.

6. הרכבה לדוגמה

1. באמצעות מדפסת תלת-ממד, הדפס את חדר ההדמיה ואת המכסה (חומר: copolyester [CPE], זרבובית: 0.25 מ"מ, גובה שכבה: 0.06 מ"מ, עובי קיר: 0.88 מ"מ, ספירת קירות: 4, infill: 100%, אין מבנה תמיכה; קובץ STL ניתן למצוא בחומרים המשלימים של פרוטוקול זה).
2. הכנס את חדר ההדמיה (איור 2).
   1. הר שמיכות עגול (קוטר: 30 מ"מ) על חדר ההדמיה עם RTV-1 (חדר אחד-מרכיב-הטמפרטורה-בטמפרטורת המים) סיליקון גומי. מסירים את גומי הסיליקון העודף בעזרת ספוגית כותנה במים ומרפאת לילה.
   2. הר שמיכות עגול (קוטר: 22 מ"מ) על המכסה עם RTV-1 סיליקון גומי. מסירים את גומי הסיליקון העודף בעזרת מסיר כותנה מים ומרפא למשך הלילה.
3. מניחים את המדגם בחדר הדמיה, להוסיף נפח קטן של BABB-D15, ולהוסיף את המכסה. למלא את החדר עם BABB-D15 דרך הים, באמצעות מחט תת-עורית (27 G x 3/4 אינטש [0.40 מ"מ x 20 מ"מ]).
4. חבר את החלל ולאטום את חדר ההדמיה עם RTV-1 סיליקון גומי. לרפא לילה בחושך.

7. עיבוד תמונות והדמיה

1. להגדיר את רכישת התמונה על ידי בחירת קווי לייזר בהתאמה להתאים fluorophores בשימוש. התאימו את טווחי הזיהוי של כל גלאי כדי למנוע חפיפה בין האותות בין הערוצים.
   הערה: טווחי זיהוי למופת עבור אלקסה Fluor 488, אלקסה Fluor 568, ו-PRO-3 הם 500 – 550 ננומטר, 590 – 620 ננומטר, ו 645 – 700 ננומטר, בהתאמה.
2. בחרו בפרמטרי הרכישה, הגדירו את הגבול העליון והתחתון של מחסנית z, ורכשו את מחסנית התמונה.
   הערה: פרמטרים לרכישת מופת הם סריקה רציפה עם גודל פיקסל של 60-90 ננומטר, גודל z-step של 0.5 μm, קו ממוצע של 1, מהירות סריקה של 400 Hz, וגודל חריר של יחידה אוורירית 1.
3. עבד את מחסנית התמונה באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה (לדוגמה, פיג'י) כדי ליצור הקרנות תלת-ממד או לבצע ניתוחים מעמיקים.
   הערה: בשל גודלו הגדול של קבצי התמונה הנרכשים, השימוש בתחנת עבודה הוא בדרך כלל הכרחי.
   1. פתח את קבצי הרכישה או התמונה בפיג (קובץ | פתח | בחר קבצים).
      1. . אם נשתמש, למשל בחרו או בטלו את הבחירה באפשרויות הרצויות בחלון הדו ' תבניות ביולוגיות '. הצג מחסנית עם היפר-מחסנית. מלבד זאת, לא נחוצים בחירות או קרציות מסוימות. לחץ על אישור.
      2. אם הקובץ מכיל ערימות תמונות מרובות, בחר את אלה שניתן לנתח ולאשר על-ידי הקשה על אישור.
   2. בצע תיקון אקונומיקה על-ידי פיצול התמונה הממוזגת לערוצים בודדים (תמונה | צבע | הכלי ערוצים, ולאחר מכן בחר עוד | פצל ערוצים). עבור כל ערוץ, בחר תיקון אקונומיקה (תמונה | כוונן | תיקון אקונומיקה) ובחר יחס פשוט (עוצמת רקע: 0.0).
      הערה: במקרים מסוימים, לדוגמה, כאשר אין ריקבון ליניארי של האות או שהאות חלש מדי, היחס הפשוט עלול להיכשל. לחלופין, נסה התאמה מעריכית או דלג על תיקון האקונומיקה.
   3. כוונן את הבהירות והניגודיות עבור כל אחד מהערוצים באמצעות המחוונים (תמונה | כוונן | בהירות | ניגודיות).
   4. מזג את הערוצים (תמונה | צבע | מיזוג ערוצים), ליצור שילוב (תמונה | צבע | הכלי ערוצים, ולאחר מכן בחר עוד | הפוךללא משולב) והמר אותו לתבנית RGB (תמונה | צבע | הכלי ערוצים, ולאחר מכן בחר עוד | המיר ל-RGB).
   5. במקרה הצורך, שנה את גודל מחסנית התמונה כדי להקטין את זמן החישוב ואת גודל הקובץ (תמונה | כוונן | גודל, שתי האפשרויות תיקתק בתוספת אינטרפולציה בלבד).
   6. יצירת הקרנה תלת-ממדית (תמונה | ערימות | פרוייקט תלת-ממדי). בחרו ' נקודת מבריק כשיטת הקרנה ' וקבעו את מרווח הפרוסה כדי להתאים לגודל ה-z של מחסנית התמונה שנרכשה. לאיכות מרבית, קבעו את התוספת של זווית הסיבוב ל- 1 והפעל אינטרפולציה. שנה את הסיבוב הכולל, סף השקיפות והאטימות לפי הצורך.
   7. במקרה הצורך, הזמן את הניגודיות והבהירות באמצעות המרת ההטלה התלת-ממדית חזרה לתבנית של 8 סיביות (תמונה | סוג | 8 סיביות). השתמש במחוונים המתאימים (תמונה | כוונן | בהירות | ניגודיות) והמרה מפני ערימת התמונות לתבנית RGB כמתואר בשלב 7.3.4.
   8. שמרו את ההטלה התלת-ממדית. טיף קובץ (תבנית קובץ תמונה) ו. קובץ AVI (תבנית קובץ וידאו).

תוצאות

השילוב של iDISCO¹⁴ ו udisco¹³ בשילוב עם clsm ברזולוציה גבוהה מספק תובנות עמוקות לתוך הרזולוציה הטמפורלית ואת הפלסטיות של זיהום rabv של רקמת המוח והקשר הסלולר המקיף.

שימוש חיסוני של ראפופרוטאין (P), שכבות מורכבות של תאים עצביים נגועים יכול להיות דמיינו בחלקים ע?...

Discussion

התחייה ופיתוח נוסף של טכניקות ניקוי רקמות בשנים האחרונות^{2,3,4,5,6,7,8} , מיכל בן ^{10 ,} מיכל ^{עשור ,} מיכל בן ^{11 ,}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Benzyl alcohol	Alfa Aesar	41218	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Clearing reagent
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth	4720.2	Various buffers
Diphenyl ether	Sigma-Aldrich	240834-100G	Clearing reagent
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidant
Donkey serum	Bio-Rad	C06SBZ	Blocking reagent
Glycine	Carl Roth	3908.2	Background reduction
Goat serum	Merck	S26-100ML	Blocking reagent
Heparin sodium salt	Carl Roth	7692.1	Background reduction
Hydrogen peroxide solution (30 %)	Carl Roth	8070.2	Sample bleaching
Methanol	Carl Roth	4627.4	Sample pretreatment
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3	Crystalline powder to make fixative solution
Sodium azide	Carl Roth	K305.1	Prevention of microbial growth in stock solutions
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Sample dehydration for tissue clearing
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Nucleic acid stain
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergent
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergent
Miscellaneous
5 mL reaction tubes	Eppendorf	0030119401	Sample tubes
Coverslip, circular (diameter: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Part of imaging chamber
Coverslip, circular (diameter: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Part of imaging chamber
Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Filling of the imaging chamber with clearing solution
RTV-1 silicone rubber	Wacker	Elastosil E43	Adhesive for the assembly of the imaging chamber
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent	Ultimaker	8718836374869	Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber
Technical equipment and software
3D printer	Ultimaker	Ultimaker 2+	Printing of imaging chamber
Automated water immersion system	Leica	15640019	Software-controlled water pump
Benchtop orbital shaker	Elmi	DOS-20M	Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)
Benchtop orbital shaker, heated	New Brunswick Scientific	G24 Environmental Shaker	Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm)
Confocal laser scanning microscope	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Inverted confocal microscope for sample imaging
Fiji	NIH (ImageJ)	open source software (v1.52h)	Image processing package based on ImageJ
Long working distance water immersion objective	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Sample slicing
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2	Abcam	ab32454	Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250
Rabbit anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500