מודל בלתי מתורבת לחקר הצבירה של הטאו באמצעות מתווך-התמרה בתיווך של הנוירונים האנושיים

Summary

פרוטוקול זה מפרט הליך שבו התרבויות הנוירואליות של האדם מוטדיקות באמצעות בנייה ויראלית קידוד עבור מוטציה האדם האנושי. התמרה של תרבויות התצוגה ביחידות האוניברסיטה והפתווגיות הקשורות.

Abstract

צבירה חריגה של החלבון טאו מעורב באופן פתולוגי במספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD). למרות שדגמי העכבר של טאונופתיה סיפקו משאב בעל ערך לחקירת מנגנוני הנוירורעילים של האוניברסיטה הנצברת, הוא הופך להיות יותר ויותר ברור כי, בשל הבדלים בין מינים נוירופיזיולוגיה, המוח בעכבר אינו מתאים ל מידול המצב האנושי. ההתקדמות בשיטות תרבות התאים הפכו את התרבויות העצבי האנושיות לנגישות לשימוש ניסיוני בתחום החוץ וסייעו בפיתוח הneurotherapeutics. עם זאת, למרות ההסתגלות של תרבויות התאים הנוירואליות האנושית, במודלים של מבחנה של הטאופתיה האנושית עדיין אינם זמינים באופן נרחב. פרוטוקול זה מתאר את המודל התאי של הצבירה של הטאו שבו הנוירונים האנושיים מותמרים עם וקטורים הנגזרים מהאנטי-ויראליות הקוד עבור מוטציה בפתוניים התמזגו לכתב חלבון פלורסנט צהוב (YFP). תרבויות התמרה לייצר אגרגטים טאו הכתם באופן חיובי עבור thioflavin ולהציג סמנים של רעילות נוירולית, כגון אורך האקסון הופחת ונפח ליסוזומגדל. הליך זה עשוי להיות מודל שימושי וחסכוני ללימוד tauopathies אנושיים.

Introduction

צבירה פתולוגית של המיקרו-מחלות החלבון המקושר היא תכונה מוגדרת של הרבה במחלות ניווניות, כולל לספירה, דמנציה מתקדמת (ftd), מחלת ברים, ושיתוק מוחין גרעיני (PSP)¹. במדינה שאינה חולה, מאוגד הטאו ומייצב את החוטים המיקרוסיבים העצביים ב^-2. עם זאת, היפרזילציה הקשורים למחלות של הטאו מקדמת את צבירת הטאו, דיסוציאציה ממיקרוטובולים ורעילות עצבית³. ההשפעות הרעילות של הטאו הצבור עשוי להיות כרוך הפעלה חריגה של cholinergic⁴ ו glutamatergic קולטנים⁵ וכתוצאה מכך דיסתקנה של סידן תאיים ובסופו של דבר, מוות תאים. במודלים של בעלי חיים, הפחתת המוח המוחי משפרת את הפתולוגיה בעכברי לספירה⁶ ובדגמי העכבר של פגיעה מוחית טראומטית מתונה וחוזרת⁷.

ראיות הרכבה מעידות על כך שהמבנה והזיקה המחייבים של הטאו הנגזר מהעכבר נבדלים מטאו שנגזר על ידי האדם והעכבר טאו אינו מתאים לדוגמנות האדם tauopathies⁸. עם זאת, מודלים של תאי תאים אנושיים אינם זמינים מבחינה מסחרית. המטרה הכוללת של עבודה זו היא לתאר מודל בלתי מתורבת של הצבירה של הטאו שבו הנוירונים האנושיים מותמרים עם וקטורים הנגזרים המכילים מוטציה האדם בונה⁹. טאו הצבירה גרימת בנייה ויראלי מקודד לתחום החוזר של טאו מחסה P301L ו V337M מוטציות התמזגו כתבת YFP (טאו-RDLM-YFP) תוך שליטה בונה קוד עבור מסוג פראי (Wt) טאו לחזור התחום התמזגו לכתב YFP (טאו-Wt-YFP). התרבויות הנוירואליות משדיקות בשיטה זו מבטאות כתשע פעמים יותר טאו מאשר תרבויות שאינן מנתמרים. למרות שכמות הביטוי של הטאו מתבטאת במידה רבה בין התאים של טאו-RDLM-YFP-ובין טאו-אווט-יfp, רק נוירונים מותמרים ביחידות התצוגה של הטאו-RDLM. התרבויות התמרה את האור בעזרת טאו-rdlm-yfp באופן חיובי עבור thioflavin ולהציג הנחות באורך סיבי וצפיפות סינפטית. לכן, המודל התאי הזה עשוי להיות כלי שימושי לחקר הצבירה של הטאו בתוך מבחנה.

Protocol

1. הכנת מדיה וריאגנטים

1. הפשרת ציפוי מטריצות של קרום המרתף ללוחות התרבות ב-4 ° צ' (אל תאפשר למטריצת הממברנה להתחמם או שהיא תפדה). הפוך את 1 mL ואחסן אותם ב-20 ° c או-70 ° c.
2. מהווה מחדש את גורם הצמיחה פיברוהפיצוץ בסיסי (bFGF) ב מלוחים סטרילית מחסני פוספט (PBS) ב 10 μg/mL ולעשות 10 μL aliquots. אחסן אותם ב-4 ° c.
3. לבקבוק חדש, לא נפתח, 500 mL של DMEM/F12 עם גלוטמין, להוסיף (10 מ ל), N2 (5 מ ל), ו פניצילין-סטרפטומיצין (5 mL). מקום 50 mL של תא גזע זה (המועצה לבטחון לאומי) מדיה בצינור חרוט ולהוסיף 10 μL של 10 μg/μL (2 μg/mL סופי) bFGF. אחסן את המדיה לבטחון לאומי (+) bFGF ב-4 ° c.
4. כדי לבצע (-) bFGF מדיה, להשתמש באותו מתכון כפי שמתואר בשלב 1.3, אבל לא להוסיף bFGF. מדיה זו ישמש כדי להבדיל NSCs לנוירונים ולשמור על תרבויות עצבי לאחר בידול.

2. בנייה ויראלית

הערה: לפני תחילת העבודה עם מבנים לנטינגיניים, ודא שהמעבדה אושרה להשתמש בסוכני רמת בטיחות 2 (BSL-2). יתר על כן, BSL-2 ביגוד תרבות, ציוד הגנה אישית (PPE), ושיטות השמטה יש להשתמש כאשר עובדים עם וקטורים לעדשה.

1. השגת מבנה הטאו הארוזה לתוך וירוס ממקור מועדף (ראו "סנדרס et al^.10 " לבניית מידע).

3. האדם מתאים גזע עצבי האנושי

הערה: NSCs הם בדרך כלל נזרע ב-100,000 – 150000 תאים/cm² והNSCs המסחרי הזמין ביותר נמכרים כמו 1 x 10⁶ תאים/בקבוקון. פרוטוקול זה הותאם במיוחד עבור 10 ס מ מנות תרבות התא (אם כי בגדלים אחרים של מנות ניתן להשתמש); לכן, אם בשימוש NSCs מסחרית, הNSCs עשוי להיות מורחב על ידי להיות מתורבת בגיל שש-היטב מנות על מנת לגרום מספיק תאים לזרעים 10 ס"מ מנות. פרוטוקול זה ניתן להתאמה לחילופין עבור מגוון רחב של מידות התרבות תאים (אבל זה לא מכיל הוראות passaging NSCs כמו פרוטוקולים אלה זמינים במקומות אחרים^11,12).

1. להכנת לוחיות התרבות התא, להסיר אחד סדרת מחלקים של מטריצה קפואה ממברנה ציפוי מטריקס עבור לוחות תרבות התא ולאפשר לו להפשיר ב 4 ° צ' (האליבטים ניתן למקם ב 4 ° c לילה ביום לפני התאים הם להיות הזרע). הוסף 385 μL של ציפוי מטריצה מרתף ממברנה 5 מ ל של DMEM/F12 מדיה + פניצילין-.
   הערה: 5 מ ל של dmem/F12 מדיה + פניצילין-הוא מספיק כדי מעיל אחד 10 ס מ צלחת (1 מ ל של המרתף הזה ממברנה ציפוי מטריצה מספיקה לעיל אחד טוב של מאכל שש-טוב). לחילופין, אם התאים הם להיות קבועים ומוכתם חיסוני, או מוכתם thioflavin, התרבות תאים על שמיכות זכוכית ב 24-היטב תרבות מנות.
   1. השאר את המדיה ואת ציפוי המטריקס קרים לפני ובזמן הוספתם למנות תרבות. הוסיפו את ציפוי מטריצת הממברנה למנות תרבות והניחו את המנות בחממה (ב37 ° c) במשך 1 h. לציפוי אופטימלי, לא מודתיאת מטריצת קרום המרתף עבור יותר או פחות מ 1 h. אחרי 1 שעות, משמסת את ציפוי מטריקס ממברנה מתוך מנות התרבויות תאים. ודא כי זה בסדר עם NSCs להיות מוכן להיות מצופה.
      הערה: אם התאים אינם מופשרים ממניות קפוא, לדלג על שלב 3.2 ולהמשיך עם שלב 3.3.
2. אם התאים מופקרים ממניות המועצה לבטחון לאומי קפואים, לקחת בקבוקון של תאים קפואים ולחמם אותו באמבט מים מחומם 37 ° c על ידי הזזת הבקבוקון הלוך ושוב במים. לאחר הסדר, לרסס את המבחנה עם 70% אתנול ולמקם אותו לתוך המכסה התרבותי של התאים. העבר את התאים ~ 10 מ ל של Dמאמ/F12 + פניצילין-סטרפטומיצין מדיה ו צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורת החדר ב 1,000 x g עבור 5 דקות. משלחים את התקשורת ומעבירים מחדש את התאים במדיה של המועצה לבטחון לאומי.
3. דלל את התאים במדיית המועצה לבטחון לאומי כדי לקבל את צפיפות הזריעה המתאימה לכלי התרבות של התאים הנמצאים בשימוש.
   הערה: לדוגמה, אם NSCs מצופה על צלחת שש-היטב-אחת היטב על צלחת התרבות שש-היטב יש שטח שטח של 9 ס מ²-900,000 כדי 1,350,000 תאים נדרשים זרע. כך, בקבוקון אחד המכיל 1,000,000 תאים ניתן להשעות מחדש 2 מ ל של מדיה והוסיף לבאר אחת של שישה היטב צלחת.
4. הוסף מספיק תאים הושעו בתקשורת המועצה לבטחון לאומי כדי לזרע את מנות המרתף מצופה מטריקס מלאי התרבות (100,000 תאים/cm²) ולשנות את המדיה בכל יום אחר (אם באמצעות מלאי קפוא, לשנות את התקשורת יום לאחר הציפוי ובכל יום אחר לאחר מכן). לגדל את התאים עד שהם 75% – 80% שוטפת.
   הערה: התאים צפויים להגיע 75% – 80% המפגש זמן קצר לאחר הציפוי, אבל זה עשוי להימשך זמן רב יותר אם מניות קפואות משמשות.
5. לאחר שNSCs הינם 75% – 80%, התחילו בידול עצבי על-ידי הסרת המדיה ההמועצה לבטחון לאומי (+) bFGF והחלפתו במדיית המועצה לבטחון לאומי (-) bFGF. תרבות התאים במדיה זו (החלפת המדיה בכל יום אחר) למשך 4 שבועות לפחות.
   הערה: התאים ימשיכו להתחלק כמה ימים לאחר הנסיגה של bFGF; לפיכך, תאים עשויים להגיע ל-90-100% זרימה. לאחר culturing במשך 4 שבועות, התאים יהיו השיגו גורל עצבי יהיה מוכן לטיפול של הנגיף.

4. התמרה ואחזקה של תרבויות נירואליות

1. כדי לשנות את הנוירונים עם וירוס, להשתמש בספירה סיכוייו של 3.4 x 10⁵ יחידות הגלגול/תא (a 100% confluent 10 התבשיל ס"מ יכיל ~ 10,000,000 נוירונים). יש לדלל את היחידות הנוספות לריכוז הדרוש במדיית התרבות התאית ולהוסיפם לתאים (להשתמש בנפח המדיה הרגיל לצלחת תרבות התא). יומיים לאחר הוספת הווירוס, לשטוף את התאים 1x עם טרי (-) bFGF מדיה (ללא וירוס) ולהמשיך culturing ב (-) bFGF מדיה כרגיל.
2. לטיפול פוסט-לנטינגיל, האכילו את הנוירונים באמצעות שינוי מדיה לתרבות התא ([-] bFGF מדיה) בכל יום אחר. שמור על התאים במשך ~ 8 שבועות לאחר התמרה. להמחיש באופן שגרתי את התאים תחת מיקרוסקופ קל כדי להבטיח קיום.
   הערה: השבירה Sparseness או הדנדריטים הם סימנים כי התאים הם כבר לא קיימא.

5. הדמיה של תאים

1. הדמיה של תא חי
   1. לאחר התמרה (4 ימים לאחר התוספת של הנגיף), להתבונן אותות YFP תחת מיקרוסקופ פלורסנט המסוגל הדמיה בשידור חי. קחו את מנות התרבות הסלולרית אל מחוץ לחממה וודאו שבארות התרבות נשארות סטריליות על ידי שמירה על מכסה המטבח העליון. המחש את התאים באמצעות מטרה 10x עם אורך גל עירור של ~ 514 ננומטר ו מסנן פליטה של ~ 527 nm.
      הערה: אגרגטים נראים בדרך כלל בתרבויות תאים מותמרים 6 – 8 ימים לאחר היישום של הנגיף.
2. תא קבוע צביעת (β-טובולין III תיוג ו thioflavin כתמים)
   1. כדי לתקן את התאים של פאראפורמלדהיד (בתוך הקופה), להסיר את התקשורת התרבותית מפני מתאי נוירונים גדלו על כיסוי זכוכית. לשטוף את התאים 1x עם PBS, להסיר את הכביסה, ולהוסיף 300 – 500 μL (אם באמצעות הצלחות 24-טוב) של 4% בתחתית (מדולל ב-PBS) כדי כיסוי עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את הה, ולשטוף את הכיסויים 2x עם PBS.
   2. הכנת פתרון חסימה המורכב של PBS, 3% בסרום שור (BSA), ו 0.3% טריטון X-100. הוסף 300 – 500 μL של הפתרון לבארות והדגירה את הכיסויים עבור 2 h ב 4 ° c. לאחר 2 h, לדלל נוגדנים ראשוניים (בריכוז נוגדן של 1:500) בפתרון חסימה ולהוסיף 300 – 500 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לכל טוב. מניחים את הצלחת על רציף נדנדה או מסתובב (במהירות נמוכה) לילה ב 4 ° c.
   3. למחרת, להסיר את הפתרון העיקרי נוגדן ולשטוף את 3x שמיכות עבור 5 דקות כל אחד עם PBS. לדלל נוגדנים משניים בפתרון מאגר חוסם (בריכוז של 1:1000) ולהוסיף פתרון נוגדן משני כל טוב. בחר את הנוגדן המשני המתאים באמצעות תג פלורסנט שאינו חופף לאות YFP (CY-3, לדוגמה). דגירה את התאים בטמפרטורת החדר עבור 2 על על הנדנדה או פלטפורמת מסתובבת. לאחר 2 h, להסיר את הפתרון נוגדן משני ולשטוף את 3x שמיכות עבור 10 דקות כל אחד עם PBS.
   4. שטוף את הכיסויים במים כפולים (DDW) עבור 10 דקות. הסר את DDW ולהוסיף 300 μL/טוב של 0.015% thioflavin-S מדולל ב 50% אתנול עבור 10 דקות. הסר את הפתרון thioflavin ולשטוף את שמיכות 2x עבור 4 דקות כל אחד עם 50% אתנול, ואחריו 1 4 דקות לשטוף עם 30% אתנול ושני שטיפת עבור 5 דקות כל אחד עם 30% אתנול. לשטוף את שמיכות 1x עם DDW לפני הרכבה.
      הערה: הצביעת העצמי המתואר בשלב 5.2.4 היא אופציונלית.
   5. כדי לטעון את הכיסויים לשקופיות זכוכית, הנח טיפה יחידה של מדיה המתקנת בצידו "+" של שקופית זכוכית. להסיר את כל הנוזל מן הבאר המכילה את שמיכות זכוכית, באמצעות מלקחיים עדינים, בזהירות להסיר את שמיכות זכוכית, שמירה על מסלול של איזה צד יש תאים מתורבתים.
   6. לחץ בעדינות על הקצה של הכיסויים כנגד Kimwipe כדי להסיר לחות עודפת. עדיין מרתק את coverslip עם מלקחיים עדינים, לגעת בקצה (עם צד התא פונה לכיוון טיפת מדיה הרכבה) של coverslip למדיה הרכבה, ולאחר מכן, בעדינות למקם את coverslip על מדיה הרכבה (הצבת תאים מתורבתים לתוך הרכבה תקשורת וsandwiching אותם בין הכיסויים לבין שקופית הזכוכית). הניחו למדיה המתקנת להיות הבשלה למשך 30 דקות לפני ההדמיה. ניתן לאחסן את השקופיות ב-20 ° c לשימוש עתידי.
   7. התמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט ואת מגוון עירור/פליטה המתאים (YFP = ~ 514/527 ננומטר, CY-3 = ~ 555/568 nm, ו thioflavin S = ~ 390/426 nm).

6. שיטות אופציונליות

1. כל יומיים, לאסוף מדיה ממוזג מן התרבויות ולאחסן אותו ב-20 ° c לניתוח עתידי של מינים טאו שפורסמו על ידי תרבויות.

תוצאות

טאו-RDLM-YFP-התמרה הנוירונים הייתה מתוייגת בעזרת YFP, ו RDLM-התמרה תרבויות הציג אגרגטים לאחר התמרה. אלה הכללות מוכתם חיובי עבור thioflavin (איור 1). כפי שאיור 1 ממחיש, פרוטוקול זה מייצר תרבויות נוירואליות המציגות את האגרגטים החיוביים של הטאו. עבור ניסויים ראשוניים, מומלץ ...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל בלתי מתורבת של טאונופתיה האנושית שמוצגים כסף-כתם חיובי אגרגטים ו thioflavin-חיובי נוירופיבריליאן סבך. יתר על כן, תאים התמרה להציג הפתולוגית המושרה טאו כגון פגמים מורפולוגיים, synaptogenesis מופחתת, ונפח ליסוזוממוגבר. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק מודל נגי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 mL tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50 mL tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA