מודל Murine מתקדם לאגודה לדלקת כבד Nonatoin עם סוכרת מסוג 2

Summary

דיאטה פשוטה ואמינה המושרה בעלי חיים מכרסם מודל עבור steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש) מתואר, מושגת באמצעות דיור ללא SPF של בעלי חיים וניהול של תזונה מסוימת גבוהה שומן. אנו מתארים זיהוי של תת הכבד והאדיפוז מערכות המשנה של תאים חיסוניים כדי ללכוד את התנאים האימונולוגיים אנושיים על ידי חשיפת עכברים חיידקים סביבתיים.

Abstract

השמנת יתר קשורה לדלקת כרונית בדרגה נמוכה ועמידות לאינסולין, לתרום לשכיחות הולכת וגוברת של מחלות מטבולית כרונית, כגון סוכרת סוג 2 ו steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש). מחקרים שאירעו לאחרונה הקימה כי תאי החיסון הפרו דלקתיים לחדור יפרטרופית שמנים רקמות והכבד. בהינתן החשיבות המתעוררים של תאים חיסוניים בהקשר של הומאוסטזיס מטבולית, יש צורך קריטי לכמת ולאפיין את השינוי שלהם במהלך התפתחות של סוכרת מסוג 2 ו נאש. עם זאת, מודלים בעלי חיים היגרמו לתכונות הפתותולוגיות האופייניות של האדם נאש הם דלילים.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את ערכות המשנה של תאים חיסוניים מבודדים מן הכבד ואת רקמת השומן במודל העכבר האמין של נאש, שהוקמה על ידי הדיור דיאטה גבוהה שומן (HFD) עכברים תחת לא ספציפי הפתוגן ללא מצבים (SPF) תנאים ללא מכשול למשך שבעה שבועות לפחות. אנו להדגים את הטיפול של עכברים בתנאים שאינם SPF, העיכול של רקמות וזיהוי של מקרופאגים, הרוצח הטבעי (NK) תאים, תאים דנדריטים, B ו-T קבוצות ממשנה של תאים על ידי הזרמת cy, לנסות. זרם מייצג cy, לנסות מגרשים מעכברי SPF HFD ועכברים שאינם SPF מסופקים. כדי להשיג נתונים אמינים ומתרגם, שימוש בנוגדנים, שיטות מדויקות ומדויקות לעיכול רקמות והמשך הניסויים הנכונים בזרימה cy, לנסות הם אלמנטים קריטיים.

ההתערבות כדי לשחזר את החשיפה אנטיגן פיזיולוגי בעכברים על ידי דיור אותם בתנאים שאינם SPF וחשיפה לא ספציפית אנטיגנים חיידקים יכול לספק כלי רלוונטי לחקירת הקשר בין שינויים אימונולוגיים, המושרה דיאטה השמנת יתר וסיבוכים הקשורים לטווח ארוך.

Introduction

השמנת יתר היא הפרעה רב עצרת וגורם סיכון מרכזי לפיתוח מחלות לב, שבץ, steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש), סוכרת סוג 2 (T2D) וכמה סוגים של סרטן. השכיחות של השמנת יתר הוא גדל במהירות ברחבי העולם. כיום, 2,100,000,000 אנשים – כמעט 30% מאוכלוסיית העולם-הם שמנים או שמנים¹. השמנת יתר הקשורות לאינסולין יכול להוביל T2D, כאשר מותש תאי ביתא איון הלבלב לא לפצות על הצורך מוגבר לאינסולין כדי לשמור על הומאוסטזיס גלוקוז².

רקמת אדיפוז מורכבת מסוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים, תאי אנדותל, פיברותקיעות ותאי החיסון. במהלך התקדמות של השמנת יתר, שינויים במספר והפעילות של תאים חיסוניים יכול להוביל דלקת בדרגה נמוכה של יפרטרופית אדיפוז^3,4. באופן ספציפי, זה נמצא כי צריכת אנרגיה מוגזמת, מלווה ברמות גבוהות באופן כרוני של גלוקוז בדם, טריגליצרידים וחומצות שומן חינם, מוביל היפוקסיה adipocyte, המתח רשתית העין, לקויי תפקוד מיטוכונדריאלי ו הפרשת ציטוקין משופרת, וכתוצאה מכך הפעלת התאים החיסוניים הפרו-דלקתיים^5,6. מחקר בעבר התמקד בעיקר בחסינות מולדת, אבל לאחרונה תאים חיסוניים גמישים (T ו-B תאים) התפתחה כרגולטורים חשובים של הומאוסטזיס גלוקוז. הם בעלי דלקתיות (כולל CD8⁺ T תאים, Th1, ו B תאים) או בעיקר פונקציות רגולטוריות (כולל הרגולציה T (treg) תאים, Th2 תאים) והוא יכול גם להחמיר או להגן מפני תנגודת לאינסולין^{7,8 ,} . בסדר, ^תשע

יתר על כן, מנגנונים מספר הוצעו כדי להסביר כיצד השמנת יתר מגדילה, כולל ייצור מוגבר של ציטוקינים על ידי האדיפוז רקמה¹⁰. נאש, הצורה המתקדמת של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי ונטל בריאות מרכזי במדינות מפותחות, הוא מאופיין באופן היסטולוגית על ידי הבלון בלונים, הצטברות ליפיד, פיברוזיס ודלקת לוצלתית ועשוי להתקדם ל שחמת, בסוף מחלת כבד שלב או סרטן hepatocellular. משטר מספר (למשל מתיונין ותזונה לקויה כולין¹¹) ידועים לגרום נאש כמו מחלות כבד במודלים בעלי חיים לא אנושיים, אבל רוב הגישות הללו לא לכידה של התנאים האנושיים של נאש ואת מטבולית תוצאות כפי שהם דורשים הסתרה גנטית ספציפית, שאינם פיזיולוגיים מניפולציות תזונתיים או חוסר עמידות לאינסולין אופייני של האדם נאש. יתר על כן, ההבנה שלנו של המנגנונים הבסיסיים של מחלות מטבולית מבוססת כיום על ניסויים שבוצעו עם עכברי מעבדה שוכנו תחת תקן הפתוגן הספציפי ללא המחלה (SPF). מתקני מכשול אלה הם היגיינה באופן חריג לא לשקול את החיידקים מגוון בני אדם צריך להיתקל, אשר עשוי להסביר את הקשיים בתהליך התרגום של מחקרי בעלי חיים לגישות קליניות^{12,13 ,} . ^{ארבע עשרה}

כדי לחקור את ערכות המשנה של התא החיסונית השונים ברקמת השומן והכבד במהלך התפתחות עמידות לאינסולין ונאש במודל עכבר מתקדם לשחזר את התנאים האימונולוגיים אנושיים, עכברים שוכנו בכלובים בודדים בחצי סטרילי תנאים ללא מחסום. עכברים שוכנו תחת התנאים נחשף אנטיגן פיתחה נאש כמו הכבד פתולוגיה כבר אחרי 15 שבועות של דיאטה גבוהה שומן (HFD) האכלה¹³. בהשוואה לגיל המתאים עכברי SPF הם פיתחו stevesiרומטוזיס, חדירת הכבד הפעלה של תאים חיסוניים.

כתב יד זה מתאר זרימה חזקה cy, לנסות ניתוח להגדיר ולספור את תת הקבוצות של תאים החיסונית של רקמת שומן העכבר והכבד במודל של נאש. הניתוח הסייטונסה לזרום מאפשר זיהוי של פרמטרים מרובים של תאים בודדים בו בניגוד ל-RT-PCR או גישות אימונוהיסטוכימיה.

לסיכום, המחקר שלנו מציע מודל העכבר של HFD לטווח קצר עבור חקירת התפתחות עמידות לאינסולין ו נאש ואת המנגנונים הבסיסיים המוצגים גם נאמנות למצב האנושי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה נעשה בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים של המוסדות הלאומיים לבריאות וחוק רווחה בעלי חיים תחת פיקוחו של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש. פרוטוקולי בעלי חיים נערכו על פי הנחיות אתיות מוסדיים של הCharité ברלין, גרמניה, ואושרו על-ידי מדינת לנדיסמט והגעה להנחיות הבאות.

1. דיאטה המושרה דגם בעלי חיים של Steatohepatitis

1. העברת עכברים (C57Bl/6J, זכר) לדיור שאינו SPF בגיל 4 שבועות ולחשוף אותם ברציפות למגוון רחב של פתוגנים סביבתיים/אנטיגנים. להבטיח את החשיפה על ידי טיפול יומיומי של חיות מעבדה כמו אנטיגנים מופצים על ידי מעבר אוויר בדרך זו.
2. לשמור על עכברים (C57Bl/6J, זכר, 12 שבועות) במערכות מערכות פתוחות עם מסננים קונבנציונליים על 12 h:12 h מחזור אור/כהה בטמפרטורה של 22 ° c. אין להקרין או לעשות כנגד דיאטה ומצעים ניסיוניים. גישה למתקן לדיור בעל חיים ללא מסכה או רשת שיער. דלתות פתוחות בין חדרי בעלי חיים. . אל תשתמש במקלחת אוויר
3. להבטיח טיפול יומיומי של חיות מעבדה ולהחליף חדרים על בסיס קבוע כך אנטיגנים מופצים על ידי מעבר אוויר. המשלים את הדיור המלוכלך עם חשיפה יומית לא ספציפית של חיידקים לאנטיגנים מתוך מצעים של בעלי חיים מעבדתיים מהחי שוכנו בחדרים ליד עכברי המעבדה.
4. למדוד את הפרופורציות של CD44^-CD62L^- אפקטור זיכרון CD4⁺ ו CD8⁺ T תאים בתוך דם וטחול באמצעות זרימה cy try (כפי שמתואר ב refefence¹³).
   הערה: בהקשר זה הגדירו גידול של 20% מהזיכרון CD8⁺ t תאים מCD8⁺ t כהוכחה לחשיפה מספקת של חיידקים.
5. הפעל את HFD (60 kJ% מ-fat, 19 kJ% מחלבונים ו -21 kJ% מפחמימות וצריכת מודעות לlibitum של מים עם 6% סוכרוז תוכן עם העכברים בן חמישה שבועות C57Bl/6J גברים עבור 7-15 שבועות. HFD צריך להכיל 60% kJ משומן (כפי שמתואר לעיל) על מנת לגרום להתפתחות של עמידות לאינסולין במהלך הניסוי.
   הערה: יש לבצע את הצביעת המטאוקסילין ומאפיינים היסטלוגיים כמו בלונים, הגופים של מלורי דנק, הסתננות של תאים חיסוניים ומקרוסורומטוזיס להפגין כנגד מחלות הכבד נאש (כפי שמוצג בהתייחסות ¹³).

2. הכנת ריאגנטים ופתרונות

1. הכינו 70% אתנול, מלוחים באגירה פוספט (PBS, ללא סידן ומגנזיום) שיושלם עם 0.5% BSA ו-ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) מאגר לפירוק.
2. צביעת מאגר
   1. התמוססות 10 מ ל של סרום עגל עוברי (FCS) ב 500 mL של PBS להשיג 2% FCS הPBS. מניחים מאגר הצביעת על קרח לפני השימוש.
   2. חנות פתרון בבקבוק פלסטיק ב -4 ° c.
3. הפתרון לעיכול הרקמה האדיפוז
   1. התמוססות 2.5 g של סרום של שור (BSA) ב 500 mL של PBS כדי לקבל 0.5% BSA/PBS.
   2. התמוססות 74.5 גרם של CaCl₂ ב-10 מ"ל של 0.5% bsa/PBS כדי לקבל פתרון 10 MM cacl₂ .
   3. להוסיף 1 מ"ג של הקולגן הסוג השני (ראה טבלת חומרים) לכל mL של 0.5% bsa עם 10 מ"מ cacl₂ PBS.
   4. הכינו 3 מ ל של התמיסה הקולגיראז של הפתרון לכל g של דגימת הרקמה האדיפוז. הכינו את התמיסה הטרייה. בשביל כל בידוד
4. הפתרון לעיכול רקמות הכבד
   1. לפזר 2.5 g של BSA ב 500 mL של האנק ́s מאוזן תמיסת מלח (HBSS) כדי לקבל 0.5% BSA HBSS.
   2. הוסף 10 מ ל של FCS ב 500 mL של 0.5% BSA/HBSS כדי לקבל 2% FCS 0.5% BSA/HBSS.
   3. להוסיף 0.5 mg של הקולגן הסוג הרביעי (ראה טבלת חומרים) על כל mL של 2% fcs 0.5% bsa/HBSS.
   4. הוסף 0.02 מ"ג של DNase לכל mL של 2% FCS 0.5% BSA/HBSS קולגן הפתרון.
   5. הכינו 13 מ ל של התמיסה לעכל את הפתרון לכל דגימת רקמת הכבד.
   6. הכינו את התמיסה הטרייה. בשביל כל בידוד

3. הדור של תא בודד השבולים

1. עיכול רקמת אדיפוז
   1. . ואחריו פריקה צווארי רסס את החזה עם 70% אתנול. בזהירות לעשות חתך מרכזי 5-6 ס מ דרך קיר הבטן העור לאורך כל החלק של כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הלב והלב.
      הערה: אין לפגוע באיברים הבסיסיים ולשמור על מספריים מטיפים.
   2. הכנס לפחות 10 מ ל של 0.9% תמיסת מלח בקודקוד החדר השמאלי באמצעות מחט G 26.
      הערה: הפרזיה מוצלחת מצוין על ידי שטיפת הכבד.
   3. פתחו את חלל הצפק עם מספריים וחתכו את משטחי השומן הפריגונאל בכל צד עם מספריים מעוגלים עדינים. מנתחים רקמות גונאדאל עם מספריים. מעוגלים ושוקלים רקמת שומן
   4. בצעו את הדיסוציאציה המכנית באמצעות מספריים וחותכים את רקמת השומן לחתיכות משובחות בצלחת פטרי ב -4 ° c. העבר רקמת האדיפוז ל 50 mL לצינורות צנטריפוגה ולשטוף צלחת פטרי עם 1 מ ל של 0.5% BSA/PBS.
   5. הוסיפו 3 מ ל של תמיסת אדיפוז (כמוכן בשלב 2.3) לכל גרם של רקמת השומן. מודטת התמיסה ברקמת השומן ב 37 ° c עבור 20 דקות תחת טלטול עדין (200 rpm).
   6. הוסף 5 מ ל של 0.5% BSA/PBS לגרם של הרקמה האדיפוז והמקום על הקרח. Triturate את הפתרון פעמים רבות עם הצינורות 10 mL סרולוגית ולהעביר אותו דרך מסננת (100 μm) בעזרת בוכנה.
   7. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
   8. הסירו את שבר האדיפוציט הצף באמצעות פילטף. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית (סטרומה שבר כלי דם) ב 1 מ ל של מאגר הליזה ACK (ראה טבלת חומרים). הוסף 10 מ ל 2% FCS הערוץ.
   9. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
   10. Decant סופר ומשהה מחדש את הגלולה בתא 250 μL של 2% FCS PBS.
   11. לספור את מספר התאים הפעילים על הטציטומטר באמצעות טריקון כחול הדרה.
2. עיכול רקמת הכבד
   1. לאגור כבד בצינורית צנטריפוגה. מלאה בPBS ובהובלה בקרח
   2. בצע את הדיסוציאציה המכנית באמצעות חותמות מזרק בצלחת פטרי ב -4 ° c. לשים רקמת הכבד בגזור 50 mL צנטריפוגה שפופרת המכיל 10 מ ל של פתרון לעכל הכבד החום. לשטוף את צלחת פטרי עם 3 מ ל של פתרון לעכל הכבד.
   3. הפתרון רקמות הכבד של העור ב 37 ° c עבור 20 דקות תחת טלטול עדין (200 rpm).
   4. הוסף 20 מ ל של HBSS. Triturate את הפתרון פעמים רבות עם הצינורות 10 mL סרולוגית ולהעביר אותו דרך מסננת (100 μm) בעזרת בוכנה.
   5. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. והשהה מחדש את הגלולה בתוך 20 מ ל של HBSS.
   6. צנטריפוגה ב 30 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את המטריצה hepatocyte. . מחק את הגלולה הסלולרית
   7. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-500 x g במשך 10 דקות ב -4 ° c. השהה מחדש את הגלולה ב-10 מ ל של 33% בצפיפות צמיגות נמוכה של מעבר הצבע (ראה טבלת חומרים) ב-HBSS ואחריו צנטריפוגה (800 x g; 30 דקות; טמפרטורת החדר; ללא בלימה).
   8. השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר הליזה ACK ו דגירה עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 10 מ ל של HBSS.
      הערה: כדי לבטל את הסופרנטנט מזהם את הסופרנטנט עם האינטרפציטים (hepatocytes) בזהירות רבה עם העברת הצנרת (ככל האפשר מבלי לקחת את הגלולה עם תאים חיסוניים אריתרופוציטים).
   9. להעביר תאים באמצעות מסננת 30 יקרומטר ב 15 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה החרוו צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. Decant סופר ומשהה מחדש את הגלולה בתא 250 μL של 2% FCS PBS.
   10. לספור את מספר התאים הפעילים על הטציטומטר באמצעות טריקון כחול הדרה.

4. צביעת פני השטח

1. הכן לערבב נוגדנים עבור T-cell-קבוצות משנה (פאנל 1) ותאים חיסוניים מולדים (פאנל 2) כפי שמתואר בטבלה 1 ובטבלה 2. אמצעי אחסון ממוטבים עבור מדגם אחד (100 μL) לגבי ריכוזי נוגדנים.
   הערה: לימפוציטים תאים חיסוניים מולדים להציג הבדלים באופן אוטומטי, יש לנתח בנפרד.
2. השתמש עד 3 x 10⁶ תאים ב 100 μl בצינור facs פוליסטירן לצביעת פני השטח. כדי לחסום קולטני Fc להוסיף 10 μL של anti-CD16/CD32 נוגדן (מדולל 1:100) ו דגירה עבור 10 דקות על הקרח. השתמש בדגימת בקרה שלילית שאינה מוכתמת כדי לכוונן את הפיזור הצדדי (הפיקוח העצמי) ופיזור העברה (FSC) כדי לקבוע את המיקום של אוכלוסיית התא השלילית.
3. ומערבולת ולהוסיף את הנפח המתאים של תערובת נוגדן פאנל 1 ו-פאנל 2. הוסף 1 μL של צבע הכדאיות לכל מדגם כדי לאפשר אפליה של תאים חיים ומתים. דגירה של 20 דקות ב 4 ° צ' ומוגן מפני אור.
4. שטוף פעמיים עם 2 מ ל של 2% FCS PBS ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
5. השהה מחדש את הגלולה בתא ב-300 μL של 2% FCS PBS ואחסן ב -4 ° c עד ניתוח של FACS.
   הערה: לפני התחלת המדידה לעבור תאים דרך 30 יקרומטר תא מסננת לתוך צינור facs ומערבולת. Cy, הזרמת שקעים בוצעה עם התאים המסומנים ב 2% FCS PBS ב 4 ° צ' עבור 1-3 h. יש לנתח תאים בהקדם האפשרי עבור תוצאות ממוטבות.

5. הזרמת הפיצויים, הרכישה והאיסוף

1. הפעל מדגם שלילי ללא ויטראז ' כדי להגדיר את FSC ו-אס אס ולהתאים את המתח של cytometer הזרימה כדי לזהות אוכלוסיות leucocyte כדי להבדיל בין פסולת תאים קיימא. לא לכלול פסולת ותאים מתים.
   הערה: הכדאיות של השחטות התאים מהכבד עשויה להיות נמוכה יותר מהכדאיות של השעיות התאים מרקמת השומן הפריגונאל עקב צעד נוסף של הפרדת הצפיפות.
2. הפעל דגימות בקרה ויטראז ' בודדות עבור פיצוי רב-צבעי.
   הערה: מחרוזות לכידת נוגדנים יכול לשמש גם כדי להתאים חפיפה ספקטרלי אם מספר התאים של אוכלוסיה באוכלוסייה של עניין הוא נמוך מדי כדי לפצות באמצעות תאים. כדי לזהות אותות בעלי קרינה אוטומטית אפשרית של התאים הפלואורסצנטית פחות אחד (FMO) בקרות עבור כל נוגדן מומלץ אך לא הוחלו בפרוטוקול זה.
3. הפעל את המדידה, לאסוף את המספר המתאים של אירועים (לפחות 50,000 אירועים) ולהקליט נתונים ניסיוניים.
4. יצא קבצי נתוני FCS לניתוח והגדר את אסטרטגיית הפעולה. שער על CD45⁺ leucocytes לזהות אוכלוסיות התאים הבאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול תיאר מאפשר את האפיון של סמנים פני השטח של תאים חיסוניים מולדים מסתגלת מבודדים מורטין perigonadal הרקמה והכבד במודל של המושרה דיאטה נאש. במודל זה, נאש המושרה על ידי מינהל של HFD פלוס סוכרוז (6%) במים לשתייה במשך 7 עד 15 שבועות בעכברים C57Bl/6J, כפי שדווח בעבר¹³. חשוב מכך, עכברים היו שו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Steatohepatitis יש קשר חזק עם חריגות מטבולית כגון השמנה, עמידות לאינסולין ו דיסליפידמיה¹⁵. מחקרים מרובים מצביעים על כך דלקת ברקמת אדיפוז יכול לנהוג בפתוגנזה של סוכרת סוג 2, כולל רמות שונות של תאים הן של המערכת החיסונית מולדת מסתגלת^4,5,16

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µm cell strainers	Falcon	352340
1 mL syringe	BD	309659
26 G x 5/8 needles	BD	305115
35 mm Petri Dishes	Falcon	353001
40 µm cell strainers	Falcon	352340
ACK lysis buffer	GIBCO	A1049201
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45	Biolegend	103127	AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127)
Analysis software	FlowJo 10.0.8 software
APC anti-mouse CD11c Antibody	Biolegend	117309	AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309)
APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody	Biolegend	138411	AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411)
BV421 anti-mouse CD127 Antibody	Biolegend	135023	AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023)
BV421 anti-mouse F4/80 Antibody	Biolegend	123131	AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131)
BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody	Biolegend	135219	AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219)
BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody	Biolegend	108739	AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739)
BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody	Biolegend	101239	AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239)
BV711 anti-mouse/human B220 Antibody	Biolegend	103255	AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255)
BV785 anti-mouse CD8a Antibody	Biolegend	100749	AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749)
C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old	Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2	Charité - Universitätsmedizin Berlin	A119.1
Collagenase NB 4G Proved Grade	SERVA	11427513
Collagenase Typ I	Worthington	LS004197
Conical centrifuge tube 15mL	Falcon	352096
Conical centrifuge tube 50 mL	Falcon	352070
DNAse	Sigma-Aldrich	4716728001
Fetal bovine serum	Biochrom	S0115
Filter 30µm	Celltrics	400422316
FITC anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100203	AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203)
Flow cytometry	BD-LSR Fortessa
Forceps	Sigma-Aldrich	F4142-1EA
HBSS	Bioanalytic GmBH	085021-0500
High-fat diet	SSNIF	E15741–34	60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates
micro dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146	used for dissection purposes
PE anti-mouse CD25 Antibody	Biolegend	101903	AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903)
PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody	Biolegend	104417	AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417)
PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody	Biolegend	107629	AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629)
PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100565	AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565)
Percoll solution	Biochrom	L6115
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody	Biolegend	103031	AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031)
PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody	Biolegend	108427	AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427)
Phosphate buffered saline	Gibco	12559069
Round-Bottom Tubes with cell strainer cap	STEMCELL Technologies	38030
TruStain fcX anti-mouse CD16/32	Biolegend	101301	AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301)
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T6146
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend	423105	viablity stain